新型冠状病毒S蛋白的核酸适配体与人源ACE2蛋白的核酸适配体的应用

摘要

本发明的新型冠状病毒S蛋白的核酸适配体与人源ACE2蛋白的核酸适配体的应用，提供结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白的S1亚基(简称为S1蛋白)的核酸适配体APT‑S，和结合人源ACE2蛋白的核酸适配体APT‑A，以及这些核酸适配体的用途。具体地，本发明的核酸适配体及其衍生物具有能够快速化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点，可以用于检测、诊断、成像以及治疗等方面应用。

权利要求

1.一种新型冠状病毒棘突蛋白S1亚基的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体为APT‑S，由以下序列之一组成：S‑1：atccagagtgacgcagcagtgctgcgtcactctggataatctctagaggatccccgggtggacacggtggcttagt；

S‑2：atccagagtgacgcagcactggacacggtggcttagtaatctctagaggatccccgggtggacacggtggcttagt。

2.一种人源ACE2蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体为APT‑A，由以下序列之一组成：A‑1：atccagagtgacgcagcaaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgctggacacggtggcttagt；

A‑2：atccagagtgacgcagcatctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgctggacacggtggcttagt。

3.权利要求1所述的核酸适配体在富集新型冠状病毒SARS‑CoV‑2中的非诊断目的的应用。

4.权利要求1所述的核酸适配体在制备新型冠状病毒SARS‑CoV‑2检测试剂中的应用。

5.权利要求2所述的核酸适配体在制备人源ACE2检测试剂中的应用。

6.权利要求1和2所述的核酸适配体在制备治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的肺炎药物中的应用。

说明书

新型冠状病毒S蛋白的核酸适配体与人源ACE2蛋白的核酸适

配体的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及新型冠状病毒S蛋白的核酸适配体与人源ACE2蛋白的核酸适配体的应用。

背景技术

[0002] 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS‑CoV‑2)是一种高度传染性的空气传播病原体，通过呼吸道飞沫在患者之间传播。由新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)引起的新冠肺炎患者表现为发热、乏力、干咳、鼻塞、流涕等症状，也会出现缺氧低氧状态。约半数患者在感染后出现呼吸困难，大多数感染者症状较轻且预后良好，严重者会快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，甚至最终导致死亡。SARS‑CoV‑2特别的传播方式导致其具有较高的感染与传播能力，进而使得新冠疫情的控制变得极其困难。这些特性与新冠病毒入侵细胞的分子机制密切相关。

[0003] 新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)纳米颗粒通常为球形(直径：125纳米)，表面有突起(尖峰)。其主要的结构蛋白有四种，分别是核衣壳蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)和棘突蛋白(S蛋白)。N蛋白是一种高度免疫原性蛋白，主要作用是参与病毒RNA的复制和病毒体的组合成形。M蛋白主要作用是维持病毒的结构和基本形状，并介导和协助病毒的装配和出芽增殖。E蛋白是一种小型膜结合蛋白，主要负责病毒的装配和出芽增殖等。而S蛋白是一种三聚体、高度糖基化的I类融合蛋白(含S1和S2两个亚基)，可以保护病毒，防止病毒被破坏，还能和细胞膜上的ACE2受体特异性结合，从而协助病毒轻松进入细胞内部并感染宿主。其中S1亚基的受体结合域(RBD)主要负责识别细胞的ACE2受体。S‑RBD与ACE2结合后，S1和S2亚基之间的相互作用减弱，使S2发生实质性的结构重排，最终使病毒与宿主细胞膜融合，将其遗传物质释放到细胞质中。

[0004] 从病毒的整个生命周期来看，病毒如何进入细胞是关键，特异性靶向阻断新型冠状病毒棘突蛋白S1蛋白与ACE2的结合将是预防和治疗新冠肺炎的有效策略。S1蛋白是新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染后引起宿主免疫系统产生中和性抗体的主要靶标，目前各国研究的抗体等药物大多数都是将S‑RBD蛋白作为靶点。以此同时ACE2受体蛋白也是新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染的关键，潜在的ACE2受体结合(保护)剂也有望成为新型冠状病毒感染的治疗药物。现有数据表明，新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染通常始于鼻腔，并逐渐扩散到下呼吸道，鼻腔或肺部注射病毒抑制剂可对感染部位产生直接和有效的治疗。此外，鼻腔和呼吸系统中活性抑制剂可以为医务人员、高风险工作从业人员和未接种疫苗者提供预防和保护的作用。

发明内容

[0005] 基于背景技术存在的技术问题，本发明首次同时针对新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基RBD区域以及人细胞膜上的ACE2受体，筛选并设计了中和新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的适配体APT‑S和保护人源ACE2蛋白的适配体APT‑A的双向阻断策略。通过鼻内给药或雾化直接进入呼吸系统对感染部位产生直接和有效的治疗以及预防作用。

[0006] 发明人使用新型的BLI‑SELEX技术，筛选得到了以高亲和力结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基的核酸适配体APT‑S和以高亲和力结合人源ACE2蛋白的核酸适配体APT‑A。具体的，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基的核酸适配体APT‑S和以高亲和力结合人源ACE2蛋白的核酸适配体APT‑A，并检测了筛选得到的适配体APT‑S与新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基的结合能力，以及适配体APT‑A与人源ACE2蛋白的结合能力。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用了以下的技术手段：

[0008] 一种结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白的S1亚基的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包含APT‑S，APT‑S包含以下序列或由以下序列组成：

[0009] S‑1：gtgctgcgtcactctggataatctctagaggatccccggg；

[0010] S‑2：ctggacacggtggcttagtaatctctagaggatccccggg。

[0011] 所述核酸适配体还包含APT‑A，APT‑A包含以下序列或由以下序列组成：

[0012] A‑1：aagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc；

[0013] A‑2：tctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgc。

[0014] 所述的核酸适配体在检测、富集新型冠状病毒SARS‑CoV‑2或人源ACE2中的应用。

[0015] 所述的核酸适配体在新型冠状病毒SARS‑CoV‑2或人源ACE2的纯化、成像、浓度检测中的应用。

[0016] 所述的核酸适配体在制备治疗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的肺炎药物中的应用。

[0017] 本发明获得的有益效果是：

[0018] 首次针对新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基和人源ACE2蛋白的结合过程进行双向阻断。筛选的新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基的核酸适配体APT‑S中和新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的同时，人源ACE2蛋白的核酸适配体APT‑A结合并保护ACE2蛋白。并且从分子及细胞水平检测这些适配体能高效并特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2棘突蛋白S1亚基蛋白RBD区域与ACE2受体相互作用。此外，理论上适配体药物可以通过鼻内给药或雾化直接进入呼吸系统，对感染部位产生直接和有效的治疗以及预防作用。最终，研发双向阻断适配体药物，阻断RBD‑ACE2受体相互作用，用以防止病毒感染人体，为临床预防和治疗新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染提供新的思路和科学依据。

附图说明

[0019] 图1为实施例2中每一轮筛选所得适配体文库的紫外吸光度曲线。

[0020] 图2为实施例3中BLI法测得的S‑1适配体与SARS‑CoV‑2S1蛋白亲和力测定曲线。

[0021] 图3为实施例3中BLI法测得的A‑1适配体与ACE2蛋白亲和力测定曲线。

[0022] 图4为实施例4中ITC法测得的S‑1适配体与SARS‑CoV‑2S1蛋白亲和力测定曲线。

[0023] 图5为实施例5中S‑1适配体与A‑1适配体特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2S1蛋白与ACE2受体相互作用的测定曲线。

[0024] 图6为实施例7中S‑1适配体特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2S1蛋白与ACE2受体相互作用的凝胶电泳图。

具体实施方式

[0025] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，以下的实施例便于更好地理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。

[0026] 以下实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。

[0027] 实施例1

[0028] 特异性结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基或人源ACE2蛋白的核酸适配体的筛选。

[0029] 1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物。

[0030] 1)随机单链DNA文库：

[0031] 5’‑atccagagtgacgcagca‑n40‑tggacacggtggcttagt‑3’

[0032] 其中，“N40”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。

[0033] 2)引物：

[0034] 引物1：5’‑atccagagtgacgcagca‑3’

[0035] 引物2：5’‑actaagccaccgtgtcca‑3’

[0036] 该引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。

[0037] 上述引物分别用TE缓冲液(10mM Tris‑HCl，1mM EDTA)配制成100μM的贮存液，于‑20℃保存备用。

[0038] 2、BLI‑SELEX法适配体筛选。

[0039] 基于BLI‑SELEX的适配体筛选是在BLI仪器 Red 96系统(FortéBio)上进行的，在动力学模式下使用96孔板。在将目标蛋白加载到HIS1K传感器上之前，将传感器在Octet仪器内的生物传感器托盘中浸泡10分钟，以获得最佳动力学。接下来的步骤是：

[0040] (Ⅰ)目标固定：使用新的HIS1K传感器在100nM目标蛋白(TE缓冲液，pH 8.0)中捕获含His标签的目标蛋白，从而实现蛋白固定化。

[0041] (Ⅱ)选择：将装载目标蛋白的HIS1K传感器暴露于单链DNA文库(100nM，TE缓冲液，pH 8.0)中。

[0042] (Ⅲ)从适配体文库中提取到的与目标蛋白结合的DNA，按结合亲和力依次解离到含有解离缓冲液且离子强度增加的不同微量滴定孔中。为了进一步丰富结合物群体(给定的适配体拷贝数可能较低)，该过程被重复了3次。将上述微量滴定孔中的DNA进行PCR扩增，之后在进行下一轮富集。最终经过8轮富集，收集富集后的适配体库。

[0043] 实施例2

[0044] 分析和鉴定筛选得到的核酸适配体。

[0045] 1、PCR

[0046] Premix Taq试剂、DNA、引物1、引物2以25:1:1:1的比例混合均匀，加灭菌水至溶液总量为50μl。基因扩增仪反应25个变性‑复性‑延伸循环。加入3M醋酸钠(pH 5.2)溶液和无水乙醇，充分混匀。12,000rpm 4℃离心15分钟。弃上清液，留白色沉淀。再加入70％乙醇，12,000rpm 4℃离心5分钟。弃上清液并干燥沉淀。最后用适量的灭菌水或TE Buffer溶解沉淀。

[0047] 2、TA克隆。

[0048] 在微量离心管中配制DNA连接液，16℃反应30分钟。取2μl DNA连接液配50μl感受态细胞，混匀并冰浴10min。加入200μl SOC培养基培养1小时。然后在含有X‑Gal、IPTG、Amp的LB‑琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

[0049] 挑选若干个菌落由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。再从测序结果分析得出若干条有价值的适配体并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0050] 实施例3

[0051] BLI法测所筛选的核酸适配体与新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基、人源ACE2蛋白的亲和力情况。

[0052] 样品溶液：取核酸适配体S‑1、S‑2、A‑1、A‑2粉末，分别用TE缓冲液稀释至浓度为100nM即可。

[0053] 使用BLI仪器 Red 96系统(FortéBio)，在动力学模式下使用96孔板。在将目标蛋白加载到SA传感器上之前，将传感器在生物传感器托盘中浸泡10分钟，以获得最佳动力学数据。接下来的步骤是：

[0054] (Ⅰ)固定DNA：使用新的SA传感器在100nM Biotin‑DNA(TE缓冲液，pH 8.0)中捕获含生物素标签的适配体，从而实现适配体固定化。

[0055] (Ⅱ)结合蛋白：将装载适配体DNA的SA传感器暴露于目标蛋白(100nM，TE缓冲液，pH 8.0)中，从而实现适配体对目标蛋白的捕获。

[0056] (Ⅲ)洗脱蛋白：将装载适配体DNA并结合目标蛋白的SA传感器暴露于TE缓冲液(pH 8.0)中，将与SA传感器上的适配体DNA结合的目标蛋白部分或全部洗脱下来。

[0057] 检测结果如图2和图3所示，图2为S‑1适配体与SARS‑CoV‑2S1蛋白的亲和力测定曲线，拟合得亲和力为KD＝0.02992nM；图3为A‑1适配体与ACE2蛋白的亲和力测定曲线，拟合得亲和力为KD＝0.8671nM。此外，同样测得S‑2适配体与SARS‑CoV‑2S1蛋白的亲和力为KD＝0.03487nM，A‑2适配体与ACE2蛋白的亲和力为KD＝1.4394nM。

[0058] 实施例4

[0059] 等温滴定量热法(ITC)法测所筛选的核酸适配体与新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白S1亚基的亲和力情况。

[0060] 使用VP‑ITC微量热量计仪器(MicroCal)进行亲和力测定。每次测量前，所有溶液脱气5分钟，以避免气泡。缓冲液为2.68mM KCl，1.46mM KH2PO4，137mM NaCl，8mM Na2HPO4●7H2O，2mM MgCl2，pH 7.4。在参比池中加入缓冲液，样品池中加入蛋白，适配体DNA通过注射器以相同体积分20次滴定到样品池中。利用Origin软件将滴定曲线与单位点结合模型进行拟合，得到焓值(ΔH)和缔合常数Ka。

[0061] 实施例5

[0062] BLI法测S‑1适配体与A‑1适配体合作、S‑1适配体与A‑2适配体合作的特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2S1蛋白与ACE2受体相互作用的能力。

[0063] 使用BLI仪器 Red 96系统(FortéBio)，动力学模式。在将目标蛋白加载到HIS1K传感器上之前，将传感器在Octet仪器内的生物传感器托盘中浸泡10分钟，以获得最佳动力学数据。接下来的步骤是：

[0064] (Ⅰ)固定S1蛋白：使用新的HIS1K传感器在100nM Biotin‑DNA(TE缓冲液，pH 8.0)中捕获含HIS标签的S1蛋白，从而实现S1蛋白固定化。

[0065] (Ⅱ)结合ACE2蛋白：将装载S1蛋白的HIS1K传感器暴露于成比例的ACE2蛋白、A‑1适配体(或A‑2适配体)、S‑1适配体(100nM，TE缓冲液，pH 8.0)的混合溶液中，从而实现S1蛋白对ACE2蛋白的捕获。

[0066] (Ⅲ)洗脱蛋白：将装载S1蛋白并结合ACE2蛋白的HIS1K传感器暴露于TE缓冲液(pH 8.0)中，将HIS1K传感器上的ACE2蛋白部分或全部洗脱下来。

[0067] 检测结果如图5所示，ACE2蛋白:S‑1适配体:A‑1适配体＝1:5:5可以完全阻断SARS‑CoV‑2‑S蛋白与ACE2受体的相互作用。而ACE2蛋白:S‑1适配体:A‑2适配体＝1:8:8也可以完全阻断SARS‑CoV‑2‑S蛋白与ACE2受体的相互作用

[0068] 实施例6

[0069] BLI法测S‑2适配体与A‑1适配体合作、S‑2适配体与A‑2适配体合作的特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2S1蛋白与ACE2受体相互作用的能力。

[0070] 使用BLI仪器 Red 96系统(FortéBio)的动力学模式，将传感器在Octet仪器内的生物传感器托盘中浸泡10分钟，以获得最佳动力学数据。接下来的步骤是：

[0071] (Ⅰ)固定S1蛋白：使用新的HIS1K传感器在100nM Biotin‑DNA(TE缓冲液，pH 8.0)中捕获含HIS标签的S1蛋白，从而实现S1蛋白固定化。

[0072] (Ⅱ)结合ACE2蛋白：将装载S1蛋白的HIS1K传感器暴露于成比例的ACE2蛋白、A‑1适配体(或A‑2适配体)、S‑2适配体(100nM，TE缓冲液，pH 8.0)的混合溶液中，从而实现S1蛋白对ACE2蛋白的捕获。

[0073] (Ⅲ)洗脱蛋白：将装载S1蛋白并结合ACE2蛋白的HIS1K传感器暴露于TE缓冲液(pH 8.0)中，将HIS1K传感器上的ACE2蛋白部分或全部洗脱下来。

[0074] 检测结果为，ACE2蛋白:S‑2适配体:A‑1适配体＝1:7:7可以完全阻断SARS‑CoV‑2‑S蛋白与ACE2受体的相互作用。而ACE2蛋白:S‑2适配体:A‑2适配体＝1:10:10才可以完全阻断SARS‑CoV‑2‑S蛋白与ACE2受体的相互作用。

[0075] 实施例7

[0076] 分子水平检测适配体对SARS‑CoV‑2S1蛋白与ACE2受体相互作用过程的阻断效果。

[0077] 基于蛋白质印迹法(Western blot，简称WB)检测适配体对SARS‑CoV‑2S1蛋白与ACE2受体相互作用过程的阻断效果。

[0078] 结合：将SARS‑CoV‑2S1蛋白与DNA孵育30min，再与ACE2、Ni‑NTA树脂混合孵育过夜。对照组则不加DNA。

[0079] 洗脱：用Bind Buffer+0.1％Triton离心洗涤3‑5次。去除多余蛋白及DNA。

[0080] 变性：加30μL dd H2O，10μL 5xSDS loading，煮沸10min。

[0081] 凝胶电泳：配10％SDS‑PAGE凝胶。加好Marker及实验样品，电泳至溴酚蓝即将跑出胶(或目标条带分离足够明显)。取出切胶。

[0082] 转模：使用湿式电印迹转膜。将NC膜用甲醇预湿。在加有转膜液的盘里放入转膜用的工具、凝胶、NC膜。将转膜的夹子打开，正确放置凝胶和NC膜。在转膜仪周围加入碎冰来降温，恒流转膜1小时。

[0083] 封闭：将膜取出用TBS缓冲液浸湿后，移至含有封闭液的容器中，室温下摇床上摇动封闭1小时。然后将NC膜从封闭液取出，用TBS洗膜3次。

[0084] 孵抗体：一抗孵育过夜，去除液体，加TBST摇床洗涤5次。二抗孵育2小时，去除液体，加TBST摇床洗涤5次。

[0085] 染色：将转膜纸放在白色底盘上，滴上染色液即可放入仪器内显色曝光。

[0086] 结果如图6所示，与DNA孵育的实验组中ACE2的条带明显变小，这表明适配体S‑1与SARS‑CoV‑2‑S1蛋白结合成功阻断了SARS‑CoV‑2S1与ACE2的结合。