ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用

摘要

本发明提供了ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用，属于疾病诊断及预后评级技术领域；ENO1基因启动子区甲基化位点如SEQ ID No.1所示，提取食管鳞癌和癌旁正常样本组织DNA，经亚硫酸氢盐修饰后采用飞行质谱法检测ENO1基因启动子区CpG位点的甲基化频率，同时采用免疫组化检测食管鳞癌和癌旁正常组织样本中ENO1蛋白的表达；研究发现食管鳞癌中ENO1基因启动子区低甲基化且ENO1蛋白高表达，且其低甲基化的患者预后不良，ENO1可促进食管癌细胞的糖酵解水平，促进其增殖并抑制凋亡；检测ENO1基因的甲基化水平用于食管鳞癌的早期诊断和预后评价的试剂。

权利要求

1.一种用于扩增ENO1基因启动子区甲基化位点的引物对在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物对为具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ENO1基因启动子区甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID No.1所示， 所述ENO1基因启动子区甲基化位点为CpG_9.10.11位点，所述CpG_9.10.11位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

3. 一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒，其特征在于，包括引物对，所述引物对为具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。

4.根据权利要求3所述的一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒，其特征在于，检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂为EZ‑96 DNA Methylation‑Gold™。

5.根据权利要求3所述的一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒，其特征在于，检测ENO1表达量的试剂为DNA Methylation‑Gold™。

说明书

ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评

估食管癌的试剂盒中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于疾病诊断及预后评级技术领域，具体涉及ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用。

背景技术

[0002] 食管癌（Esophageal carcinoma，EC）是全球致死相关癌症中居第六位的肿瘤。食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌中最常见的组织学亚型，特别是在东亚，非洲东部和南部高发。在中国，约 90％的食管癌患者都为食管鳞状细胞癌。中国的食管癌有明显的地域分布，在河南、河北、江苏、陕西、山西、福建等地居各肿瘤中的发病率居首位。尽管诊断和治疗方法有所改善，但由于早期淋巴结转移，食管鳞癌晚期患者的生存率仍然很低，其患者5年生存率仍较低。根据病因学和流行病学研究表明，食管癌的发生是多种因素共同发挥效应而导致的疾病。因此，当下寻找导致食管癌的致病因素和发病机制尤为重要。

[0003] 烯醇化酶 1（ENO1）作为糖酵解中的关键酶，可以催化 2‑磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸。ENO1除行使糖酵解中的催化功能外，还在许多转移性肿瘤中发挥重要作用。已有研究报道ENO1可以影响肿瘤细胞的增殖、细胞凋亡、侵袭和转移等生物学行为。例如，在结肠癌中，ENO1可以通过调节AMPK/mTOR通路促进结肠癌的增殖、侵袭和迁移能力。此外，沉默ENO1 的表达可通过抑制 PI3K/ Akt途径抑制神经胶质瘤细胞的生长，迁移和侵袭。在结直肠癌中，FBXW7通过蛋白酶体途径来促进ENO1的泛素化水平降解，以降低肿瘤的糖酵解水平，最终抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。另有研究报道ENO1高表达的患者总体生存率降低。

[0004] 食管癌的发生是由环境和遗传因素共同作用引起的。DNA甲基化是人类基因组的主要表观遗传形式。在大多数类型的癌症中，DNA甲基化通常存在异常。甲基化是基因组 DNA中胞嘧啶的共价修饰，主要发生在脊椎动物的CpG二核苷酸中，并且通常与长期转录抑制相关。通过检索相关文献，发现在食管癌中，P16、RASSF1A基因的启动子区域均存在高甲基化状态，高甲基化抑制基因的表达，从而促进癌症的发展。申请人前期研究发现，食管鳞癌组织中miR‑203和miR‑34a甲基化水平明显高于癌旁正常组织，且它们的高甲基化和表达水平具有显著相关性，经分析还发现其高甲基化水平与淋巴结转移显著相关，表明其高甲基化水平促进食管鳞癌的发展。还发现，PLCE1基因启动子区低甲基化调控其蛋白高表达，并通过NFκB通路和VEGF‑C/Bcl‑2的表达促进食管鳞癌细胞的血管生成和增殖。因此，探索食管癌中基因的甲基化对于ESCC的早期诊断，精确预后和个体化治疗具有重要意义。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明公开了一种ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用。

[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

[0007] 本发明的一个目的是提供ENO1基因启动子区甲基化位点，ENO1基因启动子区甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID No.1所示。

[0008] 进一步地，甲基化区域为ENO1基因转录起始点上游5094bp 5355bp处，包括22个~CpG位点；甲基化区域转录为RNA片段，经RNase A酶切得到12个CpG单位，经RNase A酶切得到的12个CpG单位分别为CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16、CpG_20、CpG_2.3、CpG_5.6.7.8、CpG_9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19 和CpG_21.22。其中CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16 和 CpG_20未检测到，成功检测剩余的CpG单位：CpG_2.3、CpG_5.6.7.8、CpG_
9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19和CpG_21.22。

[0009] 进一步地，CpG_9.10.11的甲基化频率作为诊断和诊断食管癌生存预后的生物标志物， CpG_9.10.11位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

[0010] 本发明的另一个目的是提供一种用于扩增ENO1基因启动子区甲基化位点的引物对，引物对为具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。

[0011] 本发明的另一个目的是提供所述引物对在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂盒中的应用。

[0012] 本发明的另一个目的是提供检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂盒中的应用；检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂为DNA Methylation‑Gold™。

[0013] 本发明还有一个目的是提供一种检测ENO1表达量的试剂在制备诊断和/或预后评价食管癌的试剂或试剂盒中的应用；检测ENO1表达量的试剂为EZ‑96 DNA Methylation‑Gold™。

[0014] 本发明的另一个目的是提供一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒，包括以上所述的引物对。

[0015] 本发明的另一个目的是提供一种定量检测所述的ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的方法，包括以下步骤：

[0016] 1）提取食管鳞癌组织样本的基因组DNA；

[0017] 2）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA；

[0018] 3）以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，用上述的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

[0019] 4）将PCR扩增产物依次进行虾碱性磷酸酶处理、转录和酶切反应、树脂纯化和甲基化质谱分析，得到样本的ENO1启动子区全部CpG位点甲基化水平。

[0020] 进一步地，PCR扩增反应的体系为：DNA模板2.0μL，浓度为10pmol/μL 的正向引物0.2μL，浓度为10 pmol/μL的反向引物0.2μL，浓度为5U/μL的PCR Enzyme 0.2μL，反应终浓度为200μM的dNTPs 1.0μL，反应终浓度为1×的 10×PCR Buffer 1.0μL，ddH2O补足体积至
10μL。

[0021] 进一步地，PCR扩增反应的程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环；72℃延伸3min。

[0022] 本发明的有益效果为：

[0023] 本发明提供的ENO1基因启动子区甲基化位点，甲基化区域如SEQ ID No.1所示。检测食管鳞癌组织中ENO1基因启动子区特定CpG位点呈低甲基化状态，而在癌旁正常组织细胞中，ENO1基因启动子区特定CpG位点呈相对高甲基化状态，表明该基因启动子区特定 CpG 位点的甲基化状态对食管鳞癌组织具有特异性，表明ENO1启动子区特定CpG位点的低甲基化状态可以作为食管癌的一个新的分子标记。因此，检测ENO1启动子区特定CpG位点的低甲基化状态可作为食管癌早期诊断、预后判断等的有力手段，而且操作简便、特异性好，具有深远的临床意义和推广价值。

[0024] 进一步的，本发明提供的ENO1基因启动子区甲基化位点中包含22个CpG位点，经裂解后为12个CpG单位，运用SPSS22.0软件对食管鳞癌及癌旁正常组织进行ENO1基因甲基化水平Mann‑Whitney U检验，进一步比较ENO1基因7个CpG单位在两组样本中的甲基化差异，筛选甲基化差异性CpG单位，结果显示ENO1基因2个CpG单位（CpG_9.10.11、CpG_17.18.19）在两组（食管鳞癌及癌旁正常组织）中甲基化分布均存在差异。同时采用Kaplan‑Meier生存分析比较食管鳞癌中ENO1基因甲基化状态与患者预后的关系，结果表明，CpG_9.10.11位点低甲基化的患者总体生存率较低（P=0.044），差异具有统计学意义，筛选CpG_9.10.11位点的甲基化频率作为筛查和诊断食管癌生存预后的生物标志物。

[0025] 本发明提供了一种检测ENO1表达量的试剂在制备诊断和/或预后评价食管癌的试剂或试剂盒中的应用。利用免疫组织化学方法检测检测食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常中ENO1 蛋白的表达情况，对食管鳞癌组织和癌旁正常组织中ENO1蛋白的免疫组化评分进行统计学分析，结果表明，ENO1蛋白在食管鳞癌中的表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义。通过沉默ENO1后，食管鳞癌细胞的乳酸生成、ATP产生、葡萄糖摄取的能力明显降低，食管鳞癌细胞的增殖能力明显减弱，同时管鳞癌细胞内凋亡相关蛋白Bax、Caspase 3表达明显升高。因此，以食管癌中ENO1基因作为检测标志物能够用于早期诊断和预后评估食管癌，具有首创性。

附图说明

[0026] 图1为MALDI‑TOF MS法甲基化检测原理图；

[0027] 图2为 ENO1基因启动子区43号引物扩增序列CpG位点图示；上图序列为正向序列，CpG位点用圆点表示；深色标记可以检测到的CpG位点，浅色标记因序列问题无法检测到的CpG位点；

[0028] 图3为ENO1基因PCR扩增产物（261bp）电泳图；

[0029] 图4为食管鳞癌和癌旁正常组织中ENO1基因启动子区平均甲基化水平比较；

[0030] 图5为食管鳞癌组织中ENO1基因启动子区CpG单位甲基化状态与患者预后之间的关系，其中，CpG_9.10.11（A），CpG_17.18.19（B）；

[0031] 图6为食管鳞癌组织和癌旁正常组织中ENO1蛋白免疫组化染色，A（200× ）、B（400×）分别为食管癌旁正常组织中ENO1染色，C（200× ）、D（400×）分别为食管鳞癌组织中ENO1染色；

[0032] 图7为食管鳞癌组织和癌旁正常组织中ENO1蛋白差异性表达分析；

[0033] 图8为ENO1蛋白免疫组化评分与甲基化水平进行相关性分析；

[0034] 图9为沉默ENO1后对食管鳞癌细胞的糖代谢水平的检测结果，沉默ENO1后，细胞[0035] 中乳酸生成（A）、葡萄糖的摄取（B）、ATP 生成（C）；

[0036] 图10为沉默ENO1后对食管鳞癌细胞的增殖能力的检测结果，在食管鳞癌细胞系Eca109（A）、EC9706（B）细胞中转染ENO1 siRNA后用CCK8实验检测细胞的增殖能力；

[0037] 图11为沉默ENO1后对食管鳞癌细胞的凋亡能力的检测结果，Eca109、EC9706的蛋白图（A），细胞中转染ENO1 siRNA后用检测相关分子Bax、Caspase3的统计图（B）。

具体实施方式

[0038] 下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0039] 本发明提供了ENO1基因启动子区甲基化位点，ENO1基因启动子区甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID No.1所示；

[0040] SEQ ID No.1：gacccagtggctaggtaatgattggggaagggctgagcaaCGggcaggCGgCGcagggcttttctgggcttgtggggctcttttccctcCGagggaggCGgCGCGccCGcaggcccagCGtggCGgggtCGggggcaCGtgcaagcCGcctccctgggtgggaactggCGccccCGctcacccCGaggccCGgggCGggggCGcaatgccaggCGcaCGtgctgggccccCGatttctttggaggggaaagtgcagatcaa。

[0041] 在本发明中，甲基化区域为ENO1基因转录起始位点上游5094bp 5355bp处，包括22~个CpG位点；甲基化区域转录为RNA片段，经RNase A酶切裂解得到12个CpG单位，其中CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16 和 CpG_20未检测到，成功检测剩余的CpG单位：CpG_2.3、CpG_
5.6.7.8、CpG_9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19和CpG_21.22。各CpG单位的具体核苷酸片段均为CG。

[0042] 对食管鳞癌及癌旁正常组织进行ENO1基因甲基化水平Mann‑Whitney U检验，CpG_17.18.19在两组（食管鳞癌及癌旁正常组织）中甲基化分布均存在差异。同时采用 Kaplan‑Meier生存分析比较食管鳞癌中ENO1基因甲基化状态与患者预后的关系，结果表明，CpG_
9.10.11位点低甲基化的患者总体生存率较低，差异具有统计学意义。因此，CpG_9.10.11位点的甲基化频率作为筛查和诊断食管癌生存预后的生物标志物。

[0043] 本发明提供了一种用于扩增ENO1基因启动子区甲基化位点的引物对，具有如SEQ ID No.2（5’‑aggaagagagGATTTAGTGGTTAGGTAATGATTGGG‑3）所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3（5’‑AAAACCTCCCCTTTCACATCTAATTAtcggaagagggatatcactcagcataatgac‑3’）所示的下游引物。

[0044] 本发明提供了检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂或所述引物对在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂盒中的应用。

[0045] 本发明提供了一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒，包括所述的引物对。

[0046] 本发明提供了一种定量检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化状态的方法，检测方法的原理如下：DNA样本中没有发生甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐的处理下全部转化为尿嘧啶（相当于DNA中的胸腺嘧啶）。对样本进行扩增，引物为特殊设计，扩增产物带有T7 RNA聚合酶启动子序列。利用T7 RNA聚合酶，在体外转录体系中将扩增产物转录为RNA片段；携带有CpG位点的小片段由RNA片段切割而成，利用RNase A能够特异性的识别并切割RNA中U 3’端的特性。产物检测使用Agena MassArray®飞行质谱分析系统。CpG和CpA之间相差的
16Da为同一片段中分子量仅有的差别，即质谱图中两者峰之间的差距。具体包括以下步骤：

[0047] 1）提取食管鳞癌组织样本的基因组DNA；

[0048] 2）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA；

[0049] 3）以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，用上述的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

[0050] 4）将PCR扩增产物依次进行虾碱性磷酸酶处理、转录和酶切反应、树脂纯化和甲基化质谱分析，得到样本的CpG单位数据。

[0051] 本发明提取食管鳞癌组织样本的基因组DNA。本发明对所述提取DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可。在本发明实施例中，用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取基因组DNA。

[0052] 提取基因组DNA后，本发明用亚硫酸氢盐处理基因组DNA。优选使用EZ‑96 DNA Methylation‑GoldTM Kit进行亚硫酸氢盐修饰。得到DNA立即使用或‑20℃保存备用。

[0053] 本发明以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，用所述的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。

[0054] 在本发明中，PCR扩增反应的体系优选为：DNA模板2.0μL，浓度为10pmol/μL的正向引物0.2μL，浓度为10pmol/μL的反向引物0.2μL，浓度为5U/μL的 PCR Enzyme 0.2uL，反应终浓度为200μM的dNTPs 1.0μL，反应终浓度为1×的10×PCR Buffer 1.0μL，ddH2O补足体积至10μL。PCR扩增反应的程序优选为：94℃预变性4min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环；72℃延伸3min。

[0055] 得到PCR扩增产物后，本发明将PCR扩增产物依次进行虾碱性磷酸酶处理、转录和酶切反应、树脂纯化和甲基化质谱分析，得到样本的ENO1启动子区全部CpG位点甲基化水平。

[0056] 经分析发现，食管鳞癌组织中ENO1基因启动子区平均甲基化水平（0.0572±0.02522）低于癌旁正常组织（0.0732±0.03258），且差异具有统计学意义（Z=‑3.199, P=
0.001）。比较ENO1基因7个CpG单位在两组样本中的甲基化差异，筛选甲基化差异性CpG单位。结果显示ENO1基因2个CpG单位（CpG_9.10.11、CpG_17.18.19）在两组中甲基化分布均存在差异（P<0.05）。CpG单位在性别间的平均甲基化率及Mann‑Whitney U检验比较结果表明，CpG_14.15单位甲基化率在不同肿瘤分化程度间具有统计学差异，平均甲基化水平女性<男性。CpG单位甲基化水平与患者年龄相关性分析结果表明，CpG_13单位甲基化水平与患者年龄呈明显负相关关系。各CpG单位在淋巴结转移（有淋巴结转移/无淋巴结转移）两组的平均甲基化率及Mann‑Whitney U检验比较结果显示，CpG_13单位存在统计学差异，且平均甲基化水平有淋巴结转移组<无淋巴结转移组。对食管鳞癌和癌旁正常组织样本中的CpG单位与肿瘤的分化程度、TNM分期比较，甲基化率均没有差异。CpG_9.10.11位点低甲基化的患者总体生存率较低（P=0.044），差异具有统计学意义，筛选 CpG_9.10.11位点的甲基化频率作为筛查和诊断食管癌生存预后的生物标志物。

[0057] 本发明还提供了一种检测ENO1表达量的试剂在制备诊断和/或预后评价食管癌的试剂或试剂盒中的应用。利用免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织和癌旁正常组织中ENO1蛋白的表达情况，ENO1蛋白主要表达于食管鳞癌细胞中的胞浆和胞膜，少量表达于胞核。ENO1蛋白在食管鳞癌中的表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义。将ENO1蛋白免疫组化评分与甲基化水平进行相关性分析，ENO1蛋白表达与甲基化水平呈明显负相关。
沉默ENO1后，对食管鳞癌细胞的乳酸生成、ATP产生、葡萄糖摄取的能力明显降低，食管鳞癌细胞的增殖能力明显减弱，同时管鳞癌细胞内凋亡相关蛋白Bax、Caspase 3表达明显升高。
因此，以食管癌中ENO1基因作为检测标志物能够用于早期诊断和预后评估食管癌。

[0058] 下面结合实施例对本发明提供的一种ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0059] 原料及试剂来源说明

[0060] 石蜡组织DNA提取试剂盒购自凯杰试剂盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit）；亚硫酸氢盐及纯化试剂盒（EZ‑96 DNA Methylation‑Gold™ Kit）。

[0061] 免疫组织化学方法，参考王光辉2013年Identification of MXRA5 as a novel tissue biomarker for colorectal cancer progression。

[0062] 所用作图软件为SPSS 22.0、GraphPad prism 5。

[0063]  本发明的实施例中所用到的试剂见表1，主要实验仪器与耗材见表2，实验所用配制试剂的见表3。

[0064] 表1 实验试剂

[0065]

[0066] 表2 实验仪器和耗材

[0067]

[0068] 表3 试剂配制

[0069]

[0070] 实施例1

[0071] 食管鳞状细胞癌组织中ENO1基因的甲基化改变及其临床病理学意义

[0072] 1、DNA的制备：选取68例食管鳞癌患者肿瘤组织及其对应的62例癌旁正常组织，福尔马林固定、石蜡包埋。其中癌旁正常组织均为食管正常组织蜡块并选自距食管鳞癌组织2cm以上部位的样本。应用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit分别提取基因组DNA，紫外分光光度仪测定吸光度值确定其含量及纯度，凝胶电泳确保提取的DNA质量。

[0073] 2、亚硫酸氢盐处理：使用EZ‑96DNA Methylation‑Gold™ Kit进行亚硫酸氢盐修饰。得到DNA立即使用或‑20℃保存备用。

[0074] 3、PCR扩增反应：设计ENO1基因启动子区扩增片段的引物。扩增片段如图2，引物序列如表4。

[0075] 表4 ENO1基因甲基化检测PCR扩增反应引物序列

[0076]

[0077] 反应体系如表5：

[0078] 表5 ENO1基因甲基化检测PCR扩增反应反应体系

[0079]

[0080] 反应条件如表6：

[0081] 表6 ENO1基因甲基化检测PCR扩增反应反应条件

[0082]

[0083] 操作步骤：

[0084] （1）按上述反应体系配制PCR反应溶液（反应体系配制过程应在冰上完成，防止高温中长时间暴露而失活）；

[0085] （2）将微孔板用板式封口膜封闭，微孔板3000xg离心1分钟，按照上述反应条件用PCR仪孵育微孔板中样本；

[0086] （3）取PCR产物3μL与1μL 6×loading buffer混匀，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，160V、20min后观察结果，如结果良好可继续后续实验（图 3）。

[0087] 虾碱性磷酸酶处理PCR扩增产物（SAP）：

[0088] 反应体系如表7：

[0089] 表7 ENO1基因甲基化检测SAP反应组分反应体系

[0090]

[0091] 反应条件如表8：

[0092] 表8 ENO1基因甲基化检测SAP反应组分反应条件

[0093]

[0094] 操作步骤：

[0095] （1）在384反应板的每个孔中加入10μL SAP反应液，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象；

[0096] （2）混匀板并3000xg离心微孔板1分钟；离心后按照上述反应条件进行后续程序。

[0097] T切/RNase A消化反应；

[0098] T切/RNase A消化反应反应体系如表9：

[0099] 表9 T切/RNase A消化反应反应体系

[0100]

[0101] 反应条件：37℃孵育 3h，4 ℃存储。

[0102] 操作步骤：

[0103] （1）按上述反应体系配制混合液；

[0104] （2）取 2μL PCR产物和5μL T转录/RNaseA混合物至新的384孔板；

[0105] （3）盖上封板膜，3000 g离心微孔板1分钟；

[0106] （4）按上面反应条件在PCR仪中孵育微孔板中样本。

[0107] MALDI‑TOF‑MS 甲基化质谱结果分析：

[0108] 本研究中ENO1基因启动中包含22个CpG位点，T裂解后为12个CpG单位（其中CpG单位CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16 和 CpG_20不能被覆盖，不可分析），实际包含7个CpG 单位，17个CpG位点（见图 1）。本实验130例样本中研究所分析的CpG单位总数为901个。

[0109] 以每例样本所检测到的启动子区全部CpG位点甲基化水平的均值表示该例样本启动子区的整体甲基化水平。对食管鳞癌和癌旁正常组织中各样本ENO1基因启动子整体甲基化水平进行Mann‑Whitney U检验，食管鳞癌组织中ENO1基因启动子区平均甲基化水平（0.0572±0.02522）低于癌旁正常组织（0.0732±0.03258），且差异具有统计学意义（Z=‑3.199，P=0.001）（图4）。

[0110] 运用SPSS22.0软件对食管鳞癌及癌旁正常组织进行ENO1基因甲基化水平Mann‑Whitney U检验，进一步比较ENO1基因7个CpG单位在两组样本中的甲基化差异，筛选甲基化差异性CpG单位。结果显示ENO1基因2个CpG单位（CpG_9.10.11、CpG_17.18.19）在两组中甲基化分布均存在差异（P<0.05），见表10。

[0111] 表10 食管鳞癌和癌旁正常组织中ENO1各CpG位点甲基化率比较

[0112]

[0113] 注：ESCC表示食管鳞状细胞癌，Normal表示癌旁正常组织。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

[0114] 对食管鳞癌和癌旁正常组织样本中各CpG单位甲基化水平与患者性别之间进行统计学分析比较。CpG单位在性别间的平均甲基化率及Mann‑Whitney U检验比较结果如表11所示，CpG_14.15单位甲基化率在不同肿瘤分化程度间具有统计学差异，平均甲基化水平女性<男性（0.0340±0.0049 VS 0.0586±0.0281，Z=‑3.350，P=0.001）。

[0115] 表11 性别间ENO1基因甲基化状态比较

[0116]

[0117] 注 ：N 表示被分析CpG单位个数，表示平均甲基化率，S表示标准差。*表示P<0.05。P<0.05有统计学意义。

[0118] 对食管鳞癌和癌旁正常组织样本中各CpG单位甲基化水平与患者年龄之间的相关性进行统计学分析比较。CpG单位甲基化水平与患者年龄相关性分析结果如表12所示，CpG_13单位甲基化水平与患者年龄呈明显负相关关系（r=‑0.315，P=0.009）。

[0119] 表12 ENO1基因甲基化状态与年龄相关性

[0120]

[0121] 注：N表示被分析CpG单位个数，表示平均甲基化率，S表示标准差。*表示P<0.05。P<0.05有统计学意义。

[0122] 对食管鳞癌和癌旁正常组织样本各CpG单位与淋巴结是否转移之间进行统计学分析比较。各CpG单位在淋巴结转移（有淋巴结转移/无淋巴结转移）两组的平均甲基化率及 Mann‑Whitney U检验比较结果如表13所示，CpG_13单位存在统计学差异，且平均甲基化水平有淋巴结转移组<无淋巴结转移组（0.0400±0.0337 VS 0.0922±0.0535，Z=‑2.055，P=0.040）。

[0123] 表13 淋巴结转移组间ENO1甲基化状态比较

[0124]

[0125] 注：N表示被分析CpG单位个数，表示平均甲基化率，S表示标准差。*表示P<0.05。P<0.05有统计学意义。

[0126] 对食管鳞癌和癌旁正常组织样本中的CpG单位与肿瘤的分化程度、TNM分期比较，甲基化率均没有差异（P>0.05）。

[0127] 采用Kaplan‑Meier生存分析比较食管鳞癌中ENO1基因甲基化状态与患者预后的关系，结果如图5所示，CpG_9.10.11单位低甲基化水平的患者其生存预后差（P=0.044），但是CpG_17.18.19单位低甲基化水平的患者有预后差的趋势；CpG_9.10.11位点低甲基化的患者总体生存率较低（P=0.044），差异具有统计学意义，筛选 CpG_9.10.11位点的甲基化频率作为筛查和诊断食管癌生存预后的生物标志物。

[0128] 实施例2

[0129] 食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常中ENO1蛋白的表达情况。

[0130] 免疫组织化学方法检测273例食管鳞癌组织和263例癌旁正常组织中ENO1蛋白的表达。

[0131] 取制备好的食管癌组织芯片蜡块进行4μm连续切片，组织芯片的免疫组化方法同常规方法相同。本实验采用免疫组化Envision二步法，具体步骤如下：

[0132] （1）实验前将准备好的4μm白片放入切片盒中并保存于4℃冰箱内，以备后续实验使用；

[0133] （2）实验前将4℃冰箱存放的组织芯片的白片插入金属提篮置于60℃烘箱烘烤1.5‑2小时，以防止组织掉片；

[0134] （3）将60℃烘箱中烘好的石蜡组织切片依次放入二甲苯Ⅰ溶液、二甲苯Ⅱ溶液、二甲苯Ⅲ溶液缸中，进行组织脱蜡过程，脱蜡完成后，将切片再依次放入无水乙醇溶液、90%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、70%的乙醇溶液的中，目的是洗脱掉石蜡组织白片上的二甲苯，每个溶液缸中切片浸泡的时间均为5分钟，自来水冲洗3遍后置于自来水中，防止干片；

[0135] （4）取修复盒一个，将配置好的枸橼酸缓冲溶液（pH值6.0）230ml倒入修复盒中，用微波炉高火加热液体至100℃，加热3分钟，将切片置于沸腾的修复液液面以下，置入高压锅中，打开电源后加到1000w加热，待高压锅阀门喷气后，将功率从1000w调至800w，并高压修复8min，时间结束待高压锅放气完成，取出修复盒，室温冷却，直到枸橼酸缓冲溶液的温度降至40℃左右即可，并用清水浸洗3遍；

[0136] （5）用30%的H2O2配置3ml H2O2溶液，将切片放入中，用来阻断内源性过氧化物酶活性，常温避光孵育10min，用清水浸洗3遍；

[0137] （6）将切片放入盛有PBS的洗涤缸中，放于水平震荡仪上震洗，震洗三次，每次5分钟，每次都更换新的PBS液体；

[0138] （7）提前用BSA粉末配置5%的胎牛血清封闭液，将切片从洗涤缸中取出，放置于湿盒上，用吸水纸吸除多余的PBS液，每张切片滴加提前配置好的5%胎牛血清封闭液200μL左右，将湿盒水平放置于37℃恒温孵育箱中孵育半个小时。

[0139] （8）取出湿盒置于室温条件下，逐张切片擦去多余的胎牛血清封闭液，每张切片滴加事先配置好的一抗各200μL（阴性对照组以PBS代替一抗），水平放入湿盒中，放于4℃冰箱保存过夜；

[0140] （9）次日，将盛有切片的湿盒从4℃冰箱中取出，放于孵育箱中复温30分钟；

[0141] （10）重复步骤（6）；

[0142] （11）吸水纸擦除多余的PBS液，每张切片滴加二抗150μL，用牙签轻轻涂抹液面，使二抗均匀覆盖组织，置孵育箱半小时；

[0143] （12）重复步骤（6）；

[0144] （13）提前配置DAB显色试剂，B液：C液=1:100（v/v），配好用置于4℃冰箱备用；

[0145] （14）将切片擦干置于湿盒上，擦除多余的PBS液体，每张切片上滴加100uL左右的DAB显色试剂，置于显微镜下观察组织着色强度以及着色部位，根据着色强度来控制显色时间；

[0146] （15）达到显色最佳效果后，置于常温水中来终止显色并记录显色时间；

[0147] （16）待切片全部显色结束后，将切片依次置于苏木素溶液复染30s，酸酒精中酸化3‑5秒，冲洗5遍，自来水返蓝5min；

[0148] （17）将白片分别于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇缸中放置5分钟（此步骤目的为脱蜡，若想脱蜡想过更好，可延长至10分钟），随后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ，切片每个溶液缸中放置5min（此步骤目的为脱酒精），将切片脱水至透明；

[0149] 待切片晾干后，用中性树胶盖玻片封片后显微镜下观察。

[0150] 结果分析：用Olympus光学显微镜在200倍放大倍数下，采用双评分半定量法评分：<5％细胞阳性为0分；6%‑25％细胞阳性为1分；26％‑50％细胞阳性为2分；51％‑75％细胞阳性为3分；>75％细胞阳性为4分。着色强度按细胞显色的有无及深浅评分：细胞无显色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。然后结合阳性细胞百分比及着色强度相乘分级，所得分数为0‑1分时，分级为（‑）；2‑4分为（+）；5‑8为（++）；9‑12分为（+++）。其中‑为阴性；+为弱阳性；++/+++为强阳性。范围是0～12。

[0151] 如图 6 所示，ENO1蛋白主要表达于食管鳞癌细胞中的胞浆和胞膜，少量表达于胞核。

[0152] 对食管鳞癌组织和癌旁正常组织中ENO1蛋白的免疫组化评分进行统计学分析，独立样本 t检验分析结果如图7所示，ENO1蛋白在食管鳞癌中的表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义。

[0153] 将ENO1蛋白免疫组化评分与甲基化水平进行相关性分析，结果如图8所示，ENO1蛋白表达与甲基化水平呈明显负相关。

[0154] 运用ENO1特异性siRNA（5'‑GCAUUGGAGCAGAGGUUUAdTdT‑3'，SEQ ID No.4）沉默ENO1后对食管鳞癌细胞的糖代谢水平进行检测，如图9所示，沉默ENO1后食管鳞癌细胞的乳酸生成、AT P产生、葡萄糖摄取的能力明显降低。

[0155] 沉默ENO1后对食管鳞癌细胞的增殖能力进行检测，结果如图10所示，沉默ENO1后细胞的增殖能力明显减弱。

[0156] 沉默ENO1后对食管鳞癌细胞的凋亡能力进行检测，结果如图11所示，沉默ENO1后凋亡相关蛋白Bax、Caspase 3表达明显升高。在食管鳞癌细胞系Eca109、EC9706细胞中转染ENO1 siRNA后用Western blot实验检测凋亡相关分子Bax、Caspase3的表达：沉默 ENO1后Bax、Caspase3表达明显升高。

[0157] 需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。