己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法

摘要

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法。对于以1,3‑溴氯丙烷为起始物料合成己酮可可碱中间体5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑4H‑吡喃中潜在的卤代烷烃类基因毒性杂质3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的检测，本发明提供的气相色谱‑质谱联用检测方法，检测灵敏度高、检测限低，检测时间短，显著提高了检测的工作效率，而且检测结果准确、可靠，线性关系良好，同时具有良好的精密度和耐用性，能够监控己酮可可碱中间体的质量稳定性，进而为己酮可可碱的临床用药安全性提供了保证和依据。

权利要求

1.己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：用有机溶剂配制待测溶液，采用气相色谱‑质谱联用法进行己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质的检测；所述己酮可可碱中间体为5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑

4H‑吡喃，所述卤代烷烃类基因毒性杂质包括3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷；

所述气相色谱法的色谱条件包括：气相色谱的升温程序为：起始温度37 43℃，维持~

3min，以9.5 10.5℃/min的速率升温至127 133℃，再以24.5 25.5℃/min的速率升温至177~ ~ ~

183℃，毛细管色谱柱的固定液为6wt% 氰丙基苯基‑ 94wt% 聚二甲基硅氧烷；

~

所述质谱的条件包括：采用三重四级杆串联质谱仪检测，四级杆温度150℃；采用EI离子源，离子源温度200 300℃。

~

2.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述待测溶液包括对照品溶液，所述对照品溶液中所述3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的浓度均为25.00 200.00ng/ml。

~

3.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样方式为分流进样，分流比为10：1。

4.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：毛细管色谱柱的柱长为15 75m，内径为0.15~ ~

0.53mm，固定相涂层液膜厚度为0.84 3.0μm。

~

5.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：采用氦气为载气，所述载气的流速为0.9~

1.1mL/min。

6.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样口温度为217 223℃；进样量为0.9 1.1μ~ ~L。

7.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：离子检测方式为多反应检测模式。

8.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：

3‑氯丙烯的定量离子为76＞41，定量离子碰撞能为6 eV，定性离子为41＞39，定性离子碰撞能为12 eV；

3‑溴丙烯的定量离子为120＞41，定量离子碰撞能为4 eV，定性离子为41＞39，定性离子碰撞能为12 eV；

1‑溴丙烷的定量离子为124＞43，定量离子碰撞能为2 eV，定性离子为43＞39，定性离子碰撞能为6 eV。

9.如权利要求1所述的己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：电离能量为70eV。

说明书

己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学领域，尤其涉及己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法。

背景技术

[0002] 己酮可可碱为二甲基黄嘌呤类衍生物，可降低血液粘稠度，从而改善血液的流动性，促进缺血组织微循环，增加特殊器官的供氧。己酮可可碱通过抑制磷酸二酯酶，升高细胞内三磷酸腺苷，从而改善红细胞的变形能力，而且还能降低纤维蛋白原，抑制红细胞以及血小板的聚集。其主要适用于脑部血液循环障碍如暂时性脑缺血发作、脑卒中后遗症、脑缺血引起的脑功能障碍，保护心脑血管，具有改善慢性心力衰竭及特发性扩张性心肌病患者心功能的作用，以及适用于外周血液循环障碍性疾病如血栓闭塞性脉管炎等。

[0003] 5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑4H‑吡喃为己酮可可碱中间体物质，1,3‑溴氯丙烷是合成5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑4H‑吡喃的起始物料，而3‑氯丙烯、3‑溴丙烯、1‑溴丙烷是1,3‑溴氯丙烷的杂质物质，且这三种化合物均含有基因毒性警示结构。按照ICH M7指导原则， 3‑氯丙烯、3‑溴丙烯、1‑溴丙烷的可接受限度=TTC(μg/天)×1000/MDD(mg/天)=1.5μg/天×1000/1200mg/天=1.25ppm(ng/mg)，其中TTC表示毒理学关注阈值，MDD表示最大每日剂量。

[0004] 常规气相色谱检测方法的灵敏度不能满足己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质（3‑氯丙烯、3‑溴丙烯、1‑溴丙烷）的检测要求，建立一种能够准确可靠检测3‑氯丙烯、3‑溴丙烯、1‑溴丙烷的检测方法存在技术难度。目前，尚未发现有能够满足该要求的检测方法。

发明内容

[0005] 针对目前没有己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，本发明提供一种己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，能够监控己酮可可碱中间体5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑4H‑吡喃的质量稳定性，从而为己酮可可碱的临床用药安全性提供了保证。

[0006] 为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

[0007] 己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，具体包括以下步骤：用有机溶剂配制待测溶液，采用气相色谱‑质谱联用法进行己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质的检测；所述己酮可可碱中间体为5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑4H‑吡喃，所述卤代烷烃类基因毒性杂质包括3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷；

[0008] 所述气相色谱法的色谱条件包括：气相色谱的升温程序为：起始温度37 43℃，维~持3min，以9.5 10.5℃/min的速率升温至127 133℃，再以24.5 25.5℃/min的速率升温至~ ~ ~
177 183℃；
~

[0009] 所述质谱的条件包括：采用三重四级杆串联质谱仪检测，四级杆温度150℃；采用EI离子源，离子源温度200 300℃。~

[0010] 优选地，所述有机溶剂为甲醇、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种，更优选为甲醇。

[0011] 本发明提供的一种己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，具有以下优势：

[0012] 对于以1,3‑溴氯丙烷为起始物料合成己酮可可碱中间体5,6‑二氢‑3‑乙氧羰基‑2‑甲基‑4H‑吡喃中潜在的卤代烷烃类基因毒性杂质3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的检测，本发明提供的气相色谱‑质谱联用检测方法，检测灵敏度高、检测限低，检测时间短，显著提高了检测的工作效率，而且检测结果准确、可靠，线性关系良好，同时具有良好的精密度和耐用性，能够监控己酮可可碱中间体的质量稳定性，进而为己酮可可碱的临床用药安全性提供了保证和依据。

[0013] 优选地，所述待测溶液包括对照品溶液，所述对照品溶液中所述3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的浓度均为25.00 200.00ng/ml。~

[0014] 优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：后运行温度为280℃，维持7 9min；进样~口温度为220℃；传输线温度为280℃；

[0015] 优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样方式为分流进样，分流比为10：1。

[0016] 优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：毛细管色谱柱的柱长为15 75m，内径为~0.15 0.53mm，固定相涂层液膜厚度为0.84 3.0μm。
~ ~

[0017] 更优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：毛细管色谱柱的柱长为60m，内径为0.25mm，固定相涂层液膜厚度为1.4μm。

[0018] 优选地，所述毛细管色谱柱的固定液为6wt%氰丙基苯基‑94wt%聚二甲基硅氧烷。

[0019] 优选地，所述毛细管色谱柱的型号为安捷伦 VF‑624ms。

[0020] 优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：采用氦气为载气，所述载气的流速为0.9 1.1mL/min。
~

[0021] 优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样口温度为217 223℃；进样量为0.9~1.1μL。
~

[0022] 优选地，所述质谱条件还包括：离子检测方式为多反应检测模式。

[0023] 优选地，所述质谱条件还包括：

[0024] 3‑氯丙烯的定量离子为76＞41，定量离子碰撞能为6 eV，定性离子为41＞39，定性离子碰撞能为12 eV；

[0025] 3‑溴丙烯的定量离子为120＞41，定量离子碰撞能为4 eV，定性离子为41＞39，定性离子碰撞能为12 eV；

[0026] 1‑溴丙烷的定量离子为124＞43，定量离子碰撞能为2 eV，定性离子为43＞39，定性离子碰撞能为6 eV。

[0027] 优选地，所述质谱条件还包括：电离能量为70eV。

附图说明

[0028] 图1为实施例1提供的空白溶剂（甲醇）的色谱图；

[0029] 图2为实施例1提供的对照品溶液的色谱图；

[0030] 图3为实施例1提供的供试品溶液的色谱图；

[0031] 图4为实施例1提供的供试品与对照品的混合溶液的色谱图。

具体实施方式

[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0033] 实施例1：

[0034] 己酮可可碱中间体中卤代烷烃类基因毒性杂质的检测方法，具体包括以下步骤：

[0035] 1.1溶液配制

[0036] 精密称取供试品1g，置于10mL容量瓶，加入甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1ml中含10mg供试品的溶液，作为供试品溶液；

[0037] 分别精密适量3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷，用甲醇分别溶解并稀释、混合制成每1ml中约含3‑氯丙烯5000.00ng、3‑溴丙烯5000.00ng、1‑溴丙烷5000.00ng的混合溶液，作为对照品贮备液；

[0038] 取对照品贮备液适量，用甲醇稀释，制成每1mL中约含3‑氯丙烯125.00ng、3‑溴丙烯125.00ng、1‑溴丙烷125.00ng的混合溶液，作为对照品溶液；

[0039] 精密称取供试品1g，置于10mL容量瓶，加入对照品贮备液0.25mL，加甲醇溶解、稀释至刻度，作为供试品与对照品的混合溶液。

[0040] 1.2 己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质检测方法

[0041] 用气相色谱‑质谱联用法对上述溶液进行检测，其中，色谱条件为：色谱柱型号：安捷伦 VF‑624ms；色谱柱规格：60m*0.25mm*1.4μm；进样口温度：220℃；载气：氦气（纯度为99.999%），流速为1 mL/min；分流比：10:1；进样体积：1μL；升温程序：起始温度40℃，维持
3min ，以10℃/min的速率升温至130℃，再以25℃/min的速率升温至180℃；运行温度为280℃，维持8min；进样口温度为220℃；传输线温度：280℃。

[0042] 质谱条件为：采用三重四级杆串联质谱仪检测，四级杆温度150℃；采用EI离子源，离子源温度250℃；电离能量为70eV；离子检测方式为多反应检测模式；3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的质谱参数见表1。

[0043] 表1

[0044]名称 定量离子 碰撞能（eV) 定性离子 碰撞能（eV)
3‑氯丙烯 76>41 6 41>39 12
3‑溴丙烯 120>41 4 41>39 12
1‑溴丙烷 124>43 2 43>41 6

[0045] 1.3将上述己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质的气相色谱和质谱条件进行方法学验证：

[0046] （1）专属性考察

[0047] 取空白溶剂甲醇、供试品溶液、对照品溶液和供试品与对照品的混合溶液按照1.2中的检测条件进行检测，检测结果见表2，色谱图见附图1 4，空白溶剂色谱图见附图1，对照~品溶液的色谱图见附图2，供试品溶液的色谱图见附图3，供试品与对照品的混合溶液见附图4。

[0048] 表2专属性测试结果

[0049]

[0050] 从上述结果和附图可知，空白溶剂及供试品溶液对各杂质检测无干扰，表明本发明提供的气相色谱‑质谱联用法专属性良好。

[0051] （2）检测限和定量限考察

[0052] 分别精密称取己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的对照品适量，然后分别用甲醇逐级定量稀释，并按照1.2中的检测条件进行检测，按信噪比约为10:1时的分析物浓度设为定量限浓度，在此浓度下连续进样6针；按信噪比约为3:1时的分析物浓度设为检测限浓度，具体检测结果见下表3和4。

[0053] 表3定量限和检测限试验结果

[0054]

[0055] 从表中数据可知本发明提供的检测方法检测己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质3‑氯丙烯、3‑溴丙烯和1‑溴丙烷的检测限和定量限低，说明本发明检测方法对以上三种卤代烷烃类基因毒性杂质的检测具有高灵敏度的特点。

[0056] 表4定量限重复性试验结果

[0057]

[0058] 从表中数据可知本发明提供的检测方法测定的上述三种卤代烷烃类基因毒性杂质的相对标准偏差（RSD）范围为3.51 6.39%之间，显示定量限具有良好的重复性。~

[0059] （3）线性考察

[0060] 取对照品贮备液，用甲醇稀释，在约25.00 200.00ng/mL的浓度范围内配制六个浓~度级别的线性溶液，将上述线性溶液按照1.2中的检测条件进行检测，测定峰面积，以线性溶液中各组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线并建立线性方程。

[0061] 表5‑1 3‑氯丙烯线性试验结果

[0062]

[0063] 表5‑2  3‑溴丙烯线性试验结果

[0064]

[0065] 表5‑3  1‑溴丙烷线性试验结果

[0066]

[0067] 从表中数据可知本发明提供的检测方法线性范围宽，以上三种己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质在浓度约为25.00 200.00ng/mL的范围内线性关系良好。~

[0068] （4）重复性考察

[0069] 按照1.1中的配制方法配制供试品溶液，平行制备6份，按照1.2中的检测方法进行检测，具体检测结果见下表。

[0070] 表6 重复性试验结果

[0071]

[0072] 检测结果显示，重复测定6份供试品溶液，3‑氯丙烯、3‑溴丙烯、1‑溴丙烷均未检出，本方法重复性良好。

[0073] （5）准确度考察

[0074] 精密称取供试品9份，每份1.0g，分别置于10mL容量瓶中，再分别加入上述对照品贮备液0.20mL、0.25mL和0.30mL，每个浓度平行制备三份，分别加甲醇稀释至刻度，作为回收率溶液；取对照品溶液和上述三种回收率溶液，按照1.2中的检测条件进行检测，根据回收率（%）=（测得量‑原有量）/加入量×100% 计算回收率，回收率结果见下表。

[0075] 表7‑1  3‑氯丙烯回收率检测结果

[0076]

[0077] 表7‑2  3‑溴丙烯回收率检测结果

[0078]

[0079] 表7‑3 1‑溴丙烷回收率检测结果

[0080]

[0081] 从表中数据可知本发明提供的己酮可可碱中间体卤代烷烃类基因毒性杂质检测方法在1.00 1.50ppm浓度范围内，回收率为93.87% 102.09%之间，RDS小于5%，表明本发明~ ~的检测方法准确度良好。

[0082] （6）精密度考察

[0083] 取上述对照品溶液，并按照1.2中的检测条件进行检测，平行测定6次，计算检测含量，测试结果如下表所示。

[0084] 表8精密度测试结果

[0085]

[0086] 从表中数据可知，对照品溶液连续检测6次，各杂质的峰面积相对标准偏差（RSD）为2.35% 3.51%，表明本方法的精密性良好。~

[0087] （7）耐用性考察

[0088] 取对照品溶液，然后分别微调1.2检测方法中的升温速率、初始温度、进样口温度及载气流速进行检测，其他检测条件不变，耐用性结果见下表。

[0089] 表9耐用性试验结果

[0090]

[0091] 从上述表中数据可知，通过微调升温速率、初始温度、进样口温度及载气流速以上因素对各杂质检测无影响，表明本方法的耐用性良好。

[0092] （8）中间精密度考察

[0093] 按照1.1中的配制方法配制供试品溶液，平行制备6份，按照1.2中的检测方法进行检测，且6份供试品的检测日期不同，操作者也不同，具体检测结果见下表。

[0094] 表10中间精密度试验结果

[0095]

[0096] 从表中可知，上述6份供试品溶液均未检出，与重复性结果一致，表明本方法的中间精密度良好。

[0097] （9）稳定性考察

[0098] 取对照品溶液和供试品溶液，将对照溶液和供试品溶液在室温下静置，每隔0h、2h、4h、6h、8h、24h按照1.2中的检测方法进行检测，结果见下表。

[0099] 表11对照品溶液稳定性试验结果

[0100]

[0101] 表12供试品溶液稳定性试验结果

[0102]

[0103] 从表中可知，供试品溶液在室温条件下，放置24小时，各杂质均未检出，对照品溶液在室温条件下，放置24小时，各杂质峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.26% 2.04%，表明上~述供试品和对照品溶液的稳定性良好。

[0104] 从附图1 4及上述几个方面的方法学考察可见，本发明提供的检测方法检测灵敏~度高、检测限低，检测时间短，显著提高了检测的工作效率，而且检测结果准确、可靠，线性关系良好，同时具有良好的精密度和耐用性，能够监控己酮可可碱中间体的质量稳定性，进而为己酮可可碱的临床用药安全性提供了保证和依据。

[0105] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。