一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌及其应用

摘要

本发明涉及污水处理技术领域，公开了一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌及其应用。所述植物乳杆菌命名为CR3，已在2021年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22011，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。本发明的植物乳杆菌CR3能水解七叶苷，继而产生黑色物质，且对废水毒性的耐受性适宜，能通过显色深浅直观地反映出废水毒性的强弱，显色明显且稳定，因而能用于源头废水生物毒性检测。

权利要求

1. 一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌命名为CR3，已在2021年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22011，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。

2.一种含有如权利要求1所述植物乳杆菌的菌体培养物。

3.如权利要求2所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

4.如权利要求1所述植物乳杆菌在源头废水生物毒性检测中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将胰蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铁和七叶苷加入水中，混合均匀后，配制成培养基；

（2）将废水加入培养基中，制成混合体系；将所述植物乳杆菌接种到混合体系中，制成培养体系；

（3）将培养体系进行培养，观察显色情况，若不显黑色，则废水不能直接进入后端生化处理系统，若显黑色，则废水能直接进入后端生化处理系统。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述混合体系中，废水的体积分数为25‑35%；所述植物乳杆菌在混合体系中的接种量为0.1‑0.34g/L。

说明书

一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及污水处理技术领域，尤其涉及一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 随着我国工业的迅速发展，水体中污染物的种类也越来越复杂。许多特殊污染物在浓度达到一定阈值后会对废水的生物处理造成抑制作用甚至是毁灭性破坏，如重金属、氯代苯胺、氰化物、硝基苯等，仅仅用COD、BOD、TN、TP等常规水质指标不能客观、准确地评价废水的水质情况，所以仅仅按照常规水质指标进行分质分流已不能满足目前工业废水处理的现状，需要进行基于废水毒性的源头分质分流。

[0003] 生物毒性检测技术(Bio‑toxicity Tests)是通过评价物质对生物的应以综合评价其毒性的方法。相较于理化方法而言，生物方法可评价废水中未知有毒有害污染物对生物的影响，并能反映废水中众多污染物间复杂的相互作用和污染物的生物可利用性，因而在废水毒性控制和管理中发挥重要作用，可用于寻找某种化学物质或工业废水对生物的安全浓度，为制定合理的水质标准和废水排放标准提供科学依据，也可用于评价废水处理的有效程度，筛选合适的工业废水毒性削减技术。

[0004] 在工业废水处理中，常规活性污泥是必备处理单元，活性污泥本质是微生物，故在开发适用于工业废水对后端常规活性污泥处理系统的毒性检测技术时，细菌法是最适合的。MIC(Minimum inhibitory concentration，最低抑制浓度)是指能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度，原本运用于药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗；同时也是衡量抗生素对各类致病菌药效的传统手段。将MIC生物毒性检测技术运用于废水生物毒性检测中，通过将废水梯度稀释，混合在细菌培养基中培养一段时间后，找到能抑制培养基内细菌生长的最低废水浓度，能够判定废水对微生物的毒性大小。例如，专利CN201910403966.2公开了一种基于MIC毒性检测技术的制药废水的区别化管理方法，采用+
在活性污泥中丰度占比第一的G 菌和G‑菌的标准菌株，通过观察两种菌株在不同稀释度废水中的生长情况，能够判断废水毒性，但菌株的生长情况只能通过菌株在废水中的丰度反映，难以直观地观察。

发明内容

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌及其应用。本发明的植物乳杆菌CR3能水解七叶苷，继而产生黑色物质，且对废水毒性的耐受性适宜，能通过显色深浅直观地反映出废水毒性的强弱，显色明显且稳定，因而能用于源头废水生物毒性检测。

[0006] 本发明的具体技术方案为：

[0007] 第一方面，本发明提供了一株用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌命名为CR3，已在2021年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22011，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。

[0008] 植物乳杆菌CR3易于培养，能分泌七叶苷水解酶，将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与铁离子反应后生成黑色的化合物，植物乳杆菌CR3数量越多，黑色越深，通过这种方式，能通过观察显色深浅，直观地反映出废水对植物乳杆菌CR3的抑制作用强弱。并且，植物乳杆菌CR3对废水毒性的耐受性适宜，能体现出废水毒性的强弱，显色明显且稳定。因此，本发明的植物乳杆菌CR3能用于源头废水生物毒性检测中，根据培养体系的显色情况，判断废水毒性强弱，进而判断废水能否直接进入后端生化处理系统(通常是通入后端综合调节池中，经综合调节池处理后的废水进行进一步的毒性检测，检测合格后通入活性污泥处理单元等微生物处理单元)。

[0009] 第二方面，本发明提供了一种用于源头废水生物毒性检测的植物乳杆菌的突变体，所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

[0010] 第三方面，本发明提供了一种含有所述植物乳杆菌或含有所述突变体的菌体培养物。

[0011] 作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

[0012] 第四方面，本发明提供了所述植物乳杆菌或所述突变体在源头废水生物毒性检测中的应用。

[0013] 作为优选，所述应用包括以下步骤：

[0014] (1)将胰蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铁和七叶苷加入水中，混合均匀后，配制成培养基；

[0015] (2)将废水加入培养基中，制成混合体系；将所述植物乳杆菌或所述突变体接种到混合体系中，制成培养体系；

[0016] (3)将培养体系进行培养，观察显色情况，若不显黑色，则废水不能直接进入后端生化处理系统，若显黑色，则废水能直接进入后端生化处理系统。

[0017] 作为优选，步骤(2)中，所述混合体系中，废水的体积分数为25‑35％；所述植物乳杆菌或所述突变体在混合体系中的接种量为0.1‑0.34g/L。

[0018] 根据经验，将废水浓度25‑35％(即稀释后废水体积占总体积的25‑35％)作为废水判断为毒性程度较高的临界点，优选为废水浓度30％。即，当MIC小于25‑35％时，废水为高毒，对后端生化处理系统的影响较大，不能直接进入后端生化处理系统；当MIC大于25‑35％时，废水为非高毒，对后端生化处理系统的影响较小，可直接进入后端生化处理系统。

[0019] 植物乳杆菌CR3在接种量为0.1‑0.34g/L的情况下，当废水浓度25‑35％时，能区别高毒废水与非高毒废水，即，在废水浓度25‑35％下培养，高毒废水不显黑色，而非高毒废水显黑色。因此，本发明的植物乳杆菌CR3能应用于源头废水生物毒性检测中，根据其在废水浓度25‑35％下培养时的显色情况，能够判断废水能否直接进入后端生化处理系统。

[0020] 此外，当在常规的乳酸菌培养基中加入七叶苷和柠檬酸铁，对植物乳杆菌CR3进行培养时，培养体系无法显色，说明常规的乳酸菌培养基不能用于源头废水生物毒性检测。为此，本发明创新了培养基配方，当采用该培养基对植物乳杆菌CR3进行培养时，培养体系能够显色，因而能用于源头废水生物毒性检测。

[0021] 作为优选，步骤(1)中，所述培养基中，胰蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铁和七叶苷的浓度分别为3.3‑10g/L、1.67‑5g/L、0.5‑0.6g/L和1‑1.2g/L，进一步优选为3.3g/L、1.67g/L、0.5g/L和1g/L。

[0022] 培养基中各成分的浓度过高或过低均会对源头废水生物毒性检测造成影响，具体而言：当浓度过低时，培养体系无法显色，导致其无法反映废水毒性的强弱；当浓度过高时，培养基中含有的营养成分过多，会掩盖废水中的营养成分含量对菌株生长的影响。因此，本发明将胰蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铁和七叶苷的浓度分别设置为3.3‑10g/L、1.67‑5g/L、0.5‑0.6g/L和1‑1.2g/L，在上述范围内，培养体系能够显色；进一步优选为3.3g/L、1.67g/L、0.5g/L和1g/L，在该浓度下，培养基中营养成分含量较低，不会掩盖废水中的营养成分含量对菌株生长的影响。

[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0024] (1)本发明的植物乳杆菌CR3能水解七叶苷，继而产生黑色物质，且对废水毒性的耐受性适宜，能通过显色深浅直观地反映出废水毒性的强弱，显色明显且稳定，因而便于源头废水生物毒性检测；

[0025] (2)本发明的前端废水生物毒性检测方法能够以废水浓度25‑35％作为废水判断为毒性程度较高的临界点，区分高毒废水与非高毒废水，据此判断废水能否直接进入后端生化处理系统。

具体实施方式

[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

[0027] 实施例1：不同菌种的显色程度

[0028] 通过资料调查，具有七叶苷水解酶活性的典型菌种为肠球菌。肠球菌为致病菌，不适合使用。肠球菌在微生物分类上属于乳酸菌目(Lactobacillales)，推测乳酸菌目菌种可能具有相似生化特点，故将模式菌种关注在乳酸菌上。

[0029] 选择8株不同来源的乳酸菌和粪肠球菌、大肠杆菌作为受试菌，按照1％(即0.1g/L)的接种量将各菌株菌粉分别接种至2种含显色剂七叶苷的营养培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h，观察显色情况，结果见表1。

[0030] 培养基1的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物(YE)5g/L，柠檬酸铁0.5g/L，七叶苷1g/L，溶剂为水；pH＝6.2±0.2。

[0031] 培养基2的配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，YE 4g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸三胺2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.05g/L，吐温80 1g/L，柠檬酸铁0.5g/L，七叶苷1g/L，溶剂为水；pH＝6.2±0.2。

[0032] 表1不同菌种显色程度大小

[0033]

[0034] 根据表1可知：

[0035] (1)培养基1为发明人设计的培养基，培养基2为常规的乳酸菌培养基。菌株1#‑8#在培养基2中均不显色，说明常规的乳酸菌培养基不能在源头废水生物毒性检测中作为乳酸菌的培养基使用(可能是由于培养基2中存在一些显色抑制物)。

[0036] (2)不同菌种在培养基1中显色程度各有不同，1#‑8#和粪肠球菌为革兰氏阳性菌，均能显色，1#、6#、7#、8#显色明显，11#为革兰氏阴性菌不显色，故1#、6#、7#、8#可作为拟模式菌株。

[0037] 实施例2：盐度对菌株生长量的影响

[0038] 向培养基1中分别加入不同量的NaCl，按照1g/L的接种量接入各菌株菌粉后，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h，观察菌种生长情况，并用分光光度计定量测定波长600nm下菌液的浊度，结果见表2。

[0039] 表2盐度对菌种生长量的影响

[0040]

[0041] 模式菌株需满足：在常规盐度范围(≤3wt％)内，可正常生长且显色；即该系列技术不可表征常规盐度范围(≤3wt％)内的毒性。

[0042] 根据表2可知：盐度的加入会对菌种生长有比较明显的影响，在0‑3wt％盐度范围内，1#菌株与5#菌株的生长量始终排在前列，故1#、5#菌株可作为拟模式菌株。

[0043] 实施例3：有机物及无机离子对显色的影响

[0044] 向培养基1中分别加入培养基2内可能对显色有影响的各类物质，按照1g/L的接种量接入各菌株菌粉后，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h，观察显色情况，结果见表3。

[0045] 表3各物质对菌种显色的影响

[0046]

[0047] 根据表3可知：葡萄糖的加入会明显抑制显色，乙酸钠的加入对显色有益，故本发明的检测技术需警惕水样中是否含有葡萄糖和乙酸钠。硫酸镁和硫酸锰对1#菌株和8#菌株几乎无影响，故1#、8#菌株可作为拟模式菌株。

[0048] 实施例4：废水浓度对显色的影响

[0049] 结合实施例2和实施例3的结果，优选出4种菌株：1#、2#、6#、8#。在培养基1中加入不同含量的废水，使废水在体系中终含量为10％、30％、50％(v/v)，按照1g/L的接种量向其中分别接种1#、2#、6#和8#菌株菌粉，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h后，观察显色情况，结果见表4。

[0050] 表4四株菌种的废水MIC结果

[0051] 序号 10％ 30％ 50％1# ++ + ‑
2# ++ + ‑
6# ++ ‑ ‑
8# ++ ‑ ‑

[0052] 注：“+”代表显色，“‑”代表不显色。

[0053] 根据表4可知：1#、2#、6#、8#菌株均能体现出废水毒性的强弱。

[0054] 实施例5：菌株鉴定

[0055] 综合实施例1‑4的结果，1#菌株显色明显，生长量最大，显色较稳定，并能体现出废水毒性的强弱。后续通过大量废水试验表明，1#菌检测各类废水的毒性与实验室前期检测结果基本一致。故选择1#菌株作为模式菌株。

[0056] 对1#菌株进行16S rRNA测序，并与GenBank中的已知的16S rRNA基因进行最高同源性比对。经鉴定，1#菌株属于植物乳杆菌，将其命名为CR3。

[0057] 实施例6：乙酸钠对1#菌株废水MIC结果的影响

[0058] 分别在含七叶苷和不含七叶苷的培养基1中加入5g/L的乙酸钠，获得2种培养基；选取3个有代表性的废水(LP3#、LP24#和LP27#)，在两种培养基中加入不同含量的废水，使废水在体系中终含量为10％、30％、50％(v/v)，按照1g/L的接种量向其中接种1#菌株菌粉，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h后，观察不含七叶苷的培养体系中的细菌生长情况以及含七叶苷的培养体系中的显色情况，并与常规MIC法(即专利CN201910403966.2中的方法)的结果进行比较，结果见表5。

[0059] 表5乙酸钠的加入对1#菌废水MIC检测结果的影响

[0060]

[0061] 注：“+”代表菌株生长，“‑”代表菌株不生长。

[0062] 根据表5可知：乙酸钠的加入会改变废水MIC检测的毒性结果，导致1#菌株无法准确体现废水毒性的强弱，故虽然乙酸钠对显色有益，后续仍不考虑在培养基中加入乙酸钠。

[0063] 实施例7：菌粉添加量的优化

[0064] 选取2个有代表性的废水(LP1#和LP2#)，在培养基1中加入不同含量的废水，使废水在体系中终含量为10％、30％、50％(v/v)，；分别向混合体系中加入不同量的1#菌株菌液，获得菌浓度分别为1.0g/L、1.7g/L、3.4g/L的培养体系；将培养体系置于30℃恒温振荡培养箱培养24h后，观察显色情况，结果见表6。

[0065] 表6不同菌粉添加量的实验结果

[0066]  LP1#废水 LP2#废水
常规MIC法结果 10％+，30％‑，50％‑ 10％+，30％‑，50％‑
菌浓度1.0g/L 30％黑偏绿，50％微绿 30％黑偏绿，50％微绿
菌浓度1.7g/L 30％黑偏绿，50％微绿 30％黑偏绿，50％微绿
菌浓度3.4g/L 30％黑，50％绿 30％黑，50％绿

[0067] 注：“+”代表菌株生长，“‑”代表菌株不生长。

[0068] 根据表6可知：在三种浓度下，废水毒性均与常规结果不一致，MIC值偏高，说明菌粉浓度过高。故进一步稀释了菌粉混合液，进行了减少菌粉浓度后的探究实验，实验结果如表7所示。

[0069] 表7不同菌粉添加量的实验结果

[0070]  LP1#废水 LP2#废水
常规MIC结果 10％+，30％‑ 10％+，30％‑
菌浓度0.1g/L 10％黑偏绿，30％微绿 110％黑偏绿，30％微绿
菌浓度0.17g/L 10％黑偏绿，30％微绿 10％黑偏绿，30％微绿
菌浓度0.34g/L 10％黑，30％绿 10％黑，30％绿

[0071] 注：“+”代表菌株生长，“‑”代表菌株不生长。

[0072] 根据表7可知：在三种浓度下，废水毒性均与常规结果一致，故本发明中菌粉的接种量可为0.1‑0.34g/L。

[0073] 实施例8：培养基各组分浓度的优化

[0074] 将培养基1中的各组分浓度进行不同程度的调整，获得9种不同的培养基，按照0.1g/L的接种量接种1#菌株菌粉，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h后，观察显色情况，实验结果见表8。

[0075] 表8培养基中各组分浓度改变后的显色结果

[0076]

[0077] 根据表8可知：采用实验组1和2的两种培养基培养1#菌株，能够显黑色，因此，在采用1#的源头废水生物毒性检测中，可选择这两种培养基。优选为实验组2的培养基，原因在于：实验组1的培养基中营养成分含量较大，易覆盖废水中的营养成分对1#菌株生长的影响。

[0078] 实施例9：源头废水生物毒性检测

[0079] 采用实施例8中实验组2的培养基，对LP1#、LP2#、LP3#、LP24#和LP27#废水进行稀释后，获得废水浓度分别为10％、30％和50％的混合体系，按0.1g/L、0.17g/L和0.34g/L的接种量向混合体系中接种1#菌株菌粉，置于30℃恒温振荡培养箱培养24h后，观察显色情况，并与常规MIC法结果对比，结果见表9。

[0080] 表9菌浓度改变后废水毒性检测显色结果

[0081]

[0082] 注：在常规MIC法中，“+”代表菌株生长，“‑”代表菌株不生长；在本发明的方法中，“+”代表显色，“‑”代表不显色。

[0083] 根据表9可知：当采用实施例8中实验组2的培养基配方，且1#菌株接种量为0.1‑0.34g/L时，检测结果与常规MIC法相同，说明上述培养基配方和接种量能用于源头废水生物毒性检测。

[0084] 本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0085] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。