液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的方法及试剂盒转让专利
申请号 : CN202210321558.4
文献号 : CN114414707B
文献日 : 2022-07-22
发明人 : 贾永娟 , 刘春冉 , 刘杏立 , 张杰 , 倪君君
申请人 : 北京和合医学诊断技术股份有限公司
摘要 :
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的方法及试剂盒。待测物质包括舒必利、五氟利多、米安色林、丁螺环酮、坦度螺酮、羟嗪、地西泮、文拉法辛、吗氯贝胺、丙咪嗪、帕罗西汀、瑞波西汀、阿米替林、舍曲林、地高辛、氯硝西泮、氯吡格雷、甲苯磺丁脲、格列美脲、1‑嘧啶哌嗪、去甲文拉法辛、6‑羟基丁螺环酮、去甲丙咪嗪、去甲阿米替林、去甲地西泮、氯吡格雷代谢物；检测方法包括：标定标准溶液、处理待测样本、采用高效液相色谱‑质谱检测待测样本。本发明实施例可快速、准确测定含量，样本处理方法简单易行，灵敏度高、精确定量。
权利要求 :
1.一种液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的方法，其特征在于，所述方法的待测物质包括19种药物和7种代谢产物；
所述19种药物包括舒必利、五氟利多、米安色林、丁螺环酮、坦度螺酮、羟嗪、地西泮、文拉法辛、吗氯贝胺、丙咪嗪、帕罗西汀、瑞波西汀、阿米替林、舍曲林、地高辛、氯硝西泮、氯吡格雷、甲苯磺丁脲、格列美脲；所述7种代谢产物包括1‑嘧啶哌嗪、去甲文拉法辛、6‑羟基丁螺环酮、去甲丙咪嗪、去甲阿米替林、去甲地西泮、氯吡格雷MP衍生物；
所述方法至少包括以下步骤：
S1、标定标准溶液：采用甲醇水溶液配制含有所述19种药物和所述7种代谢产物的标准品的标准工作液；采用甲醇水溶液配制内标工作液；利用所述标准工作液和所述内标工作液获得19种药物和7种代谢产物的标准曲线方程；
S2、处理待测样本：将抗凝血液样本中加入含有所述内标工作液的萃取剂，萃取得上清，上清干燥后加入复溶液，混匀、离心得到待测样本；所述抗凝血液样本与所述萃取剂的体积比为1：5 1：15；所述抗凝血液样本与所述内标工作液的体积比为10：1；所述上清与~所述复溶液的体积比9：1 10：1；所述萃取剂选自甲基叔丁基醚，所述复溶液选自体积比~为1:1甲醇：水混合溶液；
S3、采用高效液相色谱‑质谱检测所述待测样本；
高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时；
色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Shim‑packVelox C18，2.1×100mm，2.7μm；
流动相：A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；
梯度洗脱：0 1分钟：A 60%，B 40%；
~
2.00 2.5分钟：A 40%，B 60%；
~
3.50 5.00分钟：A 20%，B 80%；
~
5.01 6.50分钟：A 60%，B 40%；
~
舒必利内标为左舒必利‑D3，去甲文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，吗氯贝胺内标为吗氯贝胺‑D8，6‑羟基丁螺环酮内标为6‑羟基丁螺环酮‑D8，坦度螺酮内标为坦度螺酮‑D8，1‑嘧啶哌嗪内标为1‑嘧啶哌嗪‑D8，丁螺环酮内标为丁螺环酮‑D8，文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，米安色林内标为米安色林‑D3，瑞波西汀内标为去甲阿米替林‑D3，帕罗西汀内标为氯硝西泮‑D4，氯硝西泮内标为氯硝西泮‑D4，丙咪嗪内标为丙咪嗪‑D3，去甲丙咪嗪内标为去甲丙咪嗪‑D3，阿米替林内标为阿米替林‑D3，羟嗪内标为羟嗪‑D8，去甲阿米替林内标为去甲阿米替林‑D3，地高辛内标为地高辛‑D3，舍曲林内标为甲丙咪嗪‑D3，甲苯磺丁脲内标为格列美脲‑D5，去甲地西泮内标为地西泮‑D5，地西泮内标为地西泮‑D5，五氟利多内标为五氟利多‑D7，格列美脲内标为格列美脲‑D5，氯吡格雷代谢物内标为氯吡格雷代谢物‑C6，氯吡格雷内标为氯吡格雷‑D3；
高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6470A时，色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Shim‑packVelox C18，参数为2.1×100mm，2.7μm；
流动相：A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；
梯度洗脱：
0 1.00分钟：A 60%，B 40%；
~
1.50 3.50分钟：A 30%，B 70%；
~
4.00 5.50分钟：A 0%，B 100%；
~
5.51 7.5 分钟：A 60%，B 40%；
~
舒必利内标为1‑嘧啶哌嗪‑D8，去甲文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，吗氯贝胺内标为吗氯贝胺‑D8，6‑羟基丁螺环酮内标为6‑羟基丁螺环酮‑D8，坦度螺酮内标为坦度螺酮‑D8，1‑嘧啶哌嗪内标为1‑嘧啶哌嗪‑D8，丁螺环酮内标为丁螺环酮‑D8，文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，米安色林内标为米安色林‑D3，瑞波西汀内标为羟嗪‑D8，帕罗西汀内标为氯硝西泮‑D4，氯硝西泮内标为氯硝西泮‑D4，丙咪嗪内标为丙咪嗪‑D3，去甲丙咪嗪内标为去甲丙咪嗪‑D3，阿米替林内标为阿米替林‑D3，羟嗪内标为羟嗪‑D8，去甲阿米替林内标为去甲阿米替林‑D3，地高辛内标为地高辛‑D3，舍曲林内标为氯硝西泮‑D4，甲苯磺丁脲内标为阿米替林‑D3，去甲地西泮内标为阿米替林‑D3，地西泮内标为去甲阿米替林‑D3，五氟利多内标为五氟利多‑D7，格列美脲内标为格列美脲‑D5，氯吡格雷代谢物内标为氯吡格雷代谢物‑C6，氯吡格雷内标为氯吡格雷‑D3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述标准工作液中含有如下标准品：硫酸氢氯吡格雷标准品、氯吡格雷MP衍生物标准品、1‑(2‑嘧啶)哌嗪标准品、坦度螺酮标准品、米安色林标准品、丙咪嗪盐酸盐标准品、羟嗪盐酸盐标准品、去甲丙咪嗪标准品、五氟利多标准品、地高辛标准品、甲苯磺丁脲标准品、帕罗西汀标准品、瑞波西汀标准品、文拉法辛标准品、去甲文拉法辛标准品、格列美脲标准品、丁螺环酮标准品、6‑羟基丁螺环酮标准品、氯硝西泮标准品、舍曲林标准品、吗氯贝胺标准品、舒必利标准品、地西泮标准品、去甲地西泮标准品、阿米替林标准品、去甲阿米替林标准品；所述标准工作液包括L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8共8个级别浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
各所述级别浓度均采用甲醇：水的体积比为7：3的混合溶液从中间液稀释得到；所述中间液采用甲醇：水的体积比为7：3的混合溶液从母液稀释得到；所述母液采用甲醇或甲醇水溶液溶解所述标准品得到。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述内标工作液中含有以下浓度的内标物：氯硝西泮‑D4：100 ng/mL；地高辛‑D3：100 ng/mL；氯吡格雷‑D3：40 ng/mL；氯吡格雷代谢物‑C6：500 ng/mL；格列美脲‑D5：100 ng/mL；
五氟利多‑D7：3200 ng/mL；丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；去甲丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；米安色林‑D3：1000 ng/mL；坦度螺酮‑D8： 20 ng/mL；1‑嘧啶哌嗪‑D8：10 ng/mL；丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；6‑羟基丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；羟嗪‑D8：40 ng/mL；文拉法辛‑D6：2000 ng/mL；吗氯贝胺‑D8：1000 ng/mL；阿米替林‑D3：500 ng/mL；去甲阿米替林‑D3：2000 ng/mL；地西泮‑D5：400 ng/mL；左舒必利‑D3：1000 ng/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗凝血液样本与所述萃取剂的体积比为1：10；
所述上清干燥后加入所述复溶液，所述上清与所述复溶液的体积比9.5：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，处理待测样本包括：将抗凝血液样本中加入内标工作液和萃取剂，涡旋4 8分钟，离心8 12分钟，取上清干燥，加入所述复溶液，~ ~涡旋0.5 2分钟离心4 7分钟得到的上清液即为所述待测样本；
~ ~
所述涡旋的转速为2000rpm；所述离心转速为14000 rpm。
7.根据权利要求1 6任一项所述的方法，其特征在于，~
所述高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时；
柱温为50℃；
流速为：0.3mL/分钟；L1、L2、L3、L4、L5、L6标准工作液的进样量5μL，L7和L8标准工作液的进样1μL；待测样本的进样量为5 μL；分析时间为6.5分钟；
质谱参数为：
离子源温度：350℃；
离子源高压：5500 V；
气帘气：20 L/min；
碰撞气：8 L/min；
干燥气1：50 L/min；
干燥气2：50 L/min。
8.根据权利要求1 6任一项所述的方法，其特征在于，~
所述高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6470A时，柱温为50℃；
流速为：0.3 mL/分钟；L1、L2、L3、L4、L5、L6标准工作液的进样量5μL，L7和L8标准工作液的进样2μL；待测样本的进样量为5μL；分析时间为7.5分钟；
质谱参数为：
采集模式：ESI(+)；MRM；
雾化气温度：200℃；
雾化气气流：3 L/min；
鞘气温度：200℃；
鞘气气流：11 L/min；
雾化气压力：45psi；
毛细管电压：5000 V；
Delta‑EMV：100 V。
9.一种血液中19种药物及其代谢产物的试剂盒，其特征在于，所述19种药物包括舒必利、五氟利多、米安色林、丁螺环酮、坦度螺酮、羟嗪、地西泮、文拉法辛、吗氯贝胺、丙咪嗪、帕罗西汀、瑞波西汀、阿米替林、舍曲林、地高辛、氯硝西泮、氯吡格雷、甲苯磺丁脲、格列美脲；所述代谢产物包括1‑嘧啶哌嗪、去甲文拉法辛、6‑羟基丁螺环酮、去甲丙咪嗪、去甲阿米替林、去甲地西泮、氯吡格雷代谢物；
所述试剂盒包括以下试剂：
（1）内标工作液：
（2）标准工作液；
（3）萃取剂：甲基叔丁基醚；
（4）复溶液：体积比为1:1甲醇：水混合溶液；
（5）阳性及阴性对照品；
所述内标工作液中含有以下浓度的内标物：氯硝西泮‑D4：100 ng/mL；地高辛‑D3：100 ng/mL；氯吡格雷‑D3：40 ng/mL；氯吡格雷代谢物‑C6：500 ng/mL；格列美脲‑D5：100 ng/mL；
五氟利多‑D7：3200 ng/mL；丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；去甲丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；米安色林‑D3：1000 ng/mL；坦度螺酮‑D8： 20 ng/mL；1‑嘧啶哌嗪‑D8：10 ng/mL；丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；6‑羟基丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；羟嗪‑D8：40 ng/mL；文拉法辛‑D6：2000 ng/mL；吗氯贝胺‑D8：1000 ng/mL；阿米替林‑D3：500 ng/mL；去甲阿米替林‑D3：2000 ng/mL；地西泮‑D5：400 ng/mL；左舒必利‑D3：1000 ng/mL；
所述标准工作液中含有如下标准品：硫酸氢氯吡格雷标准品、氯吡格雷活性代谢物衍生物标准品、1‑(2‑嘧啶)哌嗪标准品、坦度螺酮标准品、米安色林标准品、丙咪嗪盐酸盐标准品、羟嗪盐酸盐标准品、去甲丙咪嗪标准品、五氟利多标准品、地高辛标准品、甲苯磺丁脲标准品、帕罗西汀标准品、瑞波西汀标准品、文拉法辛标准品、去甲文拉法辛标准品、格列美脲标准品、丁螺环酮标准品、6‑羟基丁螺环酮标准品、氯硝西泮标准品、舍曲林标准品、吗氯贝胺标准品、舒必利标准品、地西泮标准品、去甲地西泮标准品、阿米替林标准品、去甲阿米替林标准品；
所述试剂盒还含有色谱柱流动相；A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有
0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；所述阳性对照品为加标质控品；所述阴性对照品为体积比为7:3的甲醇：水。
说明书 :
液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的方法
及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的方法及试剂盒。
背景技术
[0002] 治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，简称TDM）是一门研究个体化药物治疗机制、技术、方法和临床标准，并将研究结果转化应用于临床治疗以达到最大化合理用药的药学临床学科。通过测定患者体内的药物暴露、药理标志物或药效指标，利用定量药理模型，以药物治疗窗为基准，制订适合患者的个体化给药方案，其核心是个体化药物治疗，TDM的临床意义在于能够优化药物治疗方案，提高药物疗效、降低毒副作用，同时通过合理用药最大化应该能节省药物治疗费用。需要进行TDM监测的药物种类有很多，为了更好的对药物浓度进行监测，很多医院/第三方检测机构开发了一针多测的检测方法，目前存在的大部分一针多测都是将同一类药物放在一个方法包中，但是实际情况是对于同一种疾病同时服用多种药物的情况较少，但是对于老年人来说同时服用不同种类药物的情况越来越普遍。为了更好的监测服用药物的浓度含量，更好地指导临床医生有效的调整用药方案，从而得到更优的治疗方案，最短时间内减轻患者痛苦。
[0003] 抗精神病药、抗焦虑药、抗抑郁、强心苷、抗癫痫药、血小板聚集抑制剂、降血糖药等药物患者会同时服用，不同药物针对不同疾病发挥作用，以上药物均需要进行血药浓度监测，个别药物还存在危急值，超过特定浓度之后会造成中毒。
[0004] 因此，急需找到一种前处理操作简单易行、灵敏度高、可精确定量相的检测血液中上述药物及其代谢产物的方法。
发明内容
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的方法及试剂盒。
[0006] 本发明提出一种液相色谱串联质谱血液中19种药物及其代谢产物的检测方法，所述检测方法的待测物质包括19种药物和7种代谢产物；所述19种药物包括舒必利、五氟利多、米安色林、丁螺环酮、坦度螺酮、羟嗪、地西泮、文拉法辛、吗氯贝胺、丙咪嗪、帕罗西汀、瑞波西汀、阿米替林、舍曲林、地高辛、氯硝西泮、氯吡格雷、甲苯磺丁脲、格列美脲；所述7种代谢产物包括1‑嘧啶哌嗪、去甲文拉法辛、6‑羟基丁螺环酮、去甲丙咪嗪、去甲阿米替林、去甲地西泮、氯吡格雷MP衍生物；所述检测方法至少包括以下步骤：
[0007] S1、标定标准溶液：采用甲醇水溶液配制含有所述19种药物和所述7种代谢产物的标准品的标准工作液；采用甲醇水溶液配制内标工作液；利用所述标准工作液和所述内标工作液获得19种药物和7种代谢产物的标准曲线方程；
[0008] S2、处理待测样本：将抗凝血液样本中加入含有所述内标工作液的萃取剂，萃取得上清中加入复溶液，混匀、离心得到待测样本；
[0009] 所述萃取剂选自甲基叔丁基醚，所述复溶液选自体积比为1:1甲醇：水混合溶液；
[0010] S3、采用高效液相色谱‑质谱检测所述待测样本。
[0011] 可选的，所述标准工作液中含有如下标准品：硫酸氢氯吡格雷标准品、氯吡格雷MP衍生物标准品、1‑(2‑嘧啶)哌嗪标准品、坦度螺酮标准品、米安色林标准品、丙咪嗪盐酸盐标准品、羟嗪盐酸盐标准品、去甲丙咪嗪标准品、五氟利多标准品、地高辛标准品、甲苯磺丁脲标准品、帕罗西汀标准品、瑞波西汀标准品、文拉法辛标准品、去甲文拉法辛标准品、格列美脲标准品、丁螺环酮标准品、6‑羟基丁螺环酮标准品、氯硝西泮标准品、舍曲林标准品、吗氯贝胺标准品、舒必利标准品、地西泮标准品、去甲地西泮标准品、阿米替林标准品、去甲阿米替林标准品；所述标准工作液包括L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8共8个级别浓度；
[0012] 优选的，各所述级别浓度均采用甲醇：水的体积比为7：3的混合溶液从中间液稀释得到；所述中间液采用甲醇：水的体积比为7：3的混合溶液从母液稀释得到；所述母液采用甲醇或甲醇水溶液溶解所述标准品得到。
[0013] 可选的，所述内标工作液中含有如下内标物：氯吡格雷‑D3、氯吡格雷代谢物衍生物‑13C6、1‑(2‑嘧啶)哌嗪‑D8、坦度螺酮‑D8、米安色林‑D3、丙咪嗪‑D3、羟嗪‑D8、去甲丙咪嗪‑D3、五氟利多‑D7、阿米替林‑D3、去甲阿米替林‑D3、丁螺环酮盐酸盐‑D8、6‑羟基丁螺环酮‑D8、氯硝西泮‑D4、地高辛‑D3、文拉法辛‑D6、格列美脲‑D5、吗氯贝胺‑D8、左舒必利‑D3、地西泮‑D5。
[0014] 优选的，所述内标工作液中含有以下浓度的内标物：氯硝西泮‑D4：100 ng/mL；地高辛‑D3：100 ng/mL；氯吡格雷‑D3：40 ng/mL；氯吡格雷代谢物‑C6：500 ng/mL；格列美脲‑D5：100 ng/mL；五氟利多‑D7：3200 ng/mL；丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；去甲丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；米安色林‑D3：1000 ng/mL；坦度螺酮‑D8： 20 ng/mL；1‑嘧啶哌嗪‑D8：10 ng/mL；丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；6‑羟基丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；羟嗪‑D8：40 ng/mL；文拉法辛‑D6：2000 ng/mL；吗氯贝胺‑D8：1000 ng/mL；阿米替林‑D3：500 ng/mL；去甲阿米替林‑D3：2000 ng/mL；地西泮‑D5：400 ng/mL；左舒必利‑D3：1000 ng/mL。
[0015] 可选的，所述血清/血浆样本与所述萃取剂的体积比为1：5 1：15，优选为1：10；~
优选的，所述血清/血浆样本与所述内标工作液的体积比为10：1；更优选的，所述上清干燥后加入所述复溶液，所述上清与所述复溶液的体积比9：1 10：1，优选9.5：1。
~
优选的，所述血清/血浆样本与所述内标工作液的体积比为10：1；更优选的，所述上清干燥后加入所述复溶液，所述上清与所述复溶液的体积比9：1 10：1，优选9.5：1。
~
[0016] 可选的，处理待测样本包括：将血清/血浆样本中加入内标工作液和萃取剂，涡旋4 8分钟，优选5分钟，离心8 12分钟，优选10分钟，取上清干燥，加入所述复溶液，涡旋0.5 ~ ~
2分钟，优选1分钟，离心4 7分钟，优选5分钟得到的上清液即为所述待测样本；
~ ~
2分钟，优选1分钟，离心4 7分钟，优选5分钟得到的上清液即为所述待测样本；
~ ~
[0017] 所述涡旋的转速为2000rpm；所述离心转速为14000 rpm。可选的，所述高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时；
[0018] 色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Shim‑pack Velox C18，2.1×100mm，2.7μm；柱温为50℃；流动相：A相为含有甲酸和甲酸铵的水，B相为含有甲酸和甲酸铵的甲醇；优选的，A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；
[0019] 梯度洗脱：0 1分钟：A 60%，B 40%；2.00 2.5分钟：A 40%，B 60%；3.50 5分钟：A ~ ~ ~20%，B 80%；5.01 6.50分钟：A 60%，B 40%；流速为：0.3mL/分钟；
~
~
[0020] 优选的，L1、L2、L3、L4、L5、L6标准工作液的进样量5μL，L7和L8标准工作液的进样1μL；待测样本的进样量为5 μL；更优选的，分析时间为6.5分钟；
[0021] 质谱参数为：离子源温度：350℃；离子源高压：5500 V；气帘气：20 L/min；碰撞气：8 L/min；干燥气1：50 L/min；干燥气2：50 L/min。
[0022] 可选的，所述高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时；舒必利内标为左舒必利‑D3，去甲文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，吗氯贝胺内标为吗氯贝胺‑D8，6‑羟基丁螺环酮内标为6‑羟基丁螺环酮‑D8，坦度螺酮内标为坦度螺酮‑D8，1‑嘧啶哌嗪内标为1‑嘧啶哌嗪‑D8，丁螺环酮内标为丁螺环酮‑D8，文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，米安色林内标为米安色林‑D3，瑞波西汀内标为去甲阿米替林‑D3，帕罗西汀内标为氯硝西泮‑D4，氯硝西泮内标为氯硝西泮‑D4，丙咪嗪内标为丙咪嗪‑D3，去甲丙咪嗪内标为去甲丙咪嗪‑D3，阿米替林内标为阿米替林‑D3，羟嗪内标为羟嗪‑D8，去甲阿米替林内标为去甲阿米替林‑D3，地高辛内标为地高辛‑D3，舍曲林内标为甲丙咪嗪‑D3，甲苯磺丁脲内标为格列美脲‑D5，去甲地西泮内标为地西泮‑D5，地西泮内标为地西泮‑D5，五氟利多内标为五氟利多‑D7，格列美脲内标为格列美脲‑D5，氯吡格雷代谢物内标为氯吡格雷代谢物‑C6，氯吡格雷内标为氯吡格雷‑D3。
[0023] 可选的，所述高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6470A时，色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Shim‑pack Velox C18，参数为2.1×100mm，2.7μm；柱温为50℃；
[0024] 流动相：A相为含有甲酸和甲酸铵的水，B相为含有甲酸和甲酸铵的甲醇；优选的，A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；
[0025] 梯度洗脱：0 1.00分钟：A 60%，B 40%；1.50 3.5分钟：A 30%，B 70%；4.00 5.50~ ~ ~分钟：A 0%，B 100%；5.51 7.5分钟：A 60%，B 40%；流速为：0.3 mL/分钟；
~
~
[0026] 优选的，L1、L2、L3、L4、L5、L6标准工作液的进样量5μL，L7和L8标准工作液的进样2μL；待测样本的进样量为5μL；更优选的，分析时间为7.5分钟；
[0027] 质谱参数为：采集模式：ESI(+)；MRM；雾化气温度：200℃；雾化气气流：3 L/min；鞘气温度：200℃；鞘气气流：11 L/min；雾化气压力：45psi；毛细管电压：5000 V；Delta‑EMV：100 V。
[0028] 可选的，舒必利内标为1‑嘧啶哌嗪‑D8，去甲文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，吗氯贝胺内标为吗氯贝胺‑D8，6‑羟基丁螺环酮内标为6‑羟基丁螺环酮‑D8，坦度螺酮内标为坦度螺酮‑D8，1‑嘧啶哌嗪内标为1‑嘧啶哌嗪‑D8，丁螺环酮内标为丁螺环酮‑D8，文拉法辛内标为文拉法辛‑D6，米安色林内标为米安色林‑D3，瑞波西汀内标为羟嗪‑D8，帕罗西汀内标为氯硝西泮‑D4，氯硝西泮内标为氯硝西泮‑D4，丙咪嗪内标为丙咪嗪‑D3，去甲丙咪嗪内标为去甲丙咪嗪‑D3，阿米替林内标为阿米替林‑D3，羟嗪内标为羟嗪‑D8，去甲阿米替林内标为去甲阿米替林‑D3，地高辛内标为地高辛‑D3，舍曲林内标为氯硝西泮‑D4，甲苯磺丁脲内标为阿米替林‑D3，去甲地西泮内标为阿米替林‑D3，地西泮内标为去甲阿米替林‑D3，五氟利多内标为五氟利多‑D7，格列美脲内标为格列美脲‑D5，氯吡格雷代谢物内标为氯吡格雷代谢物‑C6，氯吡格雷内标为氯吡格雷‑D3。
[0029] 本发明还提出一种血液中19种药物及其代谢产物的试剂盒，所述19种药物包括舒必利、五氟利多、米安色林、丁螺环酮、坦度螺酮、羟嗪、地西泮、文拉法辛、吗氯贝胺、丙咪嗪、帕罗西汀、瑞波西汀、阿米替林、舍曲林、地高辛、氯硝西泮、氯吡格雷、甲苯磺丁脲、格列美脲；所述代谢产物包括1‑嘧啶哌嗪、去甲文拉法辛、6‑羟基丁螺环酮、去甲丙咪嗪、去甲阿米替林、去甲地西泮、氯吡格雷代谢物；
[0030] 所述试剂盒包括以下试剂：
[0031] （1）内标工作液：（2）标准工作液；（3）萃取剂：甲基叔丁基醚；
[0032] （4）复溶液：体积比为1:1甲醇：水混合溶液；（5）阳性及阴性对照品；
[0033] 所述内标工作液中含有以下浓度的内标物：氯硝西泮‑D4：100 ng/mL；地高辛‑D3：100 ng/mL；氯吡格雷‑D3：40 ng/mL；氯吡格雷代谢物‑C6：500 ng/mL；格列美脲‑D5：100 ng/mL；五氟利多‑D7：3200 ng/mL；丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；去甲丙咪嗪‑D3：2000 ng/mL；米安色林‑D3：1000 ng/mL；坦度螺酮‑D8： 20 ng/mL；1‑嘧啶哌嗪‑D8：10 ng/mL；丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；6‑羟基丁螺环酮‑D8：20 ng/mL；羟嗪‑D8：40 ng/mL；文拉法辛‑D6：2000 ng/mL；吗氯贝胺‑D8：1000 ng/mL；阿米替林‑D3：500 ng/mL；去甲阿米替林‑D3：2000 ng/mL；地西泮‑D5：400 ng/mL；左舒必利‑D3：1000 ng/mL。
[0034] 所述标准工作液中含有如下标准品：硫酸氢氯吡格雷标准品、氯吡格雷活性代谢物衍生物标准品、1‑(2‑嘧啶)哌嗪标准品、坦度螺酮标准品、米安色林标准品、丙咪嗪盐酸盐标准品、羟嗪盐酸盐标准品、去甲丙咪嗪标准品、五氟利多标准品、地高辛标准品、甲苯磺丁脲标准品、帕罗西汀标准品、瑞波西汀标准品、文拉法辛标准品、去甲文拉法辛标准品、格列美脲标准品、丁螺环酮标准品、6‑羟基丁螺环酮标准品、氯硝西泮标准品、舍曲林标准品、吗氯贝胺标准品、舒必利标准品、地西泮标准品、去甲地西泮标准品、阿米替林标准品、去甲阿米替林标准品；优选的，还含有色谱柱流动相；A相为含有甲酸和甲酸铵的水，B相为含有甲酸和甲酸铵的甲醇；更优选的，A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；阳性对照品为加标质控品；阴性对照品为体积比为7：3的甲醇：水。
[0035] 本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0036] 本发明实施例提出一种检测血液中19种药物及其代谢产物含量的液质分析方法，快速、准确测定19种药物及其代谢产物含量，样本处理方法简单易行，并且具有灵敏度高、精确定量的技术优势，可以广泛适用。本发明的检测方法的分析时长为6.5分钟或7.5分钟，一针出26个物质，1个小时可以分析10个样本，具有分析时间短的优势。
附图说明
[0037] 图1为本发明实施例采用安捷伦6470检测某一浓度工作液的色谱图；
[0038] 图2为本发明实施例采用安捷伦6470检测质控样本的色谱图；
[0039] 图3为本发明实施例采用AB4500MD检测某一浓度工作液的色谱图；
[0040] 图4为本发明实施例采用AB4500MD检测质控样本的色谱图；
[0041] 图5为本发明对比例中米安色林拖尾的色谱图；
[0042] 图6为本发明对比例中瑞波西汀拖尾的色谱图；
[0043] 图7为本发明对比例中帕罗西汀拖尾的色谱图；
[0044] 图8为本发明对比例中丙咪嗪拖尾的色谱图；
[0045] 图9为本发明实施例中安色林拖尾得到改善的色谱图；
[0046] 图10为本发明实施例中瑞波西汀拖尾情况得到改善的色谱图；
[0047] 图11为本发明实施例中帕罗西汀拖尾情况得到改善的色谱图；
[0048] 图12为本发明实施例中丙咪嗪拖尾情况得到改善的色谱图；
[0049] 图13为本发明对比例中氯吡格雷代谢物内标与杂质分不开的色谱图；
[0050] 图14为本发明实施例中氯吡格雷代谢物内标与杂质分开的色谱图。
具体实施方式
[0051] 为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0052] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0053] 本发明实施例提出一种血液中19种药物及其代谢产物的检测方法，检测方法的待测物质包括19种药物和7种代谢产物具体如表1所示：
[0054] 表1
[0055]
[0056] 本发明实施例的检测方法至少包括以下步骤：
[0057] S1、标定标准溶液：采用甲醇水溶液配制含有上述19种药物和7种代谢产物的标准品的标准工作液；采用甲醇水溶液配制内标工作液；利用标准工作液和内标工作液获得19种药物和7种代谢产物的标准曲线方程；
[0058] S2、处理待测样本：将血清/血浆样本中加入含有内标工作液的萃取剂，萃取得上清中加入复溶液，混匀、离心得到待测样本；
[0059] 其中，萃取剂选自甲基叔丁基醚，复溶液选自体积比为1:1甲醇：水混合溶液；
[0060] S3、采用高效液相色谱‑质谱检测待测样本。
[0061] 本发明实施例提出一种检测血液中19种药物及其代谢产物含量的液质分析方法，快速、准确测定19种药物及其代谢产物含量，样本处理方法简单易行，并且具有灵敏度高、精确定量的技术优势，可以广泛适用。萃取剂选择甲基叔丁基醚是为了兼顾19种药物，26种检测物质的性质，因为极性大小不一致，最终选择用甲基叔丁基醚，既可以保证待测物质的萃取效果，又可以将杂质干扰降到最低，从而保证在比较短的分析时间内完成样本分析。常规实验操作中，复溶液一般会选择纯有机溶剂，比如甲醇、乙腈或者是有机溶剂与水按照一定比例进行混合，本申请选择的复溶液为甲醇：水=1:1，该复溶液的确定是为了预分析条件相匹配，可以有效避免溶剂效应，还能保证响应低物质的灵敏度，确保满足定量要求。
[0062] 本发明实施例的S1中，包括
[0063] S11、首先配制各种标准工作液和内标工作液：
[0064] 本发明实施例的标准工作液中含有如下标准品：硫酸氢氯吡格雷标准品、氯吡格雷活性代谢物衍生物标准品、1‑(2‑嘧啶)哌嗪标准品、坦度螺酮标准品、米安色林标准品、丙咪嗪盐酸盐标准品、羟嗪盐酸盐标准品、去甲丙咪嗪标准品、五氟利多标准品、地高辛标准品、甲苯磺丁脲标准品、帕罗西汀标准品、瑞波西汀标准品、文拉法辛标准品、去甲文拉法辛标准品、格列美脲标准品、丁螺环酮标准品、6‑羟基丁螺环酮标准品、氯硝西泮标准品、舍曲林标准品、吗氯贝胺标准品、舒必利标准品、地西泮标准品、去甲地西泮标准品、阿米替林标准品、去甲阿米替林标准品；标准工作液包括L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8共8个级别浓度。具体的，各标准工作液中各级别物质浓度如表2所示：
[0065] 表2
[0066]
[0067] 其中，各级别浓度均采用甲醇：水的体积比为7：3的混合溶液从中间液稀释得到；中间液采用甲醇：水的体积比为7：3的混合溶液从母液稀释得到；母液采用无水甲醇或甲醇水溶液溶解标准品得到。采用甲醇：水=7：3的混合溶液配制标准工作液和中间液的技术优势为：将标准品充分溶解，还可以保证中间以及工作液储存时间长，并且稳定。
[0068] 在配制母液中，有些标准品采用无水甲醇进行配制，有些标准品采用甲醇水溶液进行配制，甲醇水溶液中甲醇：水的体积比为5 7：3 5，优选1：1或7：3；例如丁螺环酮、~ ~6‑羟基丁螺环酮、氯硝西泮标准品采用甲醇：水=1:1配制母液，格列美脲、吗氯贝胺标准品采用甲醇：水=7：3配制母液，其余标准品均可采用无水甲醇配制母液。该配制方式的优势为：将标准品充分溶解，且以较长时间储存，目前母液储存12个月仍是稳定的，这对于实际检测非常关键。
[0069] 具体的，标准工作液的配制方式可采用本发明实施例1中的方法。
[0070] 本发明实施例的内标工作液中含有如下内标物：氯吡格雷‑D3、氯吡格雷代谢物衍生物‑13C6、1‑(2‑嘧啶)哌嗪‑D8、坦度螺酮‑D8、米安色林‑D3、丙咪嗪‑D3、羟嗪‑D8、去甲丙咪嗪‑D3、五氟利多‑D7、阿米替林‑D3、去甲阿米替林‑D3、丁螺环酮盐酸盐‑D8、6‑羟基丁螺环酮‑D8、氯硝西泮‑D4、地高辛‑D3、文拉法辛‑D6、格列美脲‑D5、吗氯贝胺‑D8、左舒必利‑D3、地西泮‑D5。
[0071] 在优选的具体实施方式中，内标工作液中各物质浓度如表3所示：
[0072] 表3
[0073] 内标物 浓度（ng/mL）
1 氯硝西泮‑D4 100
2 地高辛‑D3 100
3 氯吡格雷‑D3 40
4 氯吡格雷代谢物‑C6 500
5 格列美脲‑D5 100
6 五氟利多‑D7 3200
7 丙咪嗪‑D3 2000
8 去甲丙咪嗪‑D3 2000
9 米安色林‑D3 1000
10 坦度螺酮‑D8 20
11 1‑嘧啶哌嗪‑D8 10
12 丁螺环酮‑D8 20
13 6‑羟基丁螺环酮‑D8 20
14 羟嗪‑D8 40
15 文拉法辛‑D6 2000
16 吗氯贝胺‑D8 1000
17 阿米替林‑D3 500
18 去甲阿米替林‑D3 2000
19 地西泮‑D5 400
20 左舒必利‑D3 1000
1 氯硝西泮‑D4 100
2 地高辛‑D3 100
3 氯吡格雷‑D3 40
4 氯吡格雷代谢物‑C6 500
5 格列美脲‑D5 100
6 五氟利多‑D7 3200
7 丙咪嗪‑D3 2000
8 去甲丙咪嗪‑D3 2000
9 米安色林‑D3 1000
10 坦度螺酮‑D8 20
11 1‑嘧啶哌嗪‑D8 10
12 丁螺环酮‑D8 20
13 6‑羟基丁螺环酮‑D8 20
14 羟嗪‑D8 40
15 文拉法辛‑D6 2000
16 吗氯贝胺‑D8 1000
17 阿米替林‑D3 500
18 去甲阿米替林‑D3 2000
19 地西泮‑D5 400
20 左舒必利‑D3 1000
[0074] 具体的，内标工作液的配制方式可采用本发明实施例2中的方法。
[0075] S12、利用标准工作液和内标工作液获得19种药物和7种代谢产物的标准曲线方程。
[0076] 具体方法为：
[0077] 首先用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、内标工作液10μL和甲醇：水体积比为1:1的混合溶液80μL，分别置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀30s后，使用液相色谱质谱联用仪器（具体参数同S3）对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液，19种药物及其代谢物和内标色谱图，以上述至少三个标准溶液的各物质峰面积与对应内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中各物质浓度与对应内标浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y=a*x + b，并且得出权重系数a和b；通过计算得到待测血液样品中19种药物及其代谢物共计26个物质的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此可以计算得到该样本中待检测血液中的19种药物及其代谢物共计26个物质的浓度。
[0078] 本发明实施例的S2包括：
[0079] S21、获得血清/血浆样本，具体方法可采用：使用血清采血管/EDTA采血管/肝素锂采血管采集待检测血清至少2mL，在离心速度为3500rpm下离心10分钟，取上清液得血清/EDTA血浆/肝素锂血浆，血清或血浆置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用。
[0080] S22、将血清/血浆样本中加入内标工作液和甲基叔丁基醚，萃取得上清；本发明实施例中萃取剂选用甲基叔丁基醚的优势为所有物质的萃取效果较好，并且杂质干扰也较少。血清/血浆样本与甲基叔丁基醚的体积比为1：5 1：15，优选为1：10。由于地高辛信号~比较低，如果萃取量太少导致萃取效果不好，地高辛信号不够用；如果萃取剂太多的话氮吹时间太长。抗凝血液样本与内标工作液的体积比为10：1；
[0081] 具体工艺参数为：将血清/血浆样本中加入内标工作液和萃取剂，涡旋4 8分钟，~优选5分钟，然后离心8 12分钟，优选10分钟，获得上清；
~
~
[0082] S23、上清干燥后加入复溶液，复溶液为体积比为1:1的甲醇水溶液；选用该复溶液可以与预分析方法相匹配，避免溶剂效应，还保证低浓度物质的响应；上清与复溶液的体积比9：1 10：1，优选9.5：1；如果复溶液的添加量过大，地高辛响应太低，不能达到定量限要~求，如果复溶液的添加量过小，部分响应高的物质出现信号饱和严重。
[0083] 具体工艺参数为：上清干燥，优选室温条件下氮吹干；
[0084] S24、涡旋混匀、离心得到待测样本；
[0085] 具体工艺参数为：涡旋0.5 2分钟，优选1分钟，离心4 7分钟，优选5分钟。~ ~
[0086] 在S22 S24中，涡旋的转速为2000rpm；离心转速为14000 rpm。~
[0087] 本发明实施例的S3包括：
[0088] 采用高效液相色谱‑质谱检测待测样本，包括AB SCIEX、安捷伦LC1260/MS6470A两种型号高效液相色谱质谱联用仪，在实际检测过程中，可根据检测设备进行选择，从而使本发明实施例的检测方法的适用性更加宽泛。
[0089] 具体分析检测的条件为：
[0090] 一、当高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时；
[0091] 色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Shim‑pack Velox C18，2.1×100mm，2.7μm；柱温为50℃；
[0092] 流动相：A相为含有甲酸和甲酸铵的水，B相为含有甲酸和甲酸铵的甲醇；优选的，A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；
[0093] 梯度洗脱：0 1分钟：A 60%，B 40%；~
[0094] 2.00 2.5分钟：A 40%，B 60%；~
[0095] 3.50 5分钟：A 20%，B 80%；~
[0096] 5.01 6.50分钟：A 60%，B 40%；~
[0097] 流速为：0.3mL/分钟；
[0098] 优选的，L1、L2、L3、L4、L5、L6标准工作液的进样量5μL， L7和L8标准工作液的进样1μL；待测样本的进样量为5μL。
[0099] 更优选的，分析时间为6.5分钟；
[0100] 质谱参数为：离子源温度：350℃；离子源高压：5500 V；气帘气：20 L/min；碰撞气：8 L/min；干燥气1：50 L/min；干燥气2：50 L/min。
[0101] 高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时，待测物质所对应的内标如表4所示：
[0102] 表4
[0103] 待测物质 内标物质 内标物质对应简写舒必利 左舒必利‑D3 ZSBL‑D3
去甲文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
吗氯贝胺 吗氯贝胺‑D8 MLBA‑D8
6‑羟基丁螺环酮 6‑羟基丁螺环酮‑D8 6‑OH‑BUS‑d8
坦度螺酮 坦度螺酮‑D8 TDR‑D8
1‑嘧啶哌嗪 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1‑PP‑D8
丁螺环酮 丁螺环酮‑D8 BUS‑d8
文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
米安色林 米安色林‑D3 MASR‑D3
瑞波西汀 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
帕罗西汀 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
氯硝西泮 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
丙咪嗪 丙咪嗪‑D3 IPM‑D3
去甲丙咪嗪 去甲丙咪嗪‑D3 DPM‑D3
阿米替林 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
羟嗪 羟嗪‑D8 HOZ‑D8
去甲阿米替林 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
地高辛 地高辛‑D3 Digoxin‑D3
舍曲林 去甲丙咪嗪‑D3 DPM‑D3
甲苯磺丁脲 格列美脲‑D5 GLMN‑D5
去甲地西泮 地西泮‑D5 DXP‑D5
地西泮 地西泮‑D5 DXP‑D5
五氟利多 五氟利多‑D7 PFRD‑D7
格列美脲 格列美脲‑D5 GLMN‑D5
氯吡格雷代谢物 氯吡格雷代谢物‑C6 CAMD‑13C6
氯吡格雷 氯吡格雷‑D3 CLP‑D3
去甲文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
吗氯贝胺 吗氯贝胺‑D8 MLBA‑D8
6‑羟基丁螺环酮 6‑羟基丁螺环酮‑D8 6‑OH‑BUS‑d8
坦度螺酮 坦度螺酮‑D8 TDR‑D8
1‑嘧啶哌嗪 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1‑PP‑D8
丁螺环酮 丁螺环酮‑D8 BUS‑d8
文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
米安色林 米安色林‑D3 MASR‑D3
瑞波西汀 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
帕罗西汀 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
氯硝西泮 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
丙咪嗪 丙咪嗪‑D3 IPM‑D3
去甲丙咪嗪 去甲丙咪嗪‑D3 DPM‑D3
阿米替林 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
羟嗪 羟嗪‑D8 HOZ‑D8
去甲阿米替林 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
地高辛 地高辛‑D3 Digoxin‑D3
舍曲林 去甲丙咪嗪‑D3 DPM‑D3
甲苯磺丁脲 格列美脲‑D5 GLMN‑D5
去甲地西泮 地西泮‑D5 DXP‑D5
地西泮 地西泮‑D5 DXP‑D5
五氟利多 五氟利多‑D7 PFRD‑D7
格列美脲 格列美脲‑D5 GLMN‑D5
氯吡格雷代谢物 氯吡格雷代谢物‑C6 CAMD‑13C6
氯吡格雷 氯吡格雷‑D3 CLP‑D3
[0104] 根据上表可知，本发明通过对色谱质谱条件的筛选，通过20种内标物质，完成了26种物质的检测，内标物共用情况如表5所示：
[0105] 表5
[0106]
[0107] 本发明实施例在确保检测准确性的条件下，通过共用内标物质，大大简化了检测方法，提高了检测效率，降低了检测成本。
[0108] 二、高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6470A时，
[0109] 色谱柱为SHIMADZU Shim‑pack Shim‑pack Velox C18，
[0110] 参数为：2.1×100mm，2.7μm；
[0111] 柱温为50℃；
[0112] 流动相：A相为含有甲酸和甲酸铵的水，B相为含有甲酸和甲酸铵的甲醇；优选的，A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇；
[0113] 梯度洗脱：
[0114] 0 1.0分钟：A 60%，B 40%；~
[0115] 1.50 3.50分钟：A 30%，B 70%；~
[0116] 4.00 5.50分钟：A 0%，B 100%；~
[0117] 5.51 7.5 分钟：A 60%，B 40%；~
[0118] 流速为： 0.3 mL/分钟；
[0119] 优选的，L1、L2、L3、L4、L5、L6标准工作液的进样量5μL，L7和L8标准工作液的进样2μL；待测样本的进样量为5μL。
[0120] 更优选的，分析时间为7.5分钟；
[0121] 质谱参数为：采集模式：ESI(﹢)；MRM雾化气温度200℃；雾化气气流：3 L/min；鞘气温度：200℃；鞘气气流：11 L/min；Nebulizer：45psi；毛细管电压：5000 V；Delta‑EMV：100 V。
[0122] 高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6470A时，待测物质所对应的内标如表6所示：
[0123] 表6
[0124] 待测物质 内标物质 内标物质对应简写舒必利 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1‑PP‑D8
去甲文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
吗氯贝胺内标为 吗氯贝胺‑D8 MLBA‑D8
6‑羟基丁螺环酮 6‑羟基丁螺环酮‑D8 6‑OH‑BUS‑d8
坦度螺酮 坦度螺酮‑D8 TDR‑D8
1‑嘧啶哌嗪 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1‑PP‑D8
丁螺环酮 丁螺环酮‑D8 BUS‑d8
文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
米安色林 米安色林‑D3 MASR‑D3
瑞波西汀 羟嗪‑D8 HOZ‑D8
帕罗西汀 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
氯硝西泮 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
丙咪嗪 丙咪嗪‑D3 IPM‑D3
去甲丙咪嗪 去甲丙咪嗪‑D3 DPM‑D3
阿米替林 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
羟嗪 羟嗪‑D8 HOZ‑D8
去甲阿米替林 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
地高辛 地高辛‑D3 Digoxin‑D3
舍曲林 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
甲苯磺丁脲 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
去甲地西泮 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
地西泮 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
五氟利多 五氟利多‑D7 PFRD‑D7
格列美脲 格列美脲‑D5 GLMN‑D5
氯吡格雷代谢物 氯吡格雷代谢物‑C6 CAMD‑13C6，
氯吡格雷 氯吡格雷‑D3 CLP‑D3
去甲文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
吗氯贝胺内标为 吗氯贝胺‑D8 MLBA‑D8
6‑羟基丁螺环酮 6‑羟基丁螺环酮‑D8 6‑OH‑BUS‑d8
坦度螺酮 坦度螺酮‑D8 TDR‑D8
1‑嘧啶哌嗪 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1‑PP‑D8
丁螺环酮 丁螺环酮‑D8 BUS‑d8
文拉法辛 文拉法辛‑D6 WLFX‑D6
米安色林 米安色林‑D3 MASR‑D3
瑞波西汀 羟嗪‑D8 HOZ‑D8
帕罗西汀 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
氯硝西泮 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
丙咪嗪 丙咪嗪‑D3 IPM‑D3
去甲丙咪嗪 去甲丙咪嗪‑D3 DPM‑D3
阿米替林 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
羟嗪 羟嗪‑D8 HOZ‑D8
去甲阿米替林 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
地高辛 地高辛‑D3 Digoxin‑D3
舍曲林 氯硝西泮‑D4 Lxxp‑D4
甲苯磺丁脲 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
去甲地西泮 阿米替林‑D3 AMTL‑D3
地西泮 去甲阿米替林‑D3 NTL‑D3
五氟利多 五氟利多‑D7 PFRD‑D7
格列美脲 格列美脲‑D5 GLMN‑D5
氯吡格雷代谢物 氯吡格雷代谢物‑C6 CAMD‑13C6，
氯吡格雷 氯吡格雷‑D3 CLP‑D3
[0125] 根据上表可知，本发明通过对色谱质谱条件的筛选，通过18种内标物质，完成了26种物质的检测，内标物共用情况如表7所示：
[0126] 表7
[0127]
[0128] 本发明实施例在确保检测准确性的条件下，通过共用内标物质，大大简化了检测方法，提高了检测效率，降低了检测成本。本发明实施例的检测方法分别为6.5min和7.5min，一针出26个物质，1个小时可以分析10个样本，分析时间短，另外2种不同型号仪器均可以完成26个物质检测。
[0129] 实施例1
[0130] 本实施例用以说明标准工作液的配制的一种具体实施方式：
[0131] 1、氯吡格雷：精确称取硫酸氢氯吡格雷标准品1.56 mg，置于2 mL冻存管中，加入2 mL甲醇溶解并定容，得到浓度为597.8 μg/mL母液。
[0132] 2、氯吡格雷代谢物：向含1mg氯吡格雷活性代谢物衍生物的样品瓶中加入1ml甲醇溶解，得到浓度1000 μg/mL母液。
[0133] 3、1‑(2‑嘧啶)哌嗪：精密称量1‑(2‑嘧啶)哌嗪标准品5.78 mg至2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，混匀后得到浓度为2832 μg/mL母液。
[0134] 4、坦度螺酮：精密称量坦度螺酮标准品2.13 mg至2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，混匀后得到浓度为1044 μg/mL母液。
[0135] 5、米安色林：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度1000 μg/mL。
[0136] 6、丙咪嗪：精密称量丙咪嗪盐酸盐标准品4.2 mg至2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，混匀后得到浓度为1858 μg/mL母液。
[0137] 7、羟嗪：精密称量羟嗪盐酸盐标准品2.27 mg至2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，混匀后得到浓度为937 μg/mL母液。
[0138] 8、去甲丙咪嗪：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度1000 μg/mL。
[0139] 9、五氟利多：精密称量五氟利多标准品2.82 mg至2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，混匀后得到浓度为1368 μg/mL母液。
[0140] 10、地高辛：天平精确称取地高辛标准品2.00 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，充分混匀溶解之后得到浓度为1000 μg/mL母液。
[0141] 11、甲苯磺丁脲：精确称取标准品2.812 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，得到浓度为1406 μg/mL母液。
[0142] 12、帕罗西汀：精确称取标准品4.224 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，得到浓度为1808 μg/mL母液。
[0143] 13、瑞波西汀：精确称取标准品2.617 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，得到浓度为961μg/mL母液。
[0144] 14、文拉法辛：精确称取标准品4.864 mg，置于2 mL冻存管，加入2mL甲醇溶解，得到浓度为2145 μg/mL母液。
[0145] 15、去甲文拉法辛：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度1000 μg/mL。
[0146] 16、格列美脲：精确称取标准品5.00mg，置于15 mL冻存管，加入10 mL甲醇：水=7：3溶解，得到浓度为500μg/mL母液。
[0147] 17、丁螺环酮：精确称取标准品4.36mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇：水=1：1溶解，得到浓度为1985.53μg/mL母液。
[0148] 18、6‑羟基丁螺环酮：精确称取标准品2.38 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇：水=1：1溶解，得到浓度为1131 μg/mL母液。
[0149] 19、氯硝西泮：精确称取标准品2.11mg，先用1mL甲醇溶液，再用甲醇：水=1:1定容至2 mL，得到浓度为1055μg/mL的母液。
[0150] 20、舍曲林：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度1000 μg/mL。
[0151] 21、吗氯贝胺：精确称取吗氯贝胺标准品1.47 mg，置于2mL冻存管中，加入1mL稀释液（甲醇：水=7：3）溶解，得到浓度1470 μg/mL母液。
[0152] 22、舒必利：精确称取标准品2 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，得到浓度为1000 μg/mL的母液。
[0153] 23、地西泮：精确称取标准品2.02 mg，置于2 mL冻存管中，用2 mL甲醇溶解，得到浓度为1000 μg/mL的母液。
[0154] 24、去甲地西泮：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度1000 μg/mL。
[0155] 25、阿米替林：精确称取标准品4.34 mg，置于2 mL冻存管中，用2 mL甲醇溶解，得到浓度为1918 μg/mL的母液。
[0156] 26、去甲阿米替林：精确称取标准品4.24 mg，置于2 mL冻存管中，用2 mL甲醇溶解，得到浓度为1863 μg/mL的母液。
[0157] 用甲醇：水=7：3从母液稀释得到个物质中间液，中间液浓度如表8所示：
[0158] 表8
[0159] 序号 物质名称 中间液浓度（μg/mL）1 舒必利 200
2 1‑嘧啶哌嗪 40
3 去甲文拉法辛 100
4 吗氯贝胺 400
5 6‑羟基丁螺环酮 40
6 坦度螺酮 40
7 丁螺环酮 40
8 文拉法辛 400
9 米安色林 400
10 瑞波西汀 400
11 帕罗西汀 400
12 丙咪嗪 400
13 去甲丙咪嗪 400
14 氯硝西泮 100
15 阿米替林 400
16 羟嗪 400
17 去甲阿米替林 400
18 地高辛 20
19 舍曲林 400
20 去甲地西泮 1000
21 甲苯磺丁脲 100
22 地西泮 1000
23 五氟利多 320
24 格列美脲 100
25 氯吡格雷 20
26 氯吡格雷代谢物 100
2 1‑嘧啶哌嗪 40
3 去甲文拉法辛 100
4 吗氯贝胺 400
5 6‑羟基丁螺环酮 40
6 坦度螺酮 40
7 丁螺环酮 40
8 文拉法辛 400
9 米安色林 400
10 瑞波西汀 400
11 帕罗西汀 400
12 丙咪嗪 400
13 去甲丙咪嗪 400
14 氯硝西泮 100
15 阿米替林 400
16 羟嗪 400
17 去甲阿米替林 400
18 地高辛 20
19 舍曲林 400
20 去甲地西泮 1000
21 甲苯磺丁脲 100
22 地西泮 1000
23 五氟利多 320
24 格列美脲 100
25 氯吡格雷 20
26 氯吡格雷代谢物 100
[0160] 用甲醇：水=7：3从中间液稀释得到标准工作液，工作液浓度如表9所示：
[0161] 表9
[0162]
[0163] 标曲稀释过程如表10所示：
[0164] 表10
[0165] 标曲点 稀释过程 稀释液（甲醇：水7:3）L7 取L8 500μL 500μL
L6 取L7 400μL 600μL
L5 取L6 500μL 500μL
L4 取L5 500μL 500μL
L3 取L4 400μL 600μL
L2 取L3 500μL 500μL
L1 取L2 500μL 500μL
L6 取L7 400μL 600μL
L5 取L6 500μL 500μL
L4 取L5 500μL 500μL
L3 取L4 400μL 600μL
L2 取L3 500μL 500μL
L1 取L2 500μL 500μL
[0166] 获得标准工作液中各级别物质浓度如表2所示。
[0167] 实施例2
[0168] 本实施例用以说明内标工作液的配制的一种具体实施方式：
[0169] 1、氯吡格雷‑D3：精确称取氯吡格雷‑D3硫酸盐标准品1.79 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，得到浓度687.4 µg/mL的母液。
[0170] 2、氯吡格雷活性代谢物衍生物‑13C6：购买规格为1 mg，实际规格为1.059 mg，直接向样品瓶中加入1 mL甲醇溶解，得到为浓度978.45 µg/mL的母液。
[0171] 3、1‑(2‑嘧啶)哌嗪‑D8：标准品规格为2.5 mg，直接向向样品瓶中加入1 mL甲醇溶解后转移置于15 mL离心管中，再分别分4次加入1 mL甲醇溶解并将溶解液转移至15 mL离心管中，混匀后得到浓度为500 μg/mL母液。
[0172] 4、坦度螺酮‑D8：精密称量坦度螺酮‑D8标准品2.35 mg至2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，混匀后得到浓度为1175 μg/mL母液。
[0173] 5、米安色林‑D3：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度100 μg/mL。
[0174] 6、丙咪嗪‑D3：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度100 μg/mL。
[0175] 7、羟嗪‑D8：开封羟嗪‑D8标准品1 mg，准确加入甲醇1 mL，混匀后得到浓度1000 μg/mL母液。
[0176] 8、去甲丙咪嗪‑D3：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度100 μg/mL。
[0177] 9、五氟利多‑D7：购买规格为10 mg ，实际规格10.067 mg，直接向样品瓶中准确加入乙醇2 mL溶解，混匀后得到浓度为4978 μg/mL母液。
[0178] 10、阿米替林‑D3：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度100 μg/mL。
[0179] 11、去甲阿米替林‑D3：天平精确称量盐酸去甲阿米替林‑D3标准品1.58 mg至2 mL冻存管中，加入1.58 mL甲醇溶解，得到浓度为1 mg/mL母液。
[0180] 12、丁螺环酮盐酸盐‑D8：丁螺环酮盐酸盐‑D8内标1 mg，溶于5 mL甲醇：水=1：1溶液中，浓度为168.714 μg/mL的母液。
[0181] 13、6‑羟基丁螺环酮‑D8：6‑羟基丁螺环酮‑D8内标1 mg，溶于10 mL甲醇：水=1：1溶液中，浓度为100 μg/mL的母液。
[0182] 14、氯硝西泮‑D4：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度1000μg/mL。。
[0183] 15、地高辛‑D3：标准品规格为2.50 mg，直接向样品瓶中准确加入1 mL甲醇溶解，将溶解液转移至2 mL冻存管中，再加入1mL甲醇：水=1:1并转移至同一冻存管中，得到浓度1250 μg/mL的母液。
[0184] 16、文拉法辛‑D6：购买的标准品为已知浓度，体积为1 mL，溶剂为甲醇，浓度100 μg/mL。
[0185] 17、格列美脲‑D5：标准品为1 mg，以2 mL乙腈溶解，得到浓度为475 μg/mL的母液。
[0186] 18、吗氯贝胺‑D8：标准品为1 mg，以2 mL甲醇溶解，得到浓度为490 μg/mL的母液。
[0187] 19、左舒必利‑D3：标准品购买规格为1 mg，实际规格为1.03 mg，直接向样品瓶中准确加入500 μL甲醇溶解，将溶解液转移至2 mL冻存管中，再分3次加入500 μL并转移至同一冻存管中，得到浓度为515 μg/mL的母液。
[0188] 20、地西泮‑D5：标准品购买规格为1 mg，实际规格为1.00 mg，直接向样品瓶中准确加入1 mL甲醇溶解，将溶解液转移至2 mL冻存管中，得到浓度为1000 μg/mL的母液。
[0189] 用甲醇：水=7：3由内标母液稀释得到内标中间液，各物质内标母液和中间液浓度如表11所示：
[0190] 表11
[0191] 序号 物质名称 中间液或母液浓度（μg/mL）1 氯硝西泮‑D4 10
2 地高辛‑D3 1
3 氯吡格雷‑D3 1
4 氯吡格雷代谢物‑C6 10
5 格列美脲‑D5 10
6 五氟利多‑D7 320
7 丙咪嗪‑D3 100
8 去甲丙咪嗪‑D3 100
9 米安色林‑D3 10
10 坦度螺酮‑D8 1
11 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1
12 丁螺环酮‑D8 2
13 6‑羟基丁螺环酮‑D8 2
14 羟嗪‑D8 1
15 文拉法辛‑D6 100
16 吗氯贝胺‑D8 100
17 阿米替林‑D3 100
18 去甲阿米替林‑D3 100
19 地西泮‑D5 10
20 左舒必利‑D3 50
2 地高辛‑D3 1
3 氯吡格雷‑D3 1
4 氯吡格雷代谢物‑C6 10
5 格列美脲‑D5 10
6 五氟利多‑D7 320
7 丙咪嗪‑D3 100
8 去甲丙咪嗪‑D3 100
9 米安色林‑D3 10
10 坦度螺酮‑D8 1
11 1‑嘧啶哌嗪‑D8 1
12 丁螺环酮‑D8 2
13 6‑羟基丁螺环酮‑D8 2
14 羟嗪‑D8 1
15 文拉法辛‑D6 100
16 吗氯贝胺‑D8 100
17 阿米替林‑D3 100
18 去甲阿米替林‑D3 100
19 地西泮‑D5 10
20 左舒必利‑D3 50
[0192] 按照表12所示程序配制得到内标工作液：
[0193] 表12
[0194]
[0195] 内标工作液中各物质浓度如表3所示。
[0196] 实施例3
[0197] 本实施例用以说明样本处理和检测的一种具体实施方式：
[0198] 1、首先用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、内标工作液10μL和甲醇：水体积比为1:1的混合溶液80μL，分别置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀30s后，使用液相色谱质谱联用仪器（具体参数同S3）对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液，19种药物及其代谢物和内标色谱图，以上述至少三个标准溶液的各物质峰面积与对应内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中各物质浓度与对应内标浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y=a*x + b，并且得出权重系数a和b；通过计算得到待测血液样品中19种药物及其代谢物共计26个物质的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此可以计算得到该样本中待检测血液中的19种药物及其代谢物共计26个物质的浓度。
[0199] 2、检测血液的离心
[0200] 取待检测血清采血管/EDTA采血管/肝素锂采血管血液至少2mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清/EDTA血浆/肝素锂血浆，上述血清或血浆置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用。
[0201] 3、待测样品处理
[0202] 用移液枪移取实施例2制备内标工作液10μL于1.5mL离心管中，然后加入血清/血浆100μL，加入1000µL甲基叔丁基醚，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合5min，14000 r/min高速离心10 min，移取950 µL上清液至1.5 mL塑料离心管，室温条件下氮吹至干，加入100 µL甲醇：水=1：1，2000 r/min涡旋混匀1 min，14000 r/min高速离心5 min，取90 µL上清液，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述上清液进行检测，进样量5 µL。
[0203] 4、待测样品的检测
[0204] 移取步骤待测样品90μL，使用液相色谱质谱联用仪对待测样品进行检测，进样量为5μL，得出待测的样品中19种药物及其代谢物和内标色谱图；将上述色谱图中19种药物及其代谢物峰面积与内标物峰面积之比y代入上述步骤1的标准曲线方程y=a*x+b中，通过计算得到待检测样品中19种药物及其代谢物浓度与对应内标浓度之比x，内标工作液中每个物质的浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中19种药物及其代谢物浓度。
[0205] 检测参数为：
[0206] 1、高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时，具体参数如下；
[0207] 仪型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD（简称AB4500MD）；
[0208] 高效液相色谱质谱联用仪为：安捷伦LC1260/MS6470A；具体仪器参数如表13 表15~所示：
[0209] 表13
[0210]
[0211] 表14
[0212] 参数 设定值（ESI+）离子源温度（TEM） 350℃
离子源高压（IS） 5500 V
气帘气（CUR） 20 L/min
碰撞气（CAD） 8 L/min
干燥气1（GS1） 50 L/min
干燥气2（GS2） 50 L/min
离子源高压（IS） 5500 V
气帘气（CUR） 20 L/min
碰撞气（CAD） 8 L/min
干燥气1（GS1） 50 L/min
干燥气2（GS2） 50 L/min
[0213] 表15
[0214] 物质名称 保留时间/min 母离子 子离子 DP CE EP CXPSBL 0.66 342.1 112 50 80 6 10
LSBL‑D3 0.66 345.1 112 50 80 6 10
N‑WLFX 0.96 264.2 107.1 60 78 6 10
MLBA 1.00 269 138.9 69 85 6 10
MLBA‑D8 1.00 277 138.9 69 85 6 10
6‑OH‑BUS 1.09 402.4 122 120 65 6 10
6‑OH‑BUS‑D8 1.09 410.4 122 120 65 6 10
TDR 1.12 384.6 122.1 110 50 6 10
TDR‑D8 1.12 392.2 122.2 110 50 6 10
1‑PP 0.67 165.3 122 60 40 6 10
1‑PP‑D8 0.67 173.4 127 60 40 6 10
BUS 1.46 386.2 122 115 56 6 10
BUS‑D8 1.46 394.3 122 135 56 6 10
WLFX 1.91 278.3 121 60 78 6 10
WLFX‑D6 1.91 284.3 121 60 78 6 10
MASR 2.57 265.1 58.1 100 72 6 10
MASR‑D3 2.57 268.1 60.7 100 72 6 10
RBXT 3.16 314.2 176.1 70 48 6 10
PLXT 3.32 330.1 123.1 70 48 6 10
LXXP 3.42 316.2 270.1 65 48 6 10
LXXP‑D4 3.42 320.2 274.1 65 48 6 10
IPM 3.39 281.4 58 50 20 6 10
IPM‑D3 3.39 284.4 60.9 50 20 6 10
DPM 3.43 267.1 72.1 35 82 6 10
DPM‑D3 3.43 270.1 74.8 35 82 6 10
AMTL 3.51 278.1 91 65 16 6 10
AMTL‑D3 3.51 281.1 105 65 18 6 10
HOZ 3.52 375.2 201.2 58 62 6 10
HOZ‑D8 3.52 383 201 58 48 6 10
NIL 3.58 264.1 91 30 16 6 10
NIL‑D3 3.58 267.1 191.1 30 18 6 10
Digoxin 3.88 798.5 651.4 40 23 6 10
Digoxin‑D3 3.88 801.5 654.4 40 23 6 10
Ser 3.91 306 275 35 34 6 10
JBHDN 3.6 271.1 91 55 37 6 10
N‑DXP 4.22 271 165 55 70 6 10
DXP 4.42 284.9 154 135 68 6 10
DXP‑D5 4.42 289.9 154 135 58 6 10
PFRD 4.58 524.1 109 80 38 6 10
PFRD‑D8 4.58 531.1 111 80 34 6 10
GLMN 4.91 491.3 352.1 95 18 6 10
GLMN‑D5 4.91 496.3 357.1 95 18 6 10
CAMD 5.03 504.2 154.9 75 62 6 10
CAMD‑13C6 5.03 510.2 155 75 62 6 10
CLP 5.2 322.2 212 75 26 6 10
CLP‑D3 5.2 325.2 215 75 26 6 10
LSBL‑D3 0.66 345.1 112 50 80 6 10
N‑WLFX 0.96 264.2 107.1 60 78 6 10
MLBA 1.00 269 138.9 69 85 6 10
MLBA‑D8 1.00 277 138.9 69 85 6 10
6‑OH‑BUS 1.09 402.4 122 120 65 6 10
6‑OH‑BUS‑D8 1.09 410.4 122 120 65 6 10
TDR 1.12 384.6 122.1 110 50 6 10
TDR‑D8 1.12 392.2 122.2 110 50 6 10
1‑PP 0.67 165.3 122 60 40 6 10
1‑PP‑D8 0.67 173.4 127 60 40 6 10
BUS 1.46 386.2 122 115 56 6 10
BUS‑D8 1.46 394.3 122 135 56 6 10
WLFX 1.91 278.3 121 60 78 6 10
WLFX‑D6 1.91 284.3 121 60 78 6 10
MASR 2.57 265.1 58.1 100 72 6 10
MASR‑D3 2.57 268.1 60.7 100 72 6 10
RBXT 3.16 314.2 176.1 70 48 6 10
PLXT 3.32 330.1 123.1 70 48 6 10
LXXP 3.42 316.2 270.1 65 48 6 10
LXXP‑D4 3.42 320.2 274.1 65 48 6 10
IPM 3.39 281.4 58 50 20 6 10
IPM‑D3 3.39 284.4 60.9 50 20 6 10
DPM 3.43 267.1 72.1 35 82 6 10
DPM‑D3 3.43 270.1 74.8 35 82 6 10
AMTL 3.51 278.1 91 65 16 6 10
AMTL‑D3 3.51 281.1 105 65 18 6 10
HOZ 3.52 375.2 201.2 58 62 6 10
HOZ‑D8 3.52 383 201 58 48 6 10
NIL 3.58 264.1 91 30 16 6 10
NIL‑D3 3.58 267.1 191.1 30 18 6 10
Digoxin 3.88 798.5 651.4 40 23 6 10
Digoxin‑D3 3.88 801.5 654.4 40 23 6 10
Ser 3.91 306 275 35 34 6 10
JBHDN 3.6 271.1 91 55 37 6 10
N‑DXP 4.22 271 165 55 70 6 10
DXP 4.42 284.9 154 135 68 6 10
DXP‑D5 4.42 289.9 154 135 58 6 10
PFRD 4.58 524.1 109 80 38 6 10
PFRD‑D8 4.58 531.1 111 80 34 6 10
GLMN 4.91 491.3 352.1 95 18 6 10
GLMN‑D5 4.91 496.3 357.1 95 18 6 10
CAMD 5.03 504.2 154.9 75 62 6 10
CAMD‑13C6 5.03 510.2 155 75 62 6 10
CLP 5.2 322.2 212 75 26 6 10
CLP‑D3 5.2 325.2 215 75 26 6 10
[0215] 其中，由于物质种类比较多，建议采集模式为分段采集。待测物质所对应的内标如表4和表5所示。采用AB4500MD检测某一浓度工作液的色谱图如图3所示，检测质控样本的色谱图如图4所示，质控样本为阳性对照样本。
[0216] 2、安捷伦LC1260/MS6470A（简称安捷伦6470）的具体参数如表16 表18所示：~
[0217] 表16
[0218]
[0219] 表17
[0220]参数 设定值
采集模式 ESI(﹢)；MRM
雾化气温度（Gas Temp） 200℃
雾化气气流（Gas Flow） 3 L/min
鞘气温度（Sheath Gas Temp） 200℃
鞘气气流（Sheath Gas Flow） 11 L/min
雾化气压力（Nebulizer） 45 psi
毛细管电压（Capillary）（+） 5000 V
Delta‑EMV（+）： 100 V
采集模式 ESI(﹢)；MRM
雾化气温度（Gas Temp） 200℃
雾化气气流（Gas Flow） 3 L/min
鞘气温度（Sheath Gas Temp） 200℃
鞘气气流（Sheath Gas Flow） 11 L/min
雾化气压力（Nebulizer） 45 psi
毛细管电压（Capillary）（+） 5000 V
Delta‑EMV（+）： 100 V
[0221] 表18
[0222] 物质名称 保留时间/min 母离子 子离子 Dwell Fragmentor CE Cell Accelerator Voltage SBL 0.74 342 112 10 100 26 5N‑WLFX 0.98 264.2 107.1 10 100 52 5
MLBA 1.02 269 139 10 120 64 5
MLBA‑D8 1.02 277 139 10 120 64 5
6‑OH‑BUS 1.07 402.3 121.9 10 200 30 5
6‑OH‑BUS‑d8 1.07 410.3 121.9 10 200 35 5
TDR 1.09 384.6 122.2 10 180 57 5
TDR‑D8 1.09 392.6 122.3 10 180 57 5
1‑PP 1.77 165.3 122.1 10 140 17 5
1‑PP‑D8 1.77 173.4 127.1 10 140 17 5
BUS 1.36 386.2 121.9 10 170 30 5
BUS‑d8 1.36 394.3 121.9 10 200 35 5
WLFX 1.79 278.2 121.2 10 100 40 5
WLFX‑D6 1.79 284.2 121.2 10 100 40 5
MASR 2.48 265.1 58.1 10 130 56 5
MASR‑D3 2.48 268.1 60.7 10 130 56 5
RBXT 3.44 314.2 176.1 10 100 30 5
PLXT 3.59 330.2 123.1 10 135 34 5
Lxxp 3.61 316.2 270.1 10 160 25 5
Lxxp‑D4 3.61 320.2 274.1 10 160 25 5
IPM 3.65 281.3 57.9 10 180 100 5
IPM‑D3 3.65 284.3 60.9 10 180 100 5
DPM 3.70 267.3 72.1 10 135 47 5
DPM‑D3 3.70 270.3 74.8 10 135 47 5
AMTL 3.76 278.1 90.7 10 135 28 5
AMTL‑D3 3.76 281.1 104.8 10 135 24 5
HOZ 3.77 375.3 201.2 10 100 40 5
HOZ‑D8 3.77 383 201 10 100 40 5
NIL 3.82 264.1 91 10 100 25 5
NTL‑D3 3.82 267.1 191.1 10 100 24 5
Digoxin 3.90 798.5 651.4 10 100 11 5
Digoxin‑D3 3.90 801.5 654.4 10 100 11 5
Ser 4.00 306.1 275 10 80 22 5
JBHDN 4.19 271.1 91.1 10 145 66 5
N‑DXP 4.20 271 165.1 10 140 36 5
DXP 4.40 285 154.1 10 135 46 5
PFRD 4.68 524.5 109.4 10 180 82 5
PFRD‑D7 4.68 531.5 111.2 10 180 82 5
GLMN 5.33 491.3 352.3 10 110 10 5
GLMN‑D5 5.33 496.3 357.3 10 110 10 5
CAMD 5.70 504 154.9 10 85 45 5
CAMD‑13C6 5.70 510 155 10 85 45 5
CLP 5.78 322.1 212 10 100 15 5
CLP‑D3 5.78 325.1 215 10 100 15 5
MLBA 1.02 269 139 10 120 64 5
MLBA‑D8 1.02 277 139 10 120 64 5
6‑OH‑BUS 1.07 402.3 121.9 10 200 30 5
6‑OH‑BUS‑d8 1.07 410.3 121.9 10 200 35 5
TDR 1.09 384.6 122.2 10 180 57 5
TDR‑D8 1.09 392.6 122.3 10 180 57 5
1‑PP 1.77 165.3 122.1 10 140 17 5
1‑PP‑D8 1.77 173.4 127.1 10 140 17 5
BUS 1.36 386.2 121.9 10 170 30 5
BUS‑d8 1.36 394.3 121.9 10 200 35 5
WLFX 1.79 278.2 121.2 10 100 40 5
WLFX‑D6 1.79 284.2 121.2 10 100 40 5
MASR 2.48 265.1 58.1 10 130 56 5
MASR‑D3 2.48 268.1 60.7 10 130 56 5
RBXT 3.44 314.2 176.1 10 100 30 5
PLXT 3.59 330.2 123.1 10 135 34 5
Lxxp 3.61 316.2 270.1 10 160 25 5
Lxxp‑D4 3.61 320.2 274.1 10 160 25 5
IPM 3.65 281.3 57.9 10 180 100 5
IPM‑D3 3.65 284.3 60.9 10 180 100 5
DPM 3.70 267.3 72.1 10 135 47 5
DPM‑D3 3.70 270.3 74.8 10 135 47 5
AMTL 3.76 278.1 90.7 10 135 28 5
AMTL‑D3 3.76 281.1 104.8 10 135 24 5
HOZ 3.77 375.3 201.2 10 100 40 5
HOZ‑D8 3.77 383 201 10 100 40 5
NIL 3.82 264.1 91 10 100 25 5
NTL‑D3 3.82 267.1 191.1 10 100 24 5
Digoxin 3.90 798.5 651.4 10 100 11 5
Digoxin‑D3 3.90 801.5 654.4 10 100 11 5
Ser 4.00 306.1 275 10 80 22 5
JBHDN 4.19 271.1 91.1 10 145 66 5
N‑DXP 4.20 271 165.1 10 140 36 5
DXP 4.40 285 154.1 10 135 46 5
PFRD 4.68 524.5 109.4 10 180 82 5
PFRD‑D7 4.68 531.5 111.2 10 180 82 5
GLMN 5.33 491.3 352.3 10 110 10 5
GLMN‑D5 5.33 496.3 357.3 10 110 10 5
CAMD 5.70 504 154.9 10 85 45 5
CAMD‑13C6 5.70 510 155 10 85 45 5
CLP 5.78 322.1 212 10 100 15 5
CLP‑D3 5.78 325.1 215 10 100 15 5
[0223] 其中，由于物质种类比较多，建议采集模式为分段采集。待测物质所对应的内标如表6和表7所示。采用安捷伦6470检测某一浓度工作液的色谱图如图1所示，检测质控样本的色谱图如图2所示，质控样本为阳性对照品。
[0224] 实施例4
[0225] 本实施例提出液相色谱串联质谱检测血液中19种药物及其代谢产物的试剂盒。试剂盒的组成如表19所示：
[0226] 表19
[0227] 编号 名称 组成 1人份体积1 内标工作液 表3所示 /
2 标准工作液 表2所示 /
3 萃取剂 甲基叔丁基醚 1000μL
4 复溶液 体积比为1:1甲醇：水混合溶液 100μL
5 阳性及阴性对照品 阳性对照品为加标质控品； 阴性对照品为体积比为7:3的甲醇：水 /
6 色谱柱流动相 A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇 / [0228] 实验例1
2 标准工作液 表2所示 /
3 萃取剂 甲基叔丁基醚 1000μL
4 复溶液 体积比为1:1甲醇：水混合溶液 100μL
5 阳性及阴性对照品 阳性对照品为加标质控品； 阴性对照品为体积比为7:3的甲醇：水 /
6 色谱柱流动相 A为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的水；B为含有0.1 v/v%甲酸和5mM甲酸铵的甲醇 / [0228] 实验例1
[0229] 一、该方法的线性关系和定量限
[0230] 将实施例1和实施例2配制的10μL的各个浓度的19种药物其代谢物标准工作液，加入10μL内标工作液，并加入90μL空白血清/血浆混匀进样，按实施例3测定条件浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积‑浓度作图，得到标准曲线，结果表明19种药物及其代谢物的线性范围和定量限如下：
[0231] 1、检测限（LOD）和定量限（LOQ）：
[0232] HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD的检测限（LOD）和定量限（LOQ）如表20所示：
[0233] 表20
[0234]物质名称 定量限（ng/mL） 检出限（ng/mL）
舒必利 1.25 0.42
去甲文拉法辛 0.50 0.17
吗氯贝胺 2.00 0.67
6‑羟基丁螺环酮 0.10 0.03
坦度螺酮 0.10 0.03
1‑嘧啶哌嗪 0.10 0.03
丁螺环酮 0.05 0.02
文拉法辛 2.50 0.83
米安色林 0.20 0.07
瑞波西汀 1.00 0.33
帕罗西汀 0.50 0.17
氯硝西泮 0.50 0.17
丙咪嗪 1.00 0.33
去甲丙咪嗪 1.00 0.33
阿米替林 0.50 0.17
羟嗪 0.10 0.03
去甲阿米替林 0.50 0.17
地高辛 0.10 0.03
舍曲林 0.40 0.13
甲苯磺丁脲 0.50 0.17
去甲地西泮 2.00 0.67
地西泮 2.00 0.67
五氟利多 0.80 0.27
格列美脲 0.05 0.02
氯吡格雷代谢物 0.10 0.03
氯吡格雷 0.02 0.01
舒必利 1.25 0.42
去甲文拉法辛 0.50 0.17
吗氯贝胺 2.00 0.67
6‑羟基丁螺环酮 0.10 0.03
坦度螺酮 0.10 0.03
1‑嘧啶哌嗪 0.10 0.03
丁螺环酮 0.05 0.02
文拉法辛 2.50 0.83
米安色林 0.20 0.07
瑞波西汀 1.00 0.33
帕罗西汀 0.50 0.17
氯硝西泮 0.50 0.17
丙咪嗪 1.00 0.33
去甲丙咪嗪 1.00 0.33
阿米替林 0.50 0.17
羟嗪 0.10 0.03
去甲阿米替林 0.50 0.17
地高辛 0.10 0.03
舍曲林 0.40 0.13
甲苯磺丁脲 0.50 0.17
去甲地西泮 2.00 0.67
地西泮 2.00 0.67
五氟利多 0.80 0.27
格列美脲 0.05 0.02
氯吡格雷代谢物 0.10 0.03
氯吡格雷 0.02 0.01
[0235] 安捷伦LC1260/MS6470A的检测限（LOD）和定量限（LOQ）如表21所示：
[0236] 表21
[0237]物质名称 定量限（ng/mL） 检出限（ng/mL）
舒必利 1.25 0.42
去甲文拉法辛 0.02 0.007
吗氯贝胺 2.00 0.67
6‑羟基丁螺环酮 0.03 0.01
坦度螺酮 0.03 0.01
1‑嘧啶哌嗪 0.02 0.007
丁螺环酮 0.045 0.015
文拉法辛 0.63 0.21
米安色林 0.36 0.12
瑞波西汀 1.36 0.45
帕罗西汀 0.65 0.22
氯硝西泮 0.40 0.13
丙咪嗪 1.32 0.44
去甲丙咪嗪 1.42 0.47
阿米替林 1.06 0.35
羟嗪 0.24 0.08
去甲阿米替林 0.96 0.32
地高辛 0.03 0.01
舍曲林 0.68 0.23
甲苯磺丁脲 0.02 0.007
去甲地西泮 1.45 0.48
地西泮 1.56 0.52
五氟利多 0.12 0.04
格列美脲 0.03 0.01
氯吡格雷代谢物 0.12 0.04
氯吡格雷 0.03 0.01
舒必利 1.25 0.42
去甲文拉法辛 0.02 0.007
吗氯贝胺 2.00 0.67
6‑羟基丁螺环酮 0.03 0.01
坦度螺酮 0.03 0.01
1‑嘧啶哌嗪 0.02 0.007
丁螺环酮 0.045 0.015
文拉法辛 0.63 0.21
米安色林 0.36 0.12
瑞波西汀 1.36 0.45
帕罗西汀 0.65 0.22
氯硝西泮 0.40 0.13
丙咪嗪 1.32 0.44
去甲丙咪嗪 1.42 0.47
阿米替林 1.06 0.35
羟嗪 0.24 0.08
去甲阿米替林 0.96 0.32
地高辛 0.03 0.01
舍曲林 0.68 0.23
甲苯磺丁脲 0.02 0.007
去甲地西泮 1.45 0.48
地西泮 1.56 0.52
五氟利多 0.12 0.04
格列美脲 0.03 0.01
氯吡格雷代谢物 0.12 0.04
氯吡格雷 0.03 0.01
[0238] （3）线性范围：
[0239] 舒必利：10ng/mL到2000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0240] 1‑嘧啶哌嗪：0.2 ng/mL到40.0 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0241] 去甲文拉法辛：5ng/mL到1000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0242] 吗氯贝胺：20ng/mL到4000 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0243] 6‑羟基丁螺环酮：0.2ng/mL到40.0ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0244] 坦度螺酮：0.2ng/mL到40.0ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0245] 丁螺环酮：0.2ng/mL到40.0ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0246] 文拉法辛：10ng/mL到2000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0247] 米安色林：2 ng/mL到400ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0248] 瑞波西汀：10ng/mL到2000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0249] 帕罗西汀：2 ng/mL到400 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0250] 丙咪嗪：10 ng/mL到2000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0251] 去甲丙咪嗪：10ng/mL到2000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0252] 氯硝西泮：1ng/mL到200ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0253] 阿米替林：10ng/mL到2000 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0254] 羟嗪：2 ng/mL到400ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0255] 去甲阿米替林：10ng/mL到2000 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0256] 地高辛：0.1ng/mL到20.0ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0257] 舍曲林：2ng/mL到400ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0258] 去甲地西泮：20ng/mL到4000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0259] 甲苯磺丁脲：0.5 ng/mL到100.0 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0260] 地西泮：20ng/mL到4000ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0261] 五氟利多：1.6ng/mL到320.0 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0262] 格列美脲：0.5ng/mL到100.0 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0263] 氯吡格雷：0.1ng/mL到20.0 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0264] 氯吡格雷代谢物：0.5ng/mL到100.0 ng/mL；线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
[0265] 二、该方法的回收率和精密度
[0266] 取19种药物及其代谢物标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例3方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如下表22和表23。19种药物及其代谢物在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为85% ~105%，相对标准偏差为0.00% 8.33%。
~
~
[0267] 表22 HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD回收率结果
[0268]
[0269]
[0270]
[0271] 表23安捷伦LC1260/MS6470A回收率结果
[0272]
[0273]
[0274]
[0275] 综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中19种药物及其代谢物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
[0276] 对比例1
[0277] 本对比例用以说明萃取剂为甲基叔丁基醚的技术效果。
[0278] 实验设计：采用实施例3中的方法对样本进行检测，区别在于：前处理方式采用液液萃取而不是蛋白沉淀。获得实验结果：直接蛋白沉淀，地高辛信号太低，不能达到定量要求。
[0279] 对比例2
[0280] 本对比例用以说明流动相和梯度洗脱条件的技术效果。
[0281] 实验设计：采用实施例3中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0282] 1、安捷伦6470梯度洗脱条件为：
[0283] 0 1.0分钟：A 50%，B 50%；~
[0284] 1.50 3.50分钟：A 20%，B 80%；~
[0285] 4.00 5.50分钟：A 0%，B 100%；~
[0286] 5.51 7.5 分钟：A 50%，B 50%；~
[0287] 流速为：0.3 mL/分钟。
[0288] 得到的试验结果如图5 图8所示。由图5所示，米安色林拖尾；由图6所示，瑞波西汀~拖尾；由图7所示，帕罗西汀拖尾；由图8所示，丙咪嗪拖尾。
[0289] 采用本发明的梯度洗脱条件，得到的试验结果如图9 图12所示。米安色林拖尾情~况得到改善结果如图9所示，瑞波西汀拖尾情况得到改善结果如图10所示，帕罗西汀拖尾情况得到改善结果如图11所示，丙咪嗪拖尾情况得到改善结果如图12所示。
[0290] 2、AB4500MD梯度洗脱条件为：
[0291] 0 1分钟：A 60%，B 40%；~
[0292] 1.01 2.5分钟：A 40%，B 60%；~
[0293] 2.51 5分钟：A 0%，B 100%；~
[0294] 5.01 6分钟：A 60%，B 40%；~
[0295] 流速为：0.3mL/分钟。
[0296] 得到的试验结果如图13所示。由图13可知，在该洗脱条件下：氯吡格雷代谢物内标与杂质分不开。
[0297] 用本发明的梯度洗脱条件，得到的试验结果如图14所示，由图14可知，该洗脱条件下，氯吡格雷代谢物内标与杂质可以有效分离。
[0298] 3、流动相：
[0299] 高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6470A时，修改流动相为：水（0.1%甲酸+4mM甲酸胺）/甲醇（0.1%甲酸+4mM甲酸胺），其余条件同本发明实施例，得到试验结果如表24：
[0300] 表24
[0301]
[0302] 由表24可知，缓冲盐浓度有轻微改变，甲苯磺丁脲回收率为120%，回收率不合格。由于低浓度加标量出现该现象，确定在上述缓冲盐浓度下甲苯磺丁脲回收率结果不合格。
[0303] 以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。