一种蛹虫草规模化生产方法与应用转让专利
申请号 : CN202111675263.9
文献号 : CN114431070B
文献日 : 2022-11-25
发明人 : 陈玉皎 , 王贵学 , 钟莉 , 王瑾瑄 , 曹军
申请人 : 重庆大学
摘要 :
本发明涉及蛹虫草生产及应用技术领域，具体涉及一种蛹虫草的规模化生产方法与应用，本发明以家蚕蛹虫草海宁株为菌种，采用组织复壮后获得栽培母种，进一步经过固体培养转液体扩增制备栽培菌液，接种后培养获得子实体中虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷、麦角甾醇含量均较高的蛹虫草；通过控制生产过程中各环节的技术要点及关键参数，设计基于固体培养基的蛹虫草子实体规模生产，实现了规模化生产，生产过程简单易行，参数易控制，且能够获得活性好的有效成分，并且有效成分通过特异性调节雌二醇代谢发挥抗肺癌作用、特异性调控甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的表达发挥抗肝癌作用。
权利要求 :
1.一种蛹虫草的规模化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一蛹虫草海宁株C. militaris 菌种选育
1）选种：选择生长健壮、没有冷凝水或有冷凝水且水珠澄清透明、子实体根部无白色气生菌丝的长到2 3cm高的家蚕蛹虫草海宁株子实体；
~
2）菌种培育：在无菌环境中，采用无菌接菌钩，钩断子实体根，取出子实体，置于灭菌的纱布上，用无菌镊子夹住子实体根部，依次通过75%酒精擦拭子实体表面、无菌水清洗其表面残留的酒精、无菌手术刀去除子实体的表皮，再选取子实体顶端1 1.5cm长的部位，每1cm~分成3 5粒，用无菌接种钩将子实体小粒置于PDA固体培养基上，子实体粒间隔约3.5cm，在~
22℃生化培养箱内遮光倒置培养至出现菌丝；
3）菌种纯化：在无菌环境中，用接种环选取菌种培育环节获得的一环菌丝、采用连续平板划线进行菌种分离和纯化，在21 23℃生化培养箱内倒置培养至菌丝长到高度约0.5cm；
~
步骤二菌种制备
按照每120mL液体培养基接种量为1cm×1cm的比例，用无菌手术刀挑取步骤一的菌种纯化所得的平板单菌落并切碎，迅速转接于锥形瓶内的液体培养基中，轻摇使菌种均匀分布，扎紧瓶口，于震荡摇床中22℃、170rpm、避光培养，待菌丝呈雪白色、均匀、浓密、穿透力强、无异味，且菌落生长大于培养基平面的1/2面积，即为质量合格的可栽培的菌种；
步骤三栽培
1）发菌初期培养：采用全自动开盖、接种和复盖一体机，向培养瓶中迅速注入2mL菌液后加盖，在温度为15 18℃、空气相对湿度为63 68%条件下黑暗培养3 5天，保留菌丝呈雪白~ ~ ~色，长势均匀、浓密、穿透力强、无异味的继续培养至菌丝全部长满整个培养基，当料面产生数量不等、大小不一的多个圆丘状隆起时，即进入光培养菌株分化前期进行培养；所述培养瓶中装有40g菌种栽培培养基，高约2cm；
2）菌株分化前期培养：将培养瓶置于温度为18℃ 23℃，空气相对湿度≥85%，光照强度~为200 250Lx的条件下进行光培养3 10天，至培养基料面菌丝逐渐由白色变为橘黄色后，继~ ~续培养1 3天即可进入原基期；在光培养过程中每天光照12h以上，但不能连续照射，保证每~日6h黑暗培养，防止太阳光直射；
3）菌株分化原基期培养：在空气相对湿度为68 72%条件下，采用温差刺激进行培养10~
天，即可形成原基，待大量原基形成后保持温度为20 23℃，空气相对湿度逐渐加大至85%~ ~
90%，光照时间延长至15h；继续培养1 3天，原基顶端开始出现椎状子实体即可进入子实体~生长前期；所述温差刺激分为白昼和夜晚两部分，白昼温度为18 23℃，光照强度为50~ ~
100Lx，时间12‑14h；夜晚温度为5‑8℃，时间为6‑10h；
4）子实体生长前期：生长前期子实体呈橘黄色，高1 2cm，将其置于温度为22℃ 25℃，~ ~空气相对湿度为85% 90%的环境中，每天采用散射光或日光灯进行不连续光照500Lx照射~
18h，培养20 30天，子实体高2 4cm，呈长圆锥形时，即可转入子实体生长后期；
~ ~
5）子实体生长后期：在温度为20 23℃，空气相对湿度为85% 90%，光照强度1000Lx条件~ ~下培养10 20天，且每日光照时间为18h，至子实体不再增粗、增长，且头部开始膨大，条状、~生长健壮、橙黄色为生长良好的子实体；
步骤四采收储存
1）子实体采摘：蛹虫草子实体呈橘黄色、头部膨大并有子囊壳出现、表面有黄色粉末状物出现即为成熟，采用全自动开盖、倒置采摘、培养基清理一体机及时采摘；采收后的培养基可循环使用进行二次栽培；
2）子实体干燥及储存：采摘的蛹虫草子实体采用冷冻干燥后于干燥、阴凉处保存。
2.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法，其特征在于，所述PDA固体培养基的制备方法：取PDA37g、蚕蛹粉5g、加入纯净水800mL加热溶解，搅拌均匀后补足水分至1L，按要求分装后 121℃、30min灭菌备用。
3.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法，其特征在于，所述菌种纯化采用的培养基的制备方法：取PDA 37g，加水1L加热溶解，充分拌匀后于121℃、30min灭菌备用。
4.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法，其特征在于，所述液体培养基的制备方法：取葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、MgSO41g、磷酸二氢钾1.5g，加纯净水至1L搅拌充分溶解后分装，于121℃、30min灭菌备用。
5.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法，其特征在于，所述菌种栽培培养基的制备方法：取蚕蛹8kg、大米12kg、纯化水20kg、磷酸二氢钾30g、磷酸二氢钠10g备用，然后将蚕蛹与大米磨成粉后混合均匀，再加入含有磷酸二氢钾和磷酸二氢钠的纯化水，浆液充分搅拌至pH6‑6.5于121℃、30min灭菌后使用。
6.如权利要求1‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调节癌细胞雌二醇代谢和调控癌细胞GAPDH表达从而发挥癌症诊断或治疗药物制备中的应用。
7.如权利要求1‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调控癌细胞中的E2和GAPDH在抑制癌细胞生长中的应用。
8.如权利要求1‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物在调节肺癌细胞中雌二醇代谢中的应用。
9.如权利要求1‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物在上调肝癌细胞中GAPDH表达中的应用。
10.如权利要求6‑9任一项所述应用，其特征在于，所述麦角甾醇类化合物为（3R，9R，
10S，13S，14S，17S）‑17 ‑ （（2S，5R，E）‑5,6 ‑ dimethylhept‑3 ‑ 烯‑2 ‑ 基）‑10,13‑二甲基‑2，3，4,9,10,11,12,13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，简称“DI”，其结构式如下：。
说明书 :
一种蛹虫草规模化生产方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于蛹虫草生产剂提取技术领域，具体涉及一种蛹虫草的规模化生产方法与应用。
背景技术
[0002] 蛹虫草，学名于1833年由(L.exFr.)Link.命名，为Cordyceps militaris(L.ex Fr.)Link.，是麦角菌科、虫草属真菌，又名北冬虫夏草，是虫草属模式菌，《全国中草药汇
编》记载：“蛹虫草的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药”。《中华药海》记载：“蛹草，别名
北冬虫夏草(吉林)，性味甘、平，入肺、肾二经，兼具补肾阳和益肺阴的特性，具有补肾阳、益
精髓、止血化痰的功效”。我国于1958年在吉林省首次发现野生蛹虫草，1987年吉林省蚕业
科学研究所申请采用固体培养基培养蛹虫草的发明专利。
编》记载：“蛹虫草的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药”。《中华药海》记载：“蛹草，别名
北冬虫夏草(吉林)，性味甘、平，入肺、肾二经，兼具补肾阳和益肺阴的特性，具有补肾阳、益
精髓、止血化痰的功效”。我国于1958年在吉林省首次发现野生蛹虫草，1987年吉林省蚕业
科学研究所申请采用固体培养基培养蛹虫草的发明专利。
[0003] 随着传统技术的不断改进和新技术的应用，使得蛹虫草在菌种选育、过程控制、采收储存等各方面获得突飞猛进的发展，进而使蛹虫草栽培水平专业化、工业化水平获得不
断提高，如，基因测序技术的升级，使得蛹虫草基因组图谱更加精细和真实，科学家们通过
解读蛹虫草基因组获取更多的信息，不断深入挖掘其关键重要生物学信息，指导蛹虫草的
研究生产。研究发现，菌种来源、栽培方式、环境等因素影响蛹虫草生长代谢过程，导致其代
谢产物的活性及含量有所不同。此外，从药物开发的角度出发，仍需基于多水平综合分析和
通过实验和临床论证，以蛹虫草活性成分作为先导化合物寻找疾病治疗相关的特异靶点非
常关键。
断提高，如，基因测序技术的升级，使得蛹虫草基因组图谱更加精细和真实，科学家们通过
解读蛹虫草基因组获取更多的信息，不断深入挖掘其关键重要生物学信息，指导蛹虫草的
研究生产。研究发现，菌种来源、栽培方式、环境等因素影响蛹虫草生长代谢过程，导致其代
谢产物的活性及含量有所不同。此外，从药物开发的角度出发，仍需基于多水平综合分析和
通过实验和临床论证，以蛹虫草活性成分作为先导化合物寻找疾病治疗相关的特异靶点非
常关键。
[0004] 现代研究证明，蛹虫草发挥抗肿瘤、抗失眠、抗氧化、降血糖、提高免疫力、抗炎、保肝护肝等功能主要是通过腺苷类化合物、虫草多糖、甾醇类化合物等通过多靶点交互作用，
进而调节人体机能实现的。因此，挖掘家蚕蛹虫草子实体抑制肺癌和肝癌细胞生长的关键
活性成分，阐明其抑制癌细胞生长的作用机制，为肺癌和肝癌的治疗提供有效的、安全的可
应用的天然药物具有重要的社会经济意义，此外，以蛹虫草活性成分作为先导化合物，进一
步寻找疾病的关键特异靶点对疾病的诊断和预防具有极大的应用价值。
进而调节人体机能实现的。因此，挖掘家蚕蛹虫草子实体抑制肺癌和肝癌细胞生长的关键
活性成分，阐明其抑制癌细胞生长的作用机制，为肺癌和肝癌的治疗提供有效的、安全的可
应用的天然药物具有重要的社会经济意义，此外，以蛹虫草活性成分作为先导化合物，进一
步寻找疾病的关键特异靶点对疾病的诊断和预防具有极大的应用价值。
[0005] 截止目前，蛹虫草相关的研发、生产、销售类科研单位和企业已有很多，蛹虫草农业栽培技术基本成熟，其食药用基础和应用研究广泛，但蛹虫草原料质量参差不齐，仍然缺
乏蛹虫草品牌产品。生产过程污染率高、质量差、得率低仍然是现阶段需要解决的问题。因
此选择品质优良的蛹虫草菌种，开展降本增效、绿色环保的生产工艺研究具有重大意义。在
过去研究中发现，由贵州贵安精准医学股份有限公司分离，中国科学院微生物研究所鉴定
的蛹虫草海宁株C.militaris(HN)，该菌株可以在死的缫丝以后的蚕蛹组份上培养出可分
化的蛹虫草，通过人工培养获得蛹虫草子实体。本发明创造通过选取人工培养获得的优质
蛹虫草海宁株子实体、采用组织复壮法、从固体培养基选择单菌落转液体培养基菌种扩增
等进行规模生产用母种培育，这为解决蛹虫草培养过程污染控制、子实体产品品质差、子实
体得率低等问题提供了一条规模化生产及质量管控方法。
乏蛹虫草品牌产品。生产过程污染率高、质量差、得率低仍然是现阶段需要解决的问题。因
此选择品质优良的蛹虫草菌种，开展降本增效、绿色环保的生产工艺研究具有重大意义。在
过去研究中发现，由贵州贵安精准医学股份有限公司分离，中国科学院微生物研究所鉴定
的蛹虫草海宁株C.militaris(HN)，该菌株可以在死的缫丝以后的蚕蛹组份上培养出可分
化的蛹虫草，通过人工培养获得蛹虫草子实体。本发明创造通过选取人工培养获得的优质
蛹虫草海宁株子实体、采用组织复壮法、从固体培养基选择单菌落转液体培养基菌种扩增
等进行规模生产用母种培育，这为解决蛹虫草培养过程污染控制、子实体产品品质差、子实
体得率低等问题提供了一条规模化生产及质量管控方法。
发明内容
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提出了一种蛹虫草的规模化生产方法与应用。
[0007] 具体是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明的第一目的在于提供：一种蛹虫草的规模化生产方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤一 家蚕蛹虫草海宁株C.militaris(HN)菌种选育：
[0010] 1)选种：选择生长健壮、没有冷凝水或有冷凝水且水珠澄清透明、根部无白色气生菌丝的长到2～3cm高的家蚕蛹虫草海宁株子实体；
[0011] 2)菌种培育：在无菌环境中，采用无菌接菌钩，钩断子实体根，取出子实体，置于灭菌的纱布上，用无菌镊子夹住子实体根部，依次通过75％酒精擦拭子实体表面、无菌水清洗
其表面残留的酒精、无菌手术刀去除子实体的表皮，再选取子实体顶端1～1.5cm长的部位，
每1cm分成3～5粒，用无菌接种钩将子实体小粒置于PDA固体培养基上，子实体粒间隔约
3.5cm，在22℃生化培养箱内遮光倒置培养至出现菌丝；
其表面残留的酒精、无菌手术刀去除子实体的表皮，再选取子实体顶端1～1.5cm长的部位，
每1cm分成3～5粒，用无菌接种钩将子实体小粒置于PDA固体培养基上，子实体粒间隔约
3.5cm，在22℃生化培养箱内遮光倒置培养至出现菌丝；
[0012] 3)菌种纯化：在无菌环境中，用接种环选取菌种培育环节获得的一环菌丝、采用连续平板划线进行菌种分离和纯化，在21～23℃生化培养箱内倒置培养至菌丝长到高度约
0.5cm；
0.5cm；
[0013] 步骤二 菌种制备
[0014] 按照每120mL液体培养基接种量为1cm×1cm的比例，用无菌手术刀挑取步骤一的菌种纯化所得的平板单菌落并切碎，迅速转接于锥形瓶内的液体培养基中，轻摇使菌种均
匀分布，扎紧瓶口，于震荡摇床中22℃、170rpm/min、避光培养，待菌丝呈雪白色、均匀、浓
密、穿透力强、无异味，菌落生长大于培养基平面的1/2面积，即得质量合格的可栽培的菌
种；
匀分布，扎紧瓶口，于震荡摇床中22℃、170rpm/min、避光培养，待菌丝呈雪白色、均匀、浓
密、穿透力强、无异味，菌落生长大于培养基平面的1/2面积，即得质量合格的可栽培的菌
种；
[0015] 步骤三 栽培
[0016] 1)发菌初期培养：采用全自动开盖、接种和复盖一体机，向培养瓶中迅速注入2mL菌液后加盖，在温度为15～18℃，空气相对湿度为63～68％条件下黑暗培养3～5天，保留菌
丝呈雪白色，长势均匀、浓密、穿透力强、无异味的继续培养至菌丝全部长满整个培养基，当
料面产生数量不等、大小不一的多个圆丘状隆起时，即进入光培养菌株分化前期进行培养，
此外，本阶段污染较少的培养基进一步灭菌粉碎后的粉可进行循环利用，作为二次栽培用
培养基；所述温度为15‑18℃，可以很好的抑制其他杂菌的生长，降低污染率；所述培养瓶采
用透明耐高温高压的玻璃或pv材料作为生产容器，容器为圆形，共三部分组成，分别为基
座、培养基阻倒板、瓶身，瓶子直径6.5cm、瓶子总高度12cm，其中基座高3cm，阻倒板为外径
6.5cm、内径5cm的同心圆，瓶身高9cm；基座、阻倒板和瓶身可拆卸，瓶子顶部设有通气小孔；
所述培养瓶中装有40g菌种栽培培养基，高约2cm，具有生长穿底时间缩短、后期菌丝分化更
快的优点。
丝呈雪白色，长势均匀、浓密、穿透力强、无异味的继续培养至菌丝全部长满整个培养基，当
料面产生数量不等、大小不一的多个圆丘状隆起时，即进入光培养菌株分化前期进行培养，
此外，本阶段污染较少的培养基进一步灭菌粉碎后的粉可进行循环利用，作为二次栽培用
培养基；所述温度为15‑18℃，可以很好的抑制其他杂菌的生长，降低污染率；所述培养瓶采
用透明耐高温高压的玻璃或pv材料作为生产容器，容器为圆形，共三部分组成，分别为基
座、培养基阻倒板、瓶身，瓶子直径6.5cm、瓶子总高度12cm，其中基座高3cm，阻倒板为外径
6.5cm、内径5cm的同心圆，瓶身高9cm；基座、阻倒板和瓶身可拆卸，瓶子顶部设有通气小孔；
所述培养瓶中装有40g菌种栽培培养基，高约2cm，具有生长穿底时间缩短、后期菌丝分化更
快的优点。
[0017] 2)菌株分化前期培养：在温度为18℃～23℃，空气相对湿度≥85％，光照强度为200～250Lx的条件下进行光培养3～10天，至培养基料面菌丝逐渐由白色变为橘黄色后，继
续培养1～3天即可进入原基期；在光培养过程中每天光照12h以上，但不能连续照射，保证
每日6h黑暗培养，防止太阳光直射；
续培养1～3天即可进入原基期；在光培养过程中每天光照12h以上，但不能连续照射，保证
每日6h黑暗培养，防止太阳光直射；
[0018] 3)菌株分化原基期培养：在空气相对湿度为68～72％条件下，采用温差刺激进行培养10天，即可形成原基，待大量原基形成后保持温度为20～23℃，空气相对湿度逐渐加大
至85％～90％，光照时间延长至15h；继续培养1～3天，原基顶端开始出现椎状子实体即可
进入子实体生长前期；所述温差刺激分为白昼和夜晚两部分，白昼温度为18～23℃，光照强
度为50～100Lx，时间12‑14h；夜晚温度为5‑8℃，时间为6‑10h；
至85％～90％，光照时间延长至15h；继续培养1～3天，原基顶端开始出现椎状子实体即可
进入子实体生长前期；所述温差刺激分为白昼和夜晚两部分，白昼温度为18～23℃，光照强
度为50～100Lx，时间12‑14h；夜晚温度为5‑8℃，时间为6‑10h；
[0019] 4)子实体生长前期：生长前期子实体呈橘黄色，高1～2cm，在温度为22℃～25℃、空气相对湿度为85％～90％的环境中，每天采用散射光或日光灯500Lx照射18h，不连续光
照，培养20～30天，子实体高2～4cm，呈长圆锥形时，即可转入子实体生长后期；
照，培养20～30天，子实体高2～4cm，呈长圆锥形时，即可转入子实体生长后期；
[0020] 5)子实体生长后期：在温度为20～23℃，空气相对湿度为85％～90％，光照强度1000Lx条件下培养10～20天，且每日光照时间为18h，至子实体不再增粗、增长，且头部开始
膨大，子实体条状、生长健壮、为鲜艳的橙黄色为生长良好的子实体；
膨大，子实体条状、生长健壮、为鲜艳的橙黄色为生长良好的子实体；
[0021] 步骤四 采收储存
[0022] 1)子实体采摘：蛹虫草子实体呈橘黄色、头部膨大并有子囊壳出现、表面有黄色粉末状物出现即为成熟，及时采摘；采收后的培养基可循环使用进行二次栽培；
[0023] 2)子实体干燥及储存：采摘的蛹虫草子实体采用冷冻干燥后于干燥、阴凉处保存。
[0024] 所述PDA固体培养基的制备方法：取马铃薯葡萄糖琼脂(马铃薯葡萄糖琼脂，即Potato Dextrose Agar)37g，蚕蛹粉5g，加入纯净水800mL加热溶解，搅拌均匀后补足水分
至1L，按要求分装后121℃、30min灭菌备用。
至1L，按要求分装后121℃、30min灭菌备用。
[0025] 所述菌种纯化采用的培养基的制备方法：取马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)37g，加水1L加热溶解，充分拌匀后于121℃、30min灭菌备用。
[0026] 所述液体培养基的制备方法：取葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、MgSO41g、磷酸二氢钾1.5g，加纯净水至1L搅拌充分溶解后分装，于121℃、30min灭菌备用。
[0027] 所述菌种栽培培养基的制备方法：取蚕蛹8kg、大米12kg、纯化水20kg、磷酸二氢钾30g、磷酸二氢钠10g备用，然后将蚕蛹与大米磨成粉后混合均匀，再加入含有磷酸二氢钾和
磷酸二氢钠的纯化水，匀浆液充分搅拌至pH6‑6.5于121℃、30min灭菌。
磷酸二氢钠的纯化水，匀浆液充分搅拌至pH6‑6.5于121℃、30min灭菌。
[0028] 所述菌种制备，在液体培养过程中，若菌落呈浑浊态且无絮状出现，则该菌种已被污染，须立即放入高压灭菌锅内进行灭菌，以免扩大污染。
[0029] 所述黑暗培养的温度为15～18℃，空气相对湿度为65％；在培养过程中，及时清理污染的培养基，如菌丝明显含有青霉菌和酵母菌等杂菌斑或生长不良，培养基腐坏呈水渍
状、有异味等。
状、有异味等。
[0030] 所述菌株分化原基期培养，在培养期间，每天早、中、晚各通风15～20min，或早、晚各通风30min。
[0031] 所述子实体生长前期，考虑到蛹虫草子实体有趋光性，应调节光源照射方向保证使子实体保持向上直立生长。
[0032] 所述质量合格的可栽培的菌种的质量鉴定方法：在超净工作台内取扩增后的菌液接种于新配制的无菌栽培培养基上，接种菌液量为2mL/瓶，每次接种10‑20瓶至于温度22
℃、湿度为65％的培养箱内进行暗培养，将每次接种完后菌液密封后保存于‑20℃冰箱中；
待3天后观察菌种生长情况，经确认长势好且无其他杂菌生长后则将此批次菌液确认为合
格菌液，方可用于生产接种；所述合格菌液表现为菌丝呈雪白色、均匀、浓密、穿透力强、无
异味，菌落生长大于培养基平面的1/2面积。
℃、湿度为65％的培养箱内进行暗培养，将每次接种完后菌液密封后保存于‑20℃冰箱中；
待3天后观察菌种生长情况，经确认长势好且无其他杂菌生长后则将此批次菌液确认为合
格菌液，方可用于生产接种；所述合格菌液表现为菌丝呈雪白色、均匀、浓密、穿透力强、无
异味，菌落生长大于培养基平面的1/2面积。
[0033] 本发明第二目的在于提供：一种家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调节癌细胞雌二醇代谢和调控癌细胞GAPDH表达从而发挥癌症诊断或治疗药物制
备中的应用。
备中的应用。
[0034] 本发明第三目的在于提供：一种家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调节癌细胞中的雌二醇(简称“E2”)和调控甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(简称“GAPDH”)
的关系在抑制癌细胞生长中的应用。
的关系在抑制癌细胞生长中的应用。
[0035] 本发明第四目的在于提供：一种家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物在调节肺癌细胞中E2代谢中的应用。
[0036] 本发明第五目的在于提供：一种家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物在上调肝癌细胞中GAPDH表达中的应用。
[0037] 所述麦角甾醇类化合物，分子式为C28H44O，具体名称为(3R，9R，10S，13S，14S，17S)‑17‑((2S，5R，E)‑5,6‑dimethylhept‑3‑烯‑2‑基)‑10,13‑二甲基‑2，3，4,9,10,11,12,
13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，简称“DI”，其化学结构式如下：
13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，简称“DI”，其化学结构式如下：
[0038]
[0039] 一种从蛹虫草子实体中提取DI的方法，包括如下步骤：
[0040] S1粉碎：将家蚕蛹虫草海宁株子实体干品粗粉碎至40目后，超微粉碎至500目，得粉末；
[0041] S2提取：按料液比1:12的质量比将粉末与水搅拌均匀后浸泡24h，然后在90℃下提取3h，降至室温后离心分离，取沉淀加入12倍95％的乙醇水溶液浸提24h，离心分离提取上
清液，浓缩去除乙醇后冷冻干燥至恒重，得干燥物；
清液，浓缩去除乙醇后冷冻干燥至恒重，得干燥物；
[0042] S3提纯：取干燥物用100％乙醇溶解至100mg/mL，过0.25μm微孔滤膜后进行色谱分离，收集25.4‑30min组份，浓缩去除洗脱溶剂后，高温干燥；
[0043] S4析晶：取提纯所得物加入良溶剂充分溶解，放置于26℃条件下自然挥发，保温静止，将所得的晶体抽滤，用4℃的正己烷清洗，即得单晶晶体；所述良溶剂为正己烷和二氯甲
烷的混合溶剂。
烷的混合溶剂。
[0044] 所述色谱分离用色谱柱为DAC(150×250mm C18 8μm)，紫外检测波长为282nm，流‑1
速为600ml·min ；洗脱方式为98％的甲醇水溶液等度洗脱40min。
速为600ml·min ；洗脱方式为98％的甲醇水溶液等度洗脱40min。
[0045] 有益效果：
[0046] 本发明以家蚕蛹虫草海宁株为菌种，采用组织复壮后获得栽培母种，进一步经过固体培养转液体扩增制备栽培菌液，接种后培养获得子实体中虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺
苷、麦角甾醇含量均较高的蛹虫草；本发明的培养方法生产周期短，生产效能高，已实现规
模化生产，生产过程简单易行，参数易控制，且能够获得活性好的有效成分。
苷、麦角甾醇含量均较高的蛹虫草；本发明的培养方法生产周期短，生产效能高，已实现规
模化生产，生产过程简单易行，参数易控制，且能够获得活性好的有效成分。
[0047] 由于传统方法直接挑取离心管中的菌种进行菌种扩大制备，存在无法通过肉眼判断离心管中菌种是否被污染，这会给后续培养增加染菌的风险；而本发明采用直接通过肉
眼观察平板上菌丝的长势及是否有其他杂菌污染等情况，从而初步判断菌种的活力，具有
从源头控制污染的优点。
眼观察平板上菌丝的长势及是否有其他杂菌污染等情况，从而初步判断菌种的活力，具有
从源头控制污染的优点。
[0048] 本发明的提取方法简单，操作易行，参数易控制，且能够获得活性好的有效成分，有效成分能够通过参与调节雌二醇的代谢发挥抗肺癌作用，参与调控GAPDH表达发挥抗肝
癌作用，进而显示出较好的抗肝癌和抗肺癌活性；本发明中利用培养的家蚕蛹虫草海宁株
子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调控肺癌细胞和肝癌细胞中的雌二醇和甘油醛‑3‑
磷酸脱氢酶的关系，发现了蛹虫草子实体海宁株发挥抗肿瘤作用的主要活性成分，实现了
蛹虫草子实体海宁株的抗肿瘤活性成分通过调节肺癌细胞雌二醇代谢的抗肺癌应用机制
和调控肝癌细胞中的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶表达的抗肝癌应用机制，奠定了其在制备肺癌、
肝癌诊断制剂、治疗制剂中的应用基础，也为探索肺癌、肝癌发生机制提供一条路径。
癌作用，进而显示出较好的抗肝癌和抗肺癌活性；本发明中利用培养的家蚕蛹虫草海宁株
子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调控肺癌细胞和肝癌细胞中的雌二醇和甘油醛‑3‑
磷酸脱氢酶的关系，发现了蛹虫草子实体海宁株发挥抗肿瘤作用的主要活性成分，实现了
蛹虫草子实体海宁株的抗肿瘤活性成分通过调节肺癌细胞雌二醇代谢的抗肺癌应用机制
和调控肝癌细胞中的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶表达的抗肝癌应用机制，奠定了其在制备肺癌、
肝癌诊断制剂、治疗制剂中的应用基础，也为探索肺癌、肝癌发生机制提供一条路径。
附图说明
[0049] 图1为实验例1中蛹虫草海宁株子实体干品中虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷含量检测HPLC色谱图；
[0050] 图2为实验例1中蛹虫草海宁株子实体干品中麦角甾醇含量检测HPLC色谱图；
[0051] 图3为实验例1中蛹虫草海宁株子实体干品中虫草素的ESI‑MS谱图；
[0052] 图4为实验例1中蛹虫草海宁株子实体干品中N6‑(2‑羟乙基)腺的ESI‑MS谱图；
[0053] 图5为实验例1中蛹虫草海宁株子实体干品中麦角甾醇的ESI‑MS谱图；
[0054] 图6为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的结构式；
[0055] 图7为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的ESI‑MS图谱；
[0056] 图8为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的1H NMR谱图；
[0057] 图9为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的13C NMR谱图；
[0058] 图10为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的DEPT NMR谱图；
[0059] 图11为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的HSQC NMR谱图；
[0060] 图12为实施例2蛹虫草海宁株子实体提取物DI的HMBC NMR谱图。
具体实施方式
[0061] 下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的
范围。
范围。
[0062] 实施例1
[0063] 一种蛹虫草的规模化生产方法，包括如下步骤：
[0064] 第一步 培养基制备
[0065] 所述PDA固体培养基的制备方法：取PDA37g，蚕蛹粉5g，加入纯净水800mL加热溶解，搅拌均匀后补足水分至1L，按要求分装后121℃、30min灭菌备用；
[0066] 所述菌种纯化采用的培养基的制备方法：取PDA37g，加水1L加热溶解，充分拌匀按要求分装，121℃、30min灭菌备用；
[0067] 所述液体培养基的制备方法：取葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、MgSO41g、磷酸二氢钾1.5g，加纯净水至1L搅拌充分溶解后分装，121℃、30min灭菌备用；
[0068] 所述菌种栽培培养基的制备方法：取蚕蛹8kg、大米12kg、纯化水20kg、磷酸二氢钾30g、磷酸二氢钠10g备用，然后将蚕蛹与大米磨成粉后混合均匀，再加入含有磷酸二氢钾和
磷酸二氢钠的纯化水，匀浆液充分搅拌至pH6‑6.5；
磷酸二氢钠的纯化水，匀浆液充分搅拌至pH6‑6.5；
[0069] 第二步 家蚕蛹虫草海宁株C.militaris(HN)菌种选育
[0070] 1)选种：选择生长健壮、没有冷凝水或有冷凝水且水珠澄清透明、根部无白色气生菌丝的长到2～3cm高的家蚕蛹虫草海宁株子实体；
[0071] 2)菌种培育：在无菌环境中，用无菌接菌钩，钩断子实体根，取出子实体置于灭菌的纱布上，用无菌镊子夹住子实体根部，依次通过75％酒精擦拭子实体表面、无菌水清洗其
表面残留的酒精、无菌手术刀去除子实体的表皮，再选取子实体顶端1～1.5cm长的部位，每
1cm分成3～5粒，用无菌接种钩将子实体小粒置于PDA固体培养基上，子实体粒间隔约
3.5cm，在22℃生化培养箱内遮光倒置培养至出现菌丝；
表面残留的酒精、无菌手术刀去除子实体的表皮，再选取子实体顶端1～1.5cm长的部位，每
1cm分成3～5粒，用无菌接种钩将子实体小粒置于PDA固体培养基上，子实体粒间隔约
3.5cm，在22℃生化培养箱内遮光倒置培养至出现菌丝；
[0072] 3)菌种纯化：在无菌环境中，将母种试管斜面置于工作台内，双手消毒后进入工作台，点燃酒精灯，接种环使用前用酒精棉球擦拭，接种环连带接种柄部分一并灼烧，斜面试
管口灭菌后打开，用接种环从斜面(母种)上挑取一环菌种，迅速将接种环上的菌种在平板
上划线，在21～23℃生化培养箱内倒置培养至菌丝高度约0.5cm；
管口灭菌后打开，用接种环从斜面(母种)上挑取一环菌种，迅速将接种环上的菌种在平板
上划线，在21～23℃生化培养箱内倒置培养至菌丝高度约0.5cm；
[0073] 第三步 菌种制备
[0074] 菌种扩增；按照每120mL液体培养基接种量为1cm×1cm的比例，用无菌手术刀挑取纯化所得的质量达标的单菌落并切碎，迅速转接于锥形瓶内的液体培养基中，轻摇使菌种
均匀分布，扎紧瓶口，于震荡摇床中22℃、170rpm/min、避光培养，获得菌液通过接种到固体
栽培培养基测试菌种质量，菌丝呈雪白色、均匀、浓密、穿透力强、无异味，菌落生长大于培
养基平面的1/2面积，即得质量合格的可栽培的菌种；在液体培养过程中，若菌落呈浑浊态
且无絮状出现，则该菌种已被污染，须立即放入高压灭菌锅内进行灭菌，以免扩大污染；
均匀分布，扎紧瓶口，于震荡摇床中22℃、170rpm/min、避光培养，获得菌液通过接种到固体
栽培培养基测试菌种质量，菌丝呈雪白色、均匀、浓密、穿透力强、无异味，菌落生长大于培
养基平面的1/2面积，即得质量合格的可栽培的菌种；在液体培养过程中，若菌落呈浑浊态
且无絮状出现，则该菌种已被污染，须立即放入高压灭菌锅内进行灭菌，以免扩大污染；
[0075] 第四步 栽培
[0076] 1)培养瓶准备：培养瓶采用透明耐高温高压的玻璃或pv材料作为生产容器，容器为圆形，共三部分组成，分别为基座、培养基阻倒板、瓶身，瓶子直径6.5cm、瓶子总高度
12cm，其中基座3cm，阻倒板为外径6.5cm、内径5cm的同心圆，瓶身高9cm；基座、阻倒板和瓶
身可拆卸，瓶子顶部设有通气小孔，既便于空气流通，又可以隔绝病菌污染，采用全自动洗
瓶灌装一体机，每瓶装菌种栽培培养基，高约2cm，不可超过3cm，于自动湿热灭菌柜121℃、
30min进行高压灭菌；
12cm，其中基座3cm，阻倒板为外径6.5cm、内径5cm的同心圆，瓶身高9cm；基座、阻倒板和瓶
身可拆卸，瓶子顶部设有通气小孔，既便于空气流通，又可以隔绝病菌污染，采用全自动洗
瓶灌装一体机，每瓶装菌种栽培培养基，高约2cm，不可超过3cm，于自动湿热灭菌柜121℃、
30min进行高压灭菌；
[0077] 2)发菌初期培养：采用全自动开盖、接种和复盖一体机，向培养瓶中迅速注入2mL菌液后自动加盖，在温度为15～18℃，空气相对湿度为63～68％条件下黑暗培养3～5天，保
留菌丝呈雪白色，均匀、浓密、穿透力强、无异味的继续培养至菌丝全部长满整个培养基，料
面产生数量不等、大小不一的多个圆丘状隆起时，即进入光培养菌株分化前期培养；在此培
养过程中，及时清理污染的培养基，如菌丝明显含有青霉菌和酵母菌等杂菌斑或生长不良，
培养基腐坏呈水渍状、有异味等。
留菌丝呈雪白色，均匀、浓密、穿透力强、无异味的继续培养至菌丝全部长满整个培养基，料
面产生数量不等、大小不一的多个圆丘状隆起时，即进入光培养菌株分化前期培养；在此培
养过程中，及时清理污染的培养基，如菌丝明显含有青霉菌和酵母菌等杂菌斑或生长不良，
培养基腐坏呈水渍状、有异味等。
[0078] 3)菌株分化前期培养：缓慢升高温度至18℃～23℃和空气相对湿度≥85％，并设置光照强度为200～250Lx的条件下进行光培养3～10天，至培养基料面菌丝逐渐由白色变
为橘黄色后，继续培养1～3天即可进入原基期；在光培养过程中每天光照12h以上，但不能
连续照射，保证每日6h黑暗培养，防止太阳光直射；
为橘黄色后，继续培养1～3天即可进入原基期；在光培养过程中每天光照12h以上，但不能
连续照射，保证每日6h黑暗培养，防止太阳光直射；
[0079] 4)菌株分化原基期培养：在空气相对湿度为68～72％条件下，采用温差刺激进行培养10天，即可形成原基，待大量原基形成后保持温度为20～23℃，空气相对湿度逐渐加大
至85％～90％，光照时间延长到15h；继续培养1～3天，原基顶端开始出现椎状子实体即可
进入子实体生长前期；所述温差刺激分为白昼和夜晚两部分，白昼温度为18～23℃，光照强
度为50～100Lx，时间12‑14h；夜晚温度为5‑8℃，时间为6‑10h；在此培养过程中，每天早、
中、晚各通风15～20min，或早、晚各通风30min，须严格控制参数，若光照太强或通风不足则
易出现原基分化密、形成菌被而不长子座的现象；若湿度太大则出现气生菌丝过旺而影响
子座形成的现象；
至85％～90％，光照时间延长到15h；继续培养1～3天，原基顶端开始出现椎状子实体即可
进入子实体生长前期；所述温差刺激分为白昼和夜晚两部分，白昼温度为18～23℃，光照强
度为50～100Lx，时间12‑14h；夜晚温度为5‑8℃，时间为6‑10h；在此培养过程中，每天早、
中、晚各通风15～20min，或早、晚各通风30min，须严格控制参数，若光照太强或通风不足则
易出现原基分化密、形成菌被而不长子座的现象；若湿度太大则出现气生菌丝过旺而影响
子座形成的现象；
[0080] 5)子实体生长前期：生长前期子实体呈橘黄色，高1～2cm，将其置于温度为22℃～25℃，空气相对湿度为85％～90％的环境中，每天采用散射光或日光灯500Lx照射18h，不连
续光照，培养20～30天，子实体高2～4cm，呈长圆锥形时，即可转入子实体生长后期；在此培
养过程中考虑到蛹虫草子实体有趋光性，应调节光源照射方向保证使子实体保持向上直立
生长；
续光照，培养20～30天，子实体高2～4cm，呈长圆锥形时，即可转入子实体生长后期；在此培
养过程中考虑到蛹虫草子实体有趋光性，应调节光源照射方向保证使子实体保持向上直立
生长；
[0081] 6)子实体生长后期：在温度为20～23℃，空气相对湿度为85％～90％，光照强度1000Lx条件下培养10～20天，且每日光照时间为18h，至子实体不再增粗、增长，且头部开始
膨大，子实体条状、生长健壮、为鲜艳的橙黄色为生长良好的子实体；
膨大，子实体条状、生长健壮、为鲜艳的橙黄色为生长良好的子实体；
[0082] 第五步 采收储存
[0083] 1)子实体采摘：蛹虫草子实体呈橘黄色、头部膨大并有子囊壳出现、表面有黄色粉末状物出现即为成熟，采用全自动开盖、倒置采摘、培养基清理一体机及时采摘；采收后的
培养基可重复使用进行二次栽培；
培养基可重复使用进行二次栽培；
[0084] 2)子实体干燥及储存：采摘的蛹虫草子实体采用冷冻干燥后于干燥、阴凉处保存；
[0085] 本实施例中家蚕蛹虫草(C.militaris HN)子实体，投入蚕蛹1064kg，大米1596kg，优化栽培后上架75050瓶，生产周期小于60天，共获得158kg家蚕蛹虫草子实体干品。本次生
产基于从源头控制污染的发生，同时，对栽培全过程进行有效管控进行协同，通过对栽培环
境的良好控制使培养基子实体长势分化较快，上架的培养瓶均可见子实体小芽长出，获得
的蛹虫草子实体为色泽均匀、橘黄色，可缩短栽培周期约20‑30天，栽培过程污染率小于
1％，每瓶可获得约12g新鲜蛹虫草子实体，提高栽培效能20％以上，其子实体中的指标成分
虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷、麦角甾醇均较高，且获得抗肿瘤活性较好、具有肺癌和肝癌差
异化应用机制的麦角甾醇类化合物。本发明的方法可得到质优、高产的蛹虫草。
产基于从源头控制污染的发生，同时，对栽培全过程进行有效管控进行协同，通过对栽培环
境的良好控制使培养基子实体长势分化较快，上架的培养瓶均可见子实体小芽长出，获得
的蛹虫草子实体为色泽均匀、橘黄色，可缩短栽培周期约20‑30天，栽培过程污染率小于
1％，每瓶可获得约12g新鲜蛹虫草子实体，提高栽培效能20％以上，其子实体中的指标成分
虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷、麦角甾醇均较高，且获得抗肿瘤活性较好、具有肺癌和肝癌差
异化应用机制的麦角甾醇类化合物。本发明的方法可得到质优、高产的蛹虫草。
[0086] 实验例1
[0087] 本实验例通过检测几种来源蛹虫草子实体中虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷、麦角甾醇的含量，从而初步判断家蚕蛹虫草海宁株子实体的质量；分别是实施例生产的家蚕蛹虫
草海宁株子实体，编号为“A”，网购西藏蛹虫草子实体，编号为“B”，网购辽宁蛹虫草子实体，
编号为“C”；
草海宁株子实体，编号为“A”，网购西藏蛹虫草子实体，编号为“B”，网购辽宁蛹虫草子实体，
编号为“C”；
[0088] 1)麦角甾醇检测
[0089] 供试品溶液的制备：精密称定A 1.010g、B 1.014g、C 1.017g，分别加入95％乙醇50ml，85℃恒温水浴回流1h，过滤，滤液暂存；残渣再按上述方法提取2次，合并滤液，减压浓
缩至小于10mL(不超过60℃)，用乙醇定容至10mL，过膜，取滤液测定；
缩至小于10mL(不超过60℃)，用乙醇定容至10mL，过膜，取滤液测定；
[0090] 对照品溶液的制备：精密称取5.2mg麦角甾醇标准品，用乙醇溶解并定容至25mL，即得浓度为0.20592mg/mL的标准品对照液；
[0091] 色谱条件：色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm 5μm，GRACE)，流动相：98％甲醇‑水，流速：1mL/min，柱温：25℃，进样量：20μL，紫外检测波长：282nm；
[0092] 2)虫草素和N6‑(2‑羟乙基)腺苷成分检测
[0093] 供试品准备：取烘干的蛹虫草子实体原料A 1.013g、B 1.015g、C 1.012g，进行超低温粉碎；在超微粉中加入适量超纯水，加热提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩。用适量水
分散，加入95％乙醇至浓度为80％，充分混匀后，置4℃冰箱中沉淀过夜，收集上清液，浓缩，
‑1
干燥，称重；加入15％甲醇‑水溶解至浓度为200mg·mL ，微孔滤膜滤过，用高效液相色谱进
行分离；
分散，加入95％乙醇至浓度为80％，充分混匀后，置4℃冰箱中沉淀过夜，收集上清液，浓缩，
‑1
干燥，称重；加入15％甲醇‑水溶解至浓度为200mg·mL ，微孔滤膜滤过，用高效液相色谱进
行分离；
[0094] 色谱条件：色谱柱：C18(250mm×4.6mm 5μm，GRACE)，流动相：水‑甲醇(体积比85：15)为流动相，流速1mL/min，紫外检测波长：260nm；进样量：20μL柱温：25℃；
[0095] 3)含量比对计算
[0096] 面积归一化法、外标法，公式如下：
[0097] 虫草素和N6‑(‑2羟乙基)腺苷含量(％)＝目标峰面积/总峰面积×100％；
[0098] 麦角甾醇含量(％)＝目标峰面积/对照峰面积×对照浓度/样品浓度×稀释倍数×100％；
[0099] 4)结果
[0100] 见图1和图2可知，采用HPLC法与其他两个来源的蛹虫草中的虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷、麦角甾醇进行对比分析，辅以虫草素、N6‑(2‑羟乙基)腺苷、麦角甾醇的质谱鉴定
结果确认，基于HPLC峰面积初步测算，实施例1生产的家蚕蛹虫草质量相对最好，其虫草素
含量分别是西藏蛹虫草子实体的4.00倍、辽宁蛹虫草子实体的2.30倍，N6‑(2‑羟乙基)腺苷
含量分别是西藏蛹虫草的1.05倍、辽宁蛹虫草的2.40倍，麦角甾醇含量分别是西藏蛹虫草
子实体的5.60倍、辽宁蛹虫草子实体的1.80倍。
结果确认，基于HPLC峰面积初步测算，实施例1生产的家蚕蛹虫草质量相对最好，其虫草素
含量分别是西藏蛹虫草子实体的4.00倍、辽宁蛹虫草子实体的2.30倍，N6‑(2‑羟乙基)腺苷
含量分别是西藏蛹虫草的1.05倍、辽宁蛹虫草的2.40倍，麦角甾醇含量分别是西藏蛹虫草
子实体的5.60倍、辽宁蛹虫草子实体的1.80倍。
[0101] 实施例2
[0102] 一种蛹虫草中(3R，9R，10S，13S，14S，17S)‑17‑((2S，5R，E)‑5,6‑dimethylhept‑3‑烯‑2‑基)‑10,13‑二甲基‑2，3，4,9,10,11,12,13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇(简称“DI”)的提取方法，包括如下步骤：
[0103] S1粉碎：将家蚕蛹虫草海宁株子实体干品粗粉碎至40目后，超微粉碎至500目，得粉末；
[0104] S2提取：按料液比1:12的质量比将粉末与水搅拌均匀后浸泡24h，然后在90℃下提取3h，降至室温后离心分离，取沉淀加入12倍95％的乙醇水溶液浸提24h，离心分离提取上
清液，浓缩去除乙醇后冷冻干燥至恒重，得干燥物；
清液，浓缩去除乙醇后冷冻干燥至恒重，得干燥物；
[0105] S3提纯：取干燥物用100％乙醇溶解至100mg/mL，过0.25μm微孔滤膜后进行色谱分离，收集25.4‑30min组份，浓缩去除洗脱溶剂后，高温干燥；
[0106] S4析晶：取提纯所得物加入良溶剂一定比例的正己烷和二氯甲烷混合溶剂充分溶解，放置于26℃条件下自然挥发，保温静止，将所得的晶体抽滤，用4℃的正己烷清洗，即得
单晶晶体；
单晶晶体；
[0107] 所述色谱分离用色谱柱为DAC(150×250mm C18 8μm)，紫外检测波长为282nm，流‑1
速为600ml·min 。洗脱方式为98％的甲醇水溶液等度洗脱40min；
速为600ml·min 。洗脱方式为98％的甲醇水溶液等度洗脱40min；
[0108] 将S4步骤所得物采用X单晶衍射仪测定；
[0109] 结果：家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物为(3R，9R，10S，13S，14S，17S)‑17‑((2S，5R，E)‑5,6‑dimethylhept‑3‑烯‑2‑基)‑10,13‑二甲基‑2,3,4,9,10,11,12,
13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，其结构式如图3，ESI‑MS图谱如图7，
1 13
H NMR图谱如图8，C NMR谱图如图9，DEPT NMR谱图如图10，HSQC NMR谱图如图11，HMBC
NMR谱图如12。
13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，其结构式如图3，ESI‑MS图谱如图7，
1 13
H NMR图谱如图8，C NMR谱图如图9，DEPT NMR谱图如图10，HSQC NMR谱图如图11，HMBC
NMR谱图如12。
[0110] 实施例3
[0111] 一种家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物在抗肺癌和肝癌中的特异性应用机制；具体的：一种家蚕蛹虫草海宁株子实体中麦角甾醇类化合物通过特异性调节癌
细胞中的雌二醇(简称“E2”)和调控甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(简称“GAPDH”)的关系在抑制癌
细胞生长中的应用；
细胞中的雌二醇(简称“E2”)和调控甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(简称“GAPDH”)的关系在抑制癌
细胞生长中的应用；
[0112] 所述麦角甾醇类化合物，分子式为C28H44O，具体名称为(3R，9R，10S，13S，14S，17S)‑17‑((2S，5R，E)‑5,6‑dimethylhept‑3‑烯‑2‑基)‑10,13‑二甲基‑2，3，4,9,10,11,12,
13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，简称“DI”，其化学结构式如图6所示；
13,14,15,16,17‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲‑3‑醇，简称“DI”，其化学结构式如图6所示；
[0113] 所述特异性调控为：DI处理肺癌细胞后，肺癌细胞中E2含量会增加，而GAPDH含量无明显变化；DI处理肝癌细胞后，肝癌细胞中E2含量无明显变化，而GAPDH含量会增加；利用
此特异性，能够实现DI在肺癌、肝癌的治疗中应用，进一步可将DI用于制备调节肺癌细胞中
调节雌二醇或雌激素代谢的制剂，以及DI用于制备调节肝癌细胞中GAPDH或能量代谢的制
剂，所述制剂包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口服含
片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
此特异性，能够实现DI在肺癌、肝癌的治疗中应用，进一步可将DI用于制备调节肺癌细胞中
调节雌二醇或雌激素代谢的制剂，以及DI用于制备调节肝癌细胞中GAPDH或能量代谢的制
剂，所述制剂包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口服含
片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
[0114] 实施例4
[0115] 实施例2提取的有效成分DI在调节癌细胞中E2代谢中的应用和在调控癌细胞中GAPDH表达中的应用；
[0116] DI与E2和GAPDH的关系验证：
[0117] 一、DI对肺癌、肝癌细胞抑制浓度的摸索
[0118] 1)人肺癌A549细胞和肝癌HepG2细胞按照常规方法复苏，将收获的细胞用含10％FBS的DMEM高糖完全培养基，37℃、5％CO2恒温培养箱中静置培养；待细胞长至80％‑90％融
合时，0.25％‑EDTA胰酶消化传代；
合时，0.25％‑EDTA胰酶消化传代；
[0119] 2)MTT法检测细胞增殖
[0120] ①取对数生长期的A549和HepG2细胞，以1×104个/孔分别接种于96孔板中，每孔分别加入100μL；待细胞贴壁后，换为相应浓度的作用药物(前一天下午铺板，次日上午加
药)，继续培养24h、48h、72h，倒置显微镜下观察；
药)，继续培养24h、48h、72h，倒置显微镜下观察；
[0121] ②设调零组、空白对照组和DI组(10、25、50、75、100μg/mL)，每组设3个复孔；其中，调零组为空孔，孔内不加任何物质的细胞组；空白对照组为不加家蚕蛹虫草海宁株子实体
中DI，其余各步操作与DI组相同；
中DI，其余各步操作与DI组相同；
[0122] ③培养结束后移除培养基，每孔加入MTT溶液(终浓度为0.5mg/mL)，100μL，37℃孵育4h后，弃去MTT溶液，小心用PBS冲2‑3遍后，每孔加入200μL的DMSO，室温震荡10min混匀，
使结晶充分溶解后，490nm全自动酶标仪测定吸光度。按下式计算增殖抑制率；
使结晶充分溶解后，490nm全自动酶标仪测定吸光度。按下式计算增殖抑制率；
[0123] 增殖抑制率(％)＝(OD空白对照组‑ODDI组)/(OD空白对照组‑OD调零组)×100％；
[0124] 二、细胞加药处理
[0125] 1)细胞培养及铺板同上
[0126] 2)加药：细胞在12孔板中培养24h后，设置空白对照组、按样浓度为50μg/mL、75μg/mL加药，每个浓度重复两个复孔，培养72h；
[0127] 三、细胞提取液‑‑反复冻融方法
[0128] 1)吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净；
[0129] 2)将细胞悬浮液收集到离心管中，在2‑8℃下以1000×g离心5min，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次；
[0130] 3)加入适量的预冷PBS重悬细胞；在12孔培养板(约1×106个细胞)中，每个孔加入70‑150μL的PBS来重悬细胞；
[0131] 4)使样本在‑20℃或‑80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次(至少3次)，直至细胞完全裂解；也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞；
[0132] 5)2‑8℃下以1500×g离心10min，去除细胞碎片，收集上清液，‑20℃或‑80℃保存，避免反复冻融。
[0133] 四、ELISA法检测
[0134] 雌二醇(E2)和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)ELISA试剂盒均采购于武汉基因美生物科技有限公司，按照试剂盒的操作流程进行E2和GAPDH的含量检测。
[0135] 1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μL，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μL，混匀；然后从第一孔、第二孔
中各取100μL分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μL，混匀；
然后在第三孔和第四孔中先各取50μL弃掉，再各取50μL分别加到第五、第六孔中，再在第
五、第六孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μL分别加到
第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第七、第八孔中分
别取50μL加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第九、
第十孔中各取50μL弃掉；(肺癌浓度梯度E2：0pg/mL、31.25pg/mL、62.5pg/mL、125pg/mL、
250pg/mL、500pg/mL；GAPDH：0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL；肝癌浓
度梯度：0pg/mL、15pg/mL、30pg/mL、、60pg/mL、120pg/mL、180pg/mL)；
中各取100μL分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μL，混匀；
然后在第三孔和第四孔中先各取50μL弃掉，再各取50μL分别加到第五、第六孔中，再在第
五、第六孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μL分别加到
第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第七、第八孔中分
别取50μL加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第九、
第十孔中各取50μL弃掉；(肺癌浓度梯度E2：0pg/mL、31.25pg/mL、62.5pg/mL、125pg/mL、
250pg/mL、500pg/mL；GAPDH：0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL；肝癌浓
度梯度：0pg/mL、15pg/mL、30pg/mL、、60pg/mL、120pg/mL、180pg/mL)；
[0136] 2)待测样品加样：分别设空白对照孔、待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)；加样将样品加于酶
标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
[0137] 样品：不同浓度DI(50μg/mL、75μg/mL)作用于肺癌和肝癌细胞，72h后分别收集细胞提取液；
[0138] 设置组别：空白对照组、调零组、50μg/mL、75μg/mL，每个浓度重复两个复孔；
[0139] 3)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；
[0140] 4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；
[0141] 5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；
[0142] 6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置30s后弃去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
[0143] 7)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光孵育显色10min；
[0144] 8)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0145] 9)测定：以空白孔调零组，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)；测定应在加终止液后15min以内进行；
[0146] 五、实验结果计算
[0147] 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，
即为样品的实际浓度；
即为样品的实际浓度；
[0148] 六、结果与分析
[0149] 1通过计算的抑制率找到对应作用的DI最适作用浓度
[0150] 1)不同浓度DI对肺癌和肝癌细胞增值的影响
[0151]
[0152]
[0153] 2标准曲线
[0154] 1)分光光度值(OD450)(肺癌细胞处理)
[0155]
[0156] 2)分光光度值(OD450)(肝癌细胞处理)
[0157] 0pg/mL 15pg/mL 30pg/mL 60pg/mL 120pg/mL 180pg/mL
E2 0.082 0.124 0.16 0.294 0.45 0.635
GAPDH 0.253 0.291 0.379 0.533 0.781 0.993
E2 0.082 0.124 0.16 0.294 0.45 0.635
GAPDH 0.253 0.291 0.379 0.533 0.781 0.993
[0158] 3含量检测
[0159] 选择细胞状态良好，DI抑制癌细胞生长活性由低到高的50μg/mL、75μg/mL两个浓度和空白对照组进行含量检测。50μg/mL和75μg/mL肺癌细胞A549抑制率分别为63.35％和
67.73％，50μg/mL和75μg/mL肝癌细胞HepG2抑制率分别为57.88％和82.28％。
67.73％，50μg/mL和75μg/mL肝癌细胞HepG2抑制率分别为57.88％和82.28％。
[0160] 1)药物处理后Elisa检测细胞样品的分光光度值(OD450)
[0161]
[0162] 2)计算后样品浓度
[0163]
[0164]
[0165] 由此可知：DI对癌细胞生长的抑制情况，和10μg/mL相比，随着DI作用浓度升高，癌细胞的抑制率也升高，且表现出差异性显著。
[0166] 当用不同浓度家蚕蛹虫草海宁株子实体中DI处理癌症细胞72h后，DI组与调零组、空白对照组对比，肺癌细胞中E2含量有所增加，肝癌细胞中其含量没明显变化，且表现出差
异性显著。
异性显著。
[0167] 当用不同浓度家蚕蛹虫草海宁株子实体中DI处理癌症细胞72h后，DI组与调零组、空白对照组对比，肺癌细胞中GAPDH含量变化不大，而肝癌细胞中其含量明显增加，且表现
出差异性显著。
出差异性显著。
[0168] 说明：家蚕蛹虫草海宁株子实体中DI能通过参与调节雌二醇的代谢得到发挥抗肺癌应用，而抗肝癌作用能通过调控甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶发挥抗肝癌应用。
[0169] 实验例2
[0170] 为了检验家蚕蛹虫草海宁株子实体中DI是否真实通过参与调节雌二醇的代谢发挥抗肺癌作用，调控甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶抗肝癌作用，采用第三代基因测序技术，测序和
组装人肺癌细胞A549与肝癌细胞HepG2全转录组，进一步分析参与雌二醇代谢的雌二醇17
β‑脱氢酶和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶是否在原A549和HepG2存在特异性突变，从基因和蛋白水
平上验证DI的特异性机制；
组装人肺癌细胞A549与肝癌细胞HepG2全转录组，进一步分析参与雌二醇代谢的雌二醇17
β‑脱氢酶和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶是否在原A549和HepG2存在特异性突变，从基因和蛋白水
平上验证DI的特异性机制；
[0171] 一、方法
[0172] 1癌细胞全转录组测序
[0173] 人肺癌细胞A549与肝癌细胞HepG2转录组使用美国太平洋生物科学公司(Pacific Bioscience)PacBio RS Ⅱ测序系统进行单分子实时测序( Sequencing)；按照
UNIQ‑10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA；总RNA按照Procedure and Checklist‑
TM
Isoform Sequencing(Iso‑Seq )Using the PCR cDNA Synthesis
Kit操作流程对进行SMRT文库的构建；通过计算软件Binding Calculator‑master Version
2.3.1.1进行上机相关参数的设置；按照Pacifiaac Biosciences DNA/Polymerase
Binding Kit P6v2、MagBead Kit和DNA Sequencing Reagent 4.0等试剂盒流程准备上机
测序；通过PacBio RS Ⅱ单分子实时测序得到高质量的全长转录本；
UNIQ‑10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA；总RNA按照Procedure and Checklist‑
TM
Isoform Sequencing(Iso‑Seq )Using the PCR cDNA Synthesis
Kit操作流程对进行SMRT文库的构建；通过计算软件Binding Calculator‑master Version
2.3.1.1进行上机相关参数的设置；按照Pacifiaac Biosciences DNA/Polymerase
Binding Kit P6v2、MagBead Kit和DNA Sequencing Reagent 4.0等试剂盒流程准备上机
测序；通过PacBio RS Ⅱ单分子实时测序得到高质量的全长转录本；
[0174] 2酶的突变情况分析
[0175] 将获得的人肺癌细胞A549与肝癌细胞HepG2转录组数据与研究发现的人体疾病相关的4729个酶进行比对，提取同源率在50％‑97％、且不小于70个氨基酸的酶，将该酶的氨
基酸序列进一步与NCBI进行比对，根据与NCBI的比对结果选取发生了突变的蛋白，进一步
搜索突变的蛋白中是否存在雌二醇17β‑脱氢酶和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的突变；
基酸序列进一步与NCBI进行比对，根据与NCBI的比对结果选取发生了突变的蛋白，进一步
搜索突变的蛋白中是否存在雌二醇17β‑脱氢酶和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的突变；
[0176] 二、结果
[0177] 1基于人肺癌细胞A549全转录组测序的酶雌二醇17β‑脱氢酶的突变分析
[0178] 1.1转录本结果统计
[0179] 转录本数目 45146转录本总长度 59559kb
最大转录本长度 7497bp
最小转录本长度 200bp
平均转录本长度 1328bp
平均GC含量 48.36％
ContigN50 1490bp
最大转录本长度 7497bp
最小转录本长度 200bp
平均转录本长度 1328bp
平均GC含量 48.36％
ContigN50 1490bp
[0180] 将转录组组装结果与4729个酶比对，检测到了2660个酶(其中线粒体4个，非线粒体2656个)，发现有突变的酶是192个；
[0181] 1.2雌二醇17β‑脱氢酶的突变情况
[0182]
[0183] 1.3 A549细胞的雌二醇17β‑脱氢酶的氨基酸序列与NCBI比对数据
[0184] >Query＝c22055/f2p2/2293
[0185] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRLEGKSDLPPLPKPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVLGEPPGSIWAPRSLLRPALKPTCSQA
QGARGDRPC*g*c*gglvgplVSAVCNaglgllgplealgEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLV
TGSVGGLMG
QGARGDRPC*g*c*gglvgplVSAVCNaglgllgplealgEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLV
TGSVGGLMG
[0186] PREDICTED:estradiol 17‑beta‑dehydrogenase 1 isoform X8[Homo sapiens]
[0187] Sequence ID:XP_011523034.1Length:180Number of Matches:1
[0188] Related Information
[0189] Gene‑associated gene details
[0190] Range 1:1 to 179GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match
[0191]
[0192] Query 1
[0193] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRLEGKSDLPPLP 60
[0194] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWREGKSDLPPLP
[0195] Sbjct 1
[0196] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRPEGKSDLPPLP 60
[0197] Query 61
[0198] KPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVLG 120
[0199] KPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVL
[0200] Sbjct 61
[0201] KPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVL‑119
[0202] Query 121
[0203] EPPGSIWAPRSLLRPALKPTCSQAQGARGDRPC*G*C*GGLVGPLVSAVCNAGLGLLGPL 180
[0204] VCNAGLGLLGPL
[0205] Sbjct 120‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑VCNAGLGLLGPL 131[0206] Query 181
[0207] EALGEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGSVGGLM 228
[0208] EALGEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGSVGGLM
[0209] Sbjct 132
[0210] EALGEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGSVGGLM 179
[0211] 2基于人肺癌细胞HepG2全转录组测序的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的突变分析
[0212] HepG2测序结果如下：
[0213] 2.1转录本组装结果统计
[0214]转录本数目 46512
转录本总长度 69890247kb
最大转录本长度 8656bp
最小转录本长度 203bp
平均转录本长度 1502bp
平均GC含量 48.37％
ContigN50 1651bp
转录本总长度 69890247kb
最大转录本长度 8656bp
最小转录本长度 203bp
平均转录本长度 1502bp
平均GC含量 48.37％
ContigN50 1651bp
[0215] 将转录组组装结果与4729个酶比对，检测到了2660个酶(其中线粒体4个，非线粒体2656个)，发现有突变的酶是340个。
[0216] 2.2甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的突变情况
[0217]
[0218] 2.3HepG2的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的氨基酸序列与NCBI比对数据
[0219] Query＝c174868/f1p5/1054
[0220] HGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPLLTPHVRHGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDG
RGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGY
TEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
RGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGY
TEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
[0221] glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase isoform 2[Homo sapiens]
[0222] Sequence ID:ref|NP_001243728.1|Length:293Number of Matches:1
[0223] See 1 more title(s)
[0224] Related Information
[0225] Gene‑associated gene details
[0226] Map Viewer‑aligned genomic context
[0227] Identical Proteins‑Identical proteins to NP_001243728.1
[0228] Range 1:11 to 293GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match
[0229]
[0230] Query 1
[0231] HGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHL 60
[0232] HGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHL
[0233] Sbjct 11
[0234] HGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHL 70
[0235] Query 61
[0236] QGGAKRVIISAPLL‑TPHVRHGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVE 119
[0237] QGGAKRVIISAP P
[0238] GVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVE
[0239] Sbjct 71
[0240] QGGAKRVIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVE 130
[0241] Query 120
[0242] GLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMA 179
[0243] GLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMA
[0244] Sbjct 131
[0245] GLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMA 190
[0246] Query 180
[0247] FRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHS 239
[0248] FRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHS
[0249] Sbjct 191
[0250] FRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHS 250
[0251] Query 240
[0252] STFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE 282
[0253] STFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
[0254] Sbjct 251
[0255] STFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE 293
[0256] 通过第三代基因测序检测发现，A549细胞中存在E2代谢的关键酶雌二醇17β‑脱氢酶特异性突变，而HepG2细胞存在甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶特异性突变。
[0257] 实验例3
[0258] 验证雌二醇17β‑脱氢酶是否为肺癌发生发展的关键酶和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶是否为肝癌发生发展的关键酶，为通过家蚕蛹虫草海宁株子实体中“DI”通过特异性调控肺癌
细胞中的雌二醇的抗肺癌应用以及调控肝癌细胞中的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的抗肝癌应用
奠定基础。
细胞中的雌二醇的抗肺癌应用以及调控肝癌细胞中的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的抗肝癌应用
奠定基础。
[0259] 基于第三代基因测序的人的全转录组，随机采集来自天津肿瘤医院的2例人肺癌和2例人肝癌病例外周血样进行全转录组测序，将肺癌病人或肝癌病人转录组数据与研究
发现的人体疾病相关的4729个酶进行比对，提取同源率在50％‑97％、且不小于70个氨基酸
的酶，将该酶的氨基酸序列进一步与NCBI进行比对，根据与NCBI的比对结果分析雌二醇17
β‑脱氢酶的突变是否存在以及突变情况，根据与NCBI的比对结果分析甘油醛‑3‑磷酸脱氢
酶的突变是否存在以及突变情况，结果表明，2例肺癌病例均特异性出现了雌二醇17β‑脱氢
酶突变，而2例肝癌病例均特异性出现了甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变。详细突变如下：
发现的人体疾病相关的4729个酶进行比对，提取同源率在50％‑97％、且不小于70个氨基酸
的酶，将该酶的氨基酸序列进一步与NCBI进行比对，根据与NCBI的比对结果分析雌二醇17
β‑脱氢酶的突变是否存在以及突变情况，根据与NCBI的比对结果分析甘油醛‑3‑磷酸脱氢
酶的突变是否存在以及突变情况，结果表明，2例肺癌病例均特异性出现了雌二醇17β‑脱氢
酶突变，而2例肝癌病例均特异性出现了甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶突变。详细突变如下：
[0260] 肺癌病例1：
[0261]
[0262] 序列突变情况为：
[0263] Query＝c8524/f1p0/1959
[0264] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRPEGKSDLPPLPKPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVLGEPPGSIWAPRSLLRPALKPTCSQA
QGARGDRPCgcgglvgplVSAVCNaglgllgplealgEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGS
VGGLMG
QGARGDRPCgcgglvgplVSAVCNaglgllgplealgEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGS
VGGLMG
[0265] PREDICTED:estradiol 17‑beta‑dehydrogenase 1 isoform X8[Homo sapiens]
[0266] Sequence ID:ref|XP_011523034.1|Length:180Number of Matches:1
[0267] Related Information
[0268] Gene‑associated gene details
[0269] Range 1:1 to 179GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match
[0270]
[0271] Query 1
[0272] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRPEGKSDLPPLP 60
[0273] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRPEGKSDLPPLP
[0274] Sbjct 1
[0275] MARTVVLITGCSSGIGLHLAVRLASDPSQSFKGIDRQGQGGREGRSPWRPEGKSDLPPLP 60
[0276] Query 61
[0277] KPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVLG 120
[0278] KPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVL Sbjct 61
[0279] KPPVYATLRDLKTQGRLWEAARALACPPGSLETLQLDVRDSKSVAAARERVTEGRVDVL‑119
[0280] Query 121
[0281] EPPGSIWAPRSLLRPALKPTCSQAQGARGDRPCGCGGLVGPLVSAVCNAGLGLLGPLEAL 180
[0282] VCNAGLGLLGPLEAL
[0283] Sbjct 120‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑VCNAGLGLLGPLEAL 134[0284] Query 181
[0285] GEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGSVGGLM 225
[0286] GEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGSVGGLM
[0287] Sbjct 135
[0288] GEDAVASVLDVNVVGTVRMLQAFLPDMKRRGSGRVLVTGSVGGLM 179
[0289] 肺癌病例2：
[0290]
[0291] 序列突变情况为：
[0292] >Query＝c133537/f1p1/1595
[0293] MKFlldillllplliVCSLESFVKLFIPKRRKSVTGEIVLITGAGHGIGRLTAYEFAKLKSKLVLWDINKVKAEIGDVSILVNNAGVVYTSDLFATQDPQIEKTFEVNVLAHFWRRKELGTIRVIVCDFIKTTKAFLPAMTKNNH
GHIVTVASAAGHVSVPFLLAYCSSKFAAVGFHKTLTDELAALQITGVKTTCLCPNFVNTGFIKNPSTSLGPTLEPEE
VVNRLMHGILTEQKMIFIPSSIAFLTTLERILPERFLAVLKRKISVKFDAVIGYKMKAQ
GHIVTVASAAGHVSVPFLLAYCSSKFAAVGFHKTLTDELAALQITGVKTTCLCPNFVNTGFIKNPSTSLGPTLEPEE
VVNRLMHGILTEQKMIFIPSSIAFLTTLERILPERFLAVLKRKISVKFDAVIGYKMKAQ
[0294] estradiol 17‑beta‑dehydrogenase 11 precursor[Homo sapiens]
[0295] Sequence ID:NP_057329.3Length:300Number of Matches:1
[0296] See 10 more title(s)
[0297] Related Information
[0298] Gene‑associated gene details
[0299] GEO Profiles‑microarray expression data
[0300] Map Viewer‑aligned genomic context
[0301] Identical Proteins‑Identical proteins to NP_057329.3
[0302] Range 1:1 to 300GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match
[0303]
[0304] Query 1
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[0309] Query 61 SKLVLWDINK‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑VKAEIGDVSILVNN84[0310] SKLVLWDINK
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[0314] Query 85
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[0316] AGVVYTSDLFATQDPQIEKTFEVNVLAHFW
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[0319] AGVVYTSDLFATQDPQIEKTFEVNVLAHFW‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑TTKAFLPAMTKNN 163
[0320] Query 145
[0321] HGHIVTVASAAGHVSVPFLLAYCSSKFAAVGFHKTLTDELAALQITGVKTTCLCPNFVNT 204
[0322] HGHIVTVASAAGHVSVPFLLAYCSSKFAAVGFHKTLTDELAALQITGVKTTCLCPNFVNT
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[0325] Query 205
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[0328] VLKR
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[0331] Query 265 KISVKFDAVIGYKMKAQ 281
[0332] KISVKFDAVIGYKMKAQ
[0333] Sbjct 284 KISVKFDAVIGYKMKAQ 300
[0334] 肝癌病例1：
[0335]
[0336] 序列突变情况为：
[0337] Query＝c307214/f1p0/1615
[0338] GRELNWDDYKKQEQLETARKFLYYEMGYKSRSEQLTDRSEISLLPSDIDRYKKRFHKFDADQKGFITIVDVQRVLESIMSKWMKYTPNSKSFENGQVELNEF
[0339] glycerol‑3‑phosphate dehydrogenase 2(mitochondrial),isoform CRA_a[Homo sapiens]
[0340] Sequence ID:gb|EAX11452.1|Length:709Number of Matches:1
[0341] Related Information
[0342] Gene‑associated gene details
[0343] Range 1:578 to 684GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match
[0344]
[0345] Query 1
[0346] GRELNWDDYKKQEQLETARKFLYYEMGYKSRSEQLTDRSEISLLPSDIDRYKKRFHKFDA 60
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[0348] KRFHKFDA
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[0350] GRELNWDDYKKQEQLETARKFLYYEMGYKSRSEQLTDRSEISLLPSDIDRYKKRFHKFDA 637
[0351] Query 61
[0352] DQKGFITIVDVQRVLESIMSKWMKYTPNSKSFE‑‑‑‑‑NGQVELNEF 102
[0353] DQKGFITIVDVQRVLESI++T+E NGQVELNEF
[0354] Sbjct 638
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[0356] 肝癌病例2：
[0357]
[0358] 序列突变情况为：
[0359] >Query＝c104825/f1p2/1106
[0360] MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGAL
QNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQ
VVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
QNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQ
VVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
[0361] PREDICTED:glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase isoform X6[Colobus angolensis palliatus]
[0362] Sequence ID:XP_011790527.1Length:303Number of Matches:1
[0363] Related Information
[0364] Gene‑associated gene details
[0365] Range 1:1 to 303GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match
[0366]
[0367] Query 1
[0368] MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTV 60
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[0372] Query 61
[0373] KAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTT‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑104
[0374] KAENGKLVING+PITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTT
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[0377] Query 105
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