一种花生根际微生物菌系及其生物菌肥在土壤改良修复上的方法转让专利
申请号 : CN202111677070.7
文献号 : CN114437965B
文献日 : 2022-12-20
发明人 : 孙伟明 , 冯丽娜 , 邢单润 , 胡朋举 , 焦镇 , 李步阳 , 宋亚辉
申请人 : 河北科技师范学院
摘要 :
本发明提供了一种花生根际微生物菌系及其生物菌肥在土壤改良修复上的方法，涉及土壤改良技术领域。本发明包含对花生果腐病病原菌具有抑制作用的菌株，同时包含具有溶磷、解钾、固氮、调节pH和降解花生自毒物质能力的菌株，以及分泌植物生长调节剂的菌株。将这些菌株复配应用于花生种植中，具有显著的促生、防病和增产作用。同时，将该花生根际微生物菌系制备的生物菌肥将微生物菌系、有机质和无机复合肥搭配施用防治花生果腐病，不仅能通过促生菌协同增效作用及其生物有机肥的促生作用增加产量，还能通过生防菌株和促生菌株的协同作用防治花生果腐病而提高产量。
权利要求 :
1.一种胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）GF‑32a，所述菌株GF‑32a已完成保藏，保藏编号为CGMCC No.22902。
2.根据权利要求1所述菌株GF‑32a，其特征在于，所述菌株GF‑32a的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种重茬地花生改良的微生物菌系，其特征在于，所述微生物菌系包括权利要求1或
2所述菌株GF‑32a，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）GD‑16和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GF‑3，其中巨大芽孢杆菌GD‑16的保藏编号为CGMCC No.24218。
4.根据权利要求3所述微生物菌系所制备的菌剂，其特征在于，以有效活菌数计，所述菌株GF‑32a、菌株GD‑16和GF‑3的活菌数比为0.05‑0.1亿/g：0.2‑0.5亿/g：0.5‑1.0亿/g。
5.根据权利要求4所述菌剂制备的生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥中还包括以下质量百分含量的原料：畜禽粪便固态发酵物75.0 85.0%，甘蔗滤泥3.0 5.0%，腐植酸3.0~ ~ ~
5.0%，硫酸钾8.0 10.0%，石灰石粉3.0 5.0%和草木灰1.0 3.0%。
~ ~ ~
6.权利要求1或2所述菌株GF‑32a或权利要求3所述微生物菌系或权利要求4所述菌剂或权利要求5所述生物菌肥在花生土壤改良修复中的应用。
7.一种重茬花生土壤改良修复的方法，其特征在于，包括以下步骤：在花生播种前，向播种地中撒施权利要求3所述微生物菌系或权利要求4所述菌剂或权利要求5所述生物菌肥。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述生物菌肥的撒施量为40 80kg/亩。
~
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，在所述撒施时，还包括撒施无机复合肥20
30kg/亩。
~
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述撒施后还包括深翻25 30cm，将所述微~生物菌肥翻入土壤，并在播种时沟施所述无机复合肥。
说明书 :
一种花生根际微生物菌系及其生物菌肥在土壤改良修复上的
方法
技术领域
[0001] 本发明属于土壤改良技术领域，具体涉及一种花生根际微生物菌系及其制备的生物菌肥在土壤改良修复上的方法。
背景技术
[0002] 花生是我国主要油料作物和经济作物之一，花生果腐病是世界范围内普遍发生的一种土传病害，在北美、澳洲、亚洲、非洲等地对花生果腐病均有报道。近年来，花生果腐病在河北、河南、山东、辽宁等花生主产区均有发生，且有逐年加重的趋势，已成为我国花生主产区的主要病害。花生果腐病可导致30%左右花生荚果腐烂，严重威胁着花生产业的健康发展。
[0003] 重茬（连作障碍）可加重花生果腐病的发生，导致50%以上的减产，甚至绝收。重茬（连作障碍）加重花生果腐病发生的主要原因有四方面：其一，高氮磷钾化肥的过量施用，缺乏有机质的施用，以及钙铁镁等矿质元素的未合理补充，从而导致土壤营养元素失衡。一般情况下，花生重茬地块积累了充足的氮磷钾，而缺少充足的有机质和可吸收利用的钙铁镁等矿质元素。其二，花生根系分泌的苯甲酸，对羟基苯甲酸，香草酸和香豆酸等酚酸类化感自毒物质的大量累积，从而抑制花生的正常生长作用。其三，芽孢杆菌、链霉菌等土壤有益菌不断减少，而镰刀菌等病原微生物不断积累，导致土壤微生物益生菌和有害菌菌群种类和数量失衡，土壤自身对病原微生物的约束力和抑制作用下降。其四，土壤酸化，植物或某些微生物对关键的营养元素利用受到影响，同时土壤酸化可改变土壤微生物群落组成，破坏植物的生物屏障，有利于病原菌的致病性。总之，以上四点因素导致重茬地块花生荚果和根系发育受阻，花生果腐病、根茎腐等土传病虫害逐年加重，亟需一种花生重茬地专用土壤修复改良剂来培育健康土壤，降低土传病虫害的发生，从而达到优质高产的目的。
[0004] 目前，我国花生主栽品种对花生果腐病普遍易感，尤其是高油酸品种，还没有可推广的高抗品种。尽管何美敬等和于静等均采用自然病圃鉴定法对国内外花生种质资源进行抗果腐病评价，获得了2份高抗种质资源，但距离培育出抗病品种用于生产还有较长的路要走。化学药剂在防治土传病害方面存在药效期短、环境不友好等不足。生物防治却能够弥补其上述不足，在土传病害防治表现出良好的应用前景。目前，在花生果腐病的生物防治方面报道了一些的优良菌株，但生防微生物在田间防治实践中防病效果不稳定，也不均一，导致实际生产中对该病害仍然无药可用。这是由于生防菌株仅考虑了其对病原菌的抑制作用，而没有考虑其生存的土壤微环境以及与其它微生物或植物之间的相互作用，导致其在田间情况下无法定殖，即便部分定殖后，也没有改变病原菌赖以生存的土壤环境，也没有促进微生物、作物和土壤的协同作用。因此，亟需一种微生物‑有机‑无机相结合的制剂，不仅能改变土壤微环境，使有益微生物有效定殖，还能与花生形成相互作用，促进健康发育。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种花生根际微生物菌系及其生物菌肥在土壤改良修复上的方法，能够有效降低重茬地块花生果腐病发病率和提高花生产量，降低因过量施用化肥和农药导致的农药残留的产品或方法，从而实现防病、保果、增产。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）GF‑32a，所述菌株GF‑32a已完成保藏，保藏编号为CGMCC No.22902。
[0008] 优选的，所述菌株GF‑32a的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 本发明还提供了一种重茬地花生改良的微生物菌系，所述微生物菌剂包括所述菌株GF‑32a，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）GD‑16和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GF‑3。
[0010] 优选的，以有效活菌数计，所述菌株GF‑32a、菌株GD‑16和GF‑3的活菌数比为0.05‑0.1亿/g：0.2‑0.5亿/g：0.5‑1.0亿/g。
[0011] 优选的，所述微生物菌肥（生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂））中还包括以下质量百分含量的原料：畜禽粪便固态发酵物75.0 85.0%，甘蔗滤泥3.0 5.0%，腐植酸~ ~3.0 5.0%，硫酸钾8.0 10.0%，石灰石粉3.0 5.0%和草木灰1.0 3.0%。
~ ~ ~ ~
~ ~ ~ ~
[0012] 本发明还提供了上述菌株GF‑32a或上述微生物菌肥在花生土壤改良修复中的应用。
[0013] 本发明还提供了一种重茬花生土壤改良修复的方法，包括以下步骤：在花生播种前，向播种地中撒施上述微生物菌剂。
[0014] 优选的，所述微生物菌剂的撒施量为40 80kg/亩。~
[0015] 优选的，所述在所述撒施时，还包括撒施无机复合肥20 30kg/亩。~
[0016] 优选的，所述撒施后还包括深翻25 30cm，将所述微生物菌剂翻入土壤，并在播种~时沟施所述无机复合肥。
[0017] 有益效果：本发明研制了一种生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂），其包含对花生果腐病病原菌具有抑制作用的菌株，同时包含具有溶磷、解钾、固氮、调节pH和降解花生自毒物质能力的菌株，以及分泌植物生长调节剂的菌株。将这些菌株复配应用于花生种植中，其相较于单独具备对生果腐病有防治效果的菌株具有显著的促生、防病和增产作用。同时，该生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）将微生物菌系、有机质和无机复合肥搭配施用防治花生果腐病，不仅能通过促生菌协同增效作用及其生物有机肥的促生作用增加产量，还能通过生防菌株和促生菌株的协同作用防治花生果腐病而提高产量。相较于防效明显的化学农药（悬浮种衣剂，在本发明中将化学农药种衣剂拌种设置为空白对照）和微生物菌肥（例如解淀粉芽孢杆菌）具有显著、均一且稳定的防治效果和增产作用，说明该菌株间具有协同作用。
[0018] 具体试验表现：
[0019] （1）盆栽试验中，相较于单一微生物处理，利用GF‑32a，GD‑16和GF‑3制备的复合微生物菌剂具有显著地促进主根生长的作用。
[0020] （2）小区试验结果表明：复合微生物菌剂制备的生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）在出苗率和产量方面均好于常规对照（GF‑32a，GD‑16或GF‑3单独制备得到的生物有机肥）以及空白对照（化学药剂）。
[0021] （3）田间防治花生果腐病试验结果表明：利用悬浮种衣剂（3%咯菌腈+3%噻呋酰胺）拌种冀花16号（空白对照）花生果腐病发生严重，两年的病情指数分别为36.49±3.82和33.46±4.15，可见化学药剂处理（空白对照）对花生果腐病的田间防治效果十分有限。
[0022] 生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）对花生果腐病的防治效率高达90.50%±1.15%至96.23%±1.78%，增产率达到41.39%±3.11%至42.34%±5.63%，防治效果和增产效果均显著好于其他处理，且效果稳定。 总之，生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）对重茬地块花生果腐病具有良好的防治效果和增产效果。
[0023] 生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）改善了土壤中的微生物群落结构，降低了病原真菌的丰度，可减少病原菌对花生果的侵染，有助于降低发病率。同时有益细。
[0024] 生物保藏
[0025] 胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)，其菌株定名为GF‑32a， 已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编：100101，保藏编号为22902；
保藏编号为为CGMCC No.22902；
保藏编号为为CGMCC No.22902；
[0026] 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其菌株定名为GD‑16，已于2021 年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编： 100101；保藏编号为CGMCC No.24218；
[0027] 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其菌株定名为GF‑3，已 于2018年2月7日出版在微生物学报，文章名字为《花生侵脉新赤壳菌果 腐病生防芽孢杆菌的分离鉴定及防病效果》。
附图说明
[0028] 图1显示了GF‑32a菌株的菌落形态；
[0029] 图2显示了GF‑32a菌株的菌体形态；
[0030] 图3显示了GF‑32a菌株溶磷解钾固氮的初步验证结果；
[0031] 图4显示了GF‑32a菌株降解花生自毒物质的初步验证结果；
[0032] 图5显示了土壤中门水平真菌群落结构变化；
[0033] 图6显示了土壤中属水平真菌群落结构变化。
具体实施方式
[0034] 本发明之一提供了一种胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）GF‑32a，其保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2021年7月
15日，保藏编号为CGMCC No. 22902。
15日，保藏编号为CGMCC No. 22902。
[0035] 本发明之二提供了一种微生物菌系‑有机‑无机“三位一体”重茬地花生改良修复方法，所述方法包括如所述的胶质类芽孢杆菌GF‑32a，与巨大芽孢杆菌GD‑16和解淀粉芽孢杆菌GF‑3组成功能互补的复合微生物菌系，可定殖于根际、根表和根内，形成“三位一体”功能微生物防护菌系。所述方法还包括微生物菌系、固态发酵有机质以及花生所需矿质元素“三位一体”组合，用于改良土壤理化特性、调节作物所需营养物质、增加有益微生物、控制有害微生物、调整微生物菌群、降解花生根系自毒物质以及提高花生免疫力，达到促生增产、抗重茬和防控花生果腐病的作用。
[0036] 如发明之一所述的胶质类芽孢杆菌，所述应用为定殖于根系土壤，具有降解花生自毒物质、溶磷、解钾、调节pH等功能中的至少一种，从而改善根际土壤微生态环境，降低连作障碍。巨大芽孢杆菌，所述应用为定殖于根系土壤，具有溶磷、解钾、分泌IAA等功能中的至少一种，从而促进花生生长和增产。所述的解淀粉芽孢杆菌，所述应用为在蔗糖及其衍生物诱导下进行固体表面运动（Solid‑Surface Swarming, SSM），在土壤墒情相对较低的情况下定殖于根表和根内，对花生果腐病病原菌—新孢镰刀菌具有显著的抑制作用，从而提高植物免疫力，调整微生物菌群，防治花生果腐病。
[0037] 本发明之三提供了一种生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）的配方及制备方法：（1）胶质类芽孢杆菌GF‑32a、巨大芽孢杆菌GD‑16和解淀粉芽孢杆菌GF‑3纯菌进行液态发酵，利用硅藻土制备成菌剂。（2）0.05‑0.1亿/g 胶质类芽孢杆菌菌剂，0.2‑0.5亿/g巨大芽孢杆菌菌剂，0.5‑1.0亿/g解淀粉芽孢杆菌菌剂，畜禽粪便固态发酵物75.0%‑85.0%，甘蔗滤泥3.0%‑5.0%，腐植酸3.0%‑5.0%，硫酸钾8.0%‑10.0%，石灰石粉3.0%‑5.0%，草木灰1.0%‑3.0%，按比例混合。
[0038] 本发明之四提供了一种生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）组合施用方法： 40‑80kg/亩花生专用土壤改良修复剂在播种前撒施于沙土或者沙壤土表面（含水量15‑20%），25‑30厘米深翻，播种时沟施20‑30kg/亩无机复合肥（N：P2O5：K2O=15:15:15）。
[0039] 如发明之三所述肥料的应用，其特征在于，所述应用为防治花生果腐病、通过溶磷、解钾、固氮、帮助有益菌定殖或分泌IAA等功能促进生长、降解花生自毒物质、调节微生物群落结构和土壤pH，从而拮抗病原微生物，改善土壤环境，提高植物免疫，有效降低重茬地花生果腐病的病情指数，达到防治花生土传病害和增产目的。
[0040] 在一个具体实施方式中，所述应用为防治花生果腐病，通过溶磷、解钾、固氮、促进有益菌定殖或分泌IAA等功能促进花生生长，增加矿质元素、降解花生自毒物质、调节微生物群落结构和土壤pH等调整土壤理化性质，从而拮抗病原微生物，改善土壤微环境，提高植物免疫，有效降低重茬地花生果腐病的病情指数，达到防治花生土传病害和增产目的。
[0041] 在一个具体实施方式中，在花生播种前，施用如本发明之二所述的组合物和本发明之三所述的生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）中的一种。
[0042] 在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。
[0043] 下面结合实施例对本发明提供的一种花生根际微生物菌系及其生物菌肥在土壤改良修复上的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0044] 实施例1
[0045] 菌株的分离纯化
[0046] 自河北省石家庄市新乐市承安镇赤支村、河北省秦皇岛市昌黎县河北科技师范学院农场、昌黎县白坨子等3个自然村花生根际土壤样品取10g土壤样品置于250mL锥形瓶中，加入90 mL无菌水，并放入三颗玻璃珠，220 rpm于摇床中摇动30 min，静置30 sec，制备得‑1 ‑1到10 土壤稀释液；用移液器从10 土壤稀释液中吸出1 mL，加入盛有9 mL无菌水的大试管‑2 ‑2
中，充分混匀制备得到10 土壤稀释液；再从10 土壤稀释液中吸出1 mL，加入盛有9 mL无‑3 ‑3 ‑4 ‑5
菌水的大试管中，混匀后得到10 土壤稀释液，以此类推，分别制备得到10 ，10 ，10 土壤‑3 ‑4 ‑5
稀释液，随后分别吸取100 μl稀释度为10 、10 、10 的土壤稀释液通过硅酸盐培养基（配方如下：蔗糖5.0 g，琼脂20.0 g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g，CaCO3 0.1g，FeCl3 0.1g，蒸馏水定容至1000.0 mL，自然pH）采用稀释涂布平板法进行涂布，每个浓度下的样品重复三次，
28℃倒置培养2天。挑取单菌落，采用平板划线法进行分离纯化培养，获得GF‑32a，20%甘油‑
20℃保存，备用。
中，充分混匀制备得到10 土壤稀释液；再从10 土壤稀释液中吸出1 mL，加入盛有9 mL无‑3 ‑3 ‑4 ‑5
菌水的大试管中，混匀后得到10 土壤稀释液，以此类推，分别制备得到10 ，10 ，10 土壤‑3 ‑4 ‑5
稀释液，随后分别吸取100 μl稀释度为10 、10 、10 的土壤稀释液通过硅酸盐培养基（配方如下：蔗糖5.0 g，琼脂20.0 g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g，CaCO3 0.1g，FeCl3 0.1g，蒸馏水定容至1000.0 mL，自然pH）采用稀释涂布平板法进行涂布，每个浓度下的样品重复三次，
28℃倒置培养2天。挑取单菌落，采用平板划线法进行分离纯化培养，获得GF‑32a，20%甘油‑
20℃保存，备用。
[0047] 菌株GD‑16和GF‑3为本实验室保存菌株，其中菌株GF‑3的分类鉴定详见《花生侵脉新赤壳菌果腐病生防芽孢杆菌的分离鉴定及防病效果》。
[0048] 实施例2 菌株的鉴定
[0049] （1）形态鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》：GF‑32a为革兰氏阴性菌，菌落为圆形，突起，如半粒玻璃球；无色透明，表面光滑，粘稠，弹性大，可拉成丝状（图1），菌体粗长杆状，有厚荚膜，孢大，椭圆形中生，菌体大小为0.9～1.0μm×2.5～4.0μm（图2）。GD‑16为革兰氏阳性菌，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，粘稠易挑起，不透明，边缘整齐，杆状，多双杆连生，产芽孢，1.32‑1.70×3.73‑6.60μm。
[0050] GF‑32a于硅酸盐培养基上活化，GD‑16菌株于LB培养基上活化后，分别通过梅里埃VITEK‑2 Compact全自动细菌鉴定及分析系统和生化鉴定卡对其生理生化特性进行分析测定。
[0051] 表1 GF‑32a生理生化鉴定
[0052] BXYL + AGAL + INO + dMNE + PVATE ‑ NaCl6.5% ‑LysA ‑ ALaA (+) MdG + dMLZ + AGLU ‑ KAN ‑
AspA ‑ TyrA + ELLM ‑ NAG ‑ dTAG ‑ OLD ‑
LeuA + BNAG + MdX ‑ PLE + dTRE (‑) ESC +
PheA + APPA ‑ AMAN + IRHA + INU + TTZ ‑
ProA ‑ CDEX ‑ MTE + BGLU + dGLU + POLYB_R ‑
BGAL + dGAL + GlyA ‑ BMAN + dRIB (+)
PyrA ‑ GLYG (+) dMAN ‑ PHC ‑ PSCNa ‑
AspA ‑ TyrA + ELLM ‑ NAG ‑ dTAG ‑ OLD ‑
LeuA + BNAG + MdX ‑ PLE + dTRE (‑) ESC +
PheA + APPA ‑ AMAN + IRHA + INU + TTZ ‑
ProA ‑ CDEX ‑ MTE + BGLU + dGLU + POLYB_R ‑
BGAL + dGAL + GlyA ‑ BMAN + dRIB (+)
PyrA ‑ GLYG (+) dMAN ‑ PHC ‑ PSCNa ‑
[0053] 表2 GD‑16生理生化鉴定
[0054] AMY ‑ AspA ‑ PyrA + dRIB ‑ dMAN + dTRE +PIPLC ‑ BGAR + BGUR ‑ ILATk + dMNE ‑ ADH2s ‑
dXYL ‑ AMAN ‑ AlaA ‑ LAC + MBdG ‑ OPTO +
ADH1 + PHOS (‑) TyrA + NAG + PUL ‑
BGAL + LeuA ‑ dSOR + dMAL + dRAF +
AGLU (‑) ProA ‑ URE ‑ BACI ‑ O129R ‑
APPA ‑ BGURr ‑ POLYB ‑ NOVO ‑ SAL +
CDEX ‑ AGAL + dGAL + NC6.5 + SAC +
dXYL ‑ AMAN ‑ AlaA ‑ LAC + MBdG ‑ OPTO +
ADH1 + PHOS (‑) TyrA + NAG + PUL ‑
BGAL + LeuA ‑ dSOR + dMAL + dRAF +
AGLU (‑) ProA ‑ URE ‑ BACI ‑ O129R ‑
APPA ‑ BGURr ‑ POLYB ‑ NOVO ‑ SAL +
CDEX ‑ AGAL + dGAL + NC6.5 + SAC +
[0055] （3）16S rDNA测序及序列分析
[0056] 利用煮沸法提取菌株基因组DNA，以16S rDNA的通用引物16SF（SEQ ID No.3）和16SR（SEQIDNo.4）为模板，进行PCR扩增，扩增后的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段并与T‑easy载体连接，连接完成后将所得产物转化至E.coli JM109感受态细胞，于LB固体平板中依次加入16μl IPTG溶液、40μl X‑gal溶液和150 μL菌液并涂匀，37°C培养过夜。通过筛选蓝白斑选取阳性克隆进行PCR和电泳检测。将检测成功的阳性克隆的菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。序列结果用软件DNAMAN 6.0拼接，得到
1501bp GF‑32a和1516bp GD‑16菌株的16S rDNA序列，如SEQ ID No. 1和SEQIDNo.2所示。
将其于GenBank中进行BLAST比对分析，结果显示GF‑32a菌株与基因登录号为AY646228的胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）的16S rDNA序列相似度为99.87%，菌株GD‑
16与Bacillus megaterium（基因登录号：CP049296&MN240409）的16S rDNA序列相似度为
99.60%。
1501bp GF‑32a和1516bp GD‑16菌株的16S rDNA序列，如SEQ ID No. 1和SEQIDNo.2所示。
将其于GenBank中进行BLAST比对分析，结果显示GF‑32a菌株与基因登录号为AY646228的胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）的16S rDNA序列相似度为99.87%，菌株GD‑
16与Bacillus megaterium（基因登录号：CP049296&MN240409）的16S rDNA序列相似度为
99.60%。
[0057] 基于以上结果，将GF‑32a定名为胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）GF‑32a（以下简称GF‑32a），将GD‑16定名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）GD‑16（以下简称GD‑16）。
[0058] 实施例3 溶磷解钾固氮能力的初步验证
[0059] 在超净操作台中用平板划线法将GF‑32a菌株的菌液在硅酸盐培养基（配方如下：蔗糖5.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g，CaCO3 0.1g，0.5% FeCl3·H2O 1.0mL，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000.0mL， pH7.2‑7.4）上进行活化，将GD‑16和GF‑3菌株在LB培养基（配方如下：酵母浸粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0）上进行活化，用移液枪用的1mL枪头在活化后的培养物上打出大小一致的菌饼，然后将菌饼分别放在解钾培养基（GF‑32a的培养基配方如下葡萄糖5g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，硫酸镁0.3g，磷酸氢二钠2g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，钾长石2g，琼脂20g）、解钾菌分离培养基（GD‑
16和GF‑3的培养基配方如下：Na2HPO4 2.0g，蔗糖5.0g，MgSO4•7H2O 5.0mg，FeCl3 5.0mg，碳酸钙1.0g，钾长石粉10.0g，蒸馏水1000.0mL，琼脂2.0g，pH7.3）、无氮培养基（配方如下，甘露醇10g，KH2PO4 0.20g，MgSO4•7H2O 5.0mg，氯化钠0.20g，CaCO3 5.0g，CaSO4•2H2O 0.10g，蒸馏水1000.0mL，琼脂20.0g，pH 7.3）、解有机磷菌分离培养基（配方如下：(NH4)2SO4
0.50g，MgSO4 0.30g，氯化钠0.30g，KCl 0.30g，CaCO3 1.0g，FeSO4 0.03g，卵磷脂0.20g，琼脂20.0g，葡萄糖10.0g，MnSO4 0.03g，蒸馏水1000.0mL，pH 7.0）以及解无机磷菌分离培养基（配方如下：(NH4)2SO4 0.50g，MgSO4 0.30g，氯化钠 0.30g，Ca3(PO4)2 10.0g，葡萄糖
10.0g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，琼脂20.0g，蒸馏水1000.0mL，pH 7.2）上在30℃下进行培养，3天后观察发现GF‑32a能在解钾培养基中生长出现油滴状菌落，在解有机磷菌分离培养基和解无机磷菌分离培养基周围会出现水解圈，解圈直径分别为5mm和5mm，且能在无氮培养基上生长，说明其具备溶磷解钾固氮能力（图3），GD‑16在解钾菌分离培养基、解有机磷菌分离培养基、解无机磷菌分离培养基周围会出现水解圈，解钾水解圈为直径9mm，解有机磷水解圈为直径11mm，解无机磷水解圈直径为11mm，且能在无氮培养基继续生长，说明GD‑16具备分解钾、溶解无机磷、有机磷以及固氮的能力。
16和GF‑3的培养基配方如下：Na2HPO4 2.0g，蔗糖5.0g，MgSO4•7H2O 5.0mg，FeCl3 5.0mg，碳酸钙1.0g，钾长石粉10.0g，蒸馏水1000.0mL，琼脂2.0g，pH7.3）、无氮培养基（配方如下，甘露醇10g，KH2PO4 0.20g，MgSO4•7H2O 5.0mg，氯化钠0.20g，CaCO3 5.0g，CaSO4•2H2O 0.10g，蒸馏水1000.0mL，琼脂20.0g，pH 7.3）、解有机磷菌分离培养基（配方如下：(NH4)2SO4
0.50g，MgSO4 0.30g，氯化钠0.30g，KCl 0.30g，CaCO3 1.0g，FeSO4 0.03g，卵磷脂0.20g，琼脂20.0g，葡萄糖10.0g，MnSO4 0.03g，蒸馏水1000.0mL，pH 7.0）以及解无机磷菌分离培养基（配方如下：(NH4)2SO4 0.50g，MgSO4 0.30g，氯化钠 0.30g，Ca3(PO4)2 10.0g，葡萄糖
10.0g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，琼脂20.0g，蒸馏水1000.0mL，pH 7.2）上在30℃下进行培养，3天后观察发现GF‑32a能在解钾培养基中生长出现油滴状菌落，在解有机磷菌分离培养基和解无机磷菌分离培养基周围会出现水解圈，解圈直径分别为5mm和5mm，且能在无氮培养基上生长，说明其具备溶磷解钾固氮能力（图3），GD‑16在解钾菌分离培养基、解有机磷菌分离培养基、解无机磷菌分离培养基周围会出现水解圈，解钾水解圈为直径9mm，解有机磷水解圈为直径11mm，解无机磷水解圈直径为11mm，且能在无氮培养基继续生长，说明GD‑16具备分解钾、溶解无机磷、有机磷以及固氮的能力。
[0060] 实施例4 溶磷能力的测定
[0061] 定量测定菌株对磷酸盐的溶解能力：于PKO液体培养基（配方如下：氯化钠0.3g，葡萄糖10g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，七水合硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，蒸馏水1000mL，调节pH 7.0）中接种活化好的GF‑32A、GD‑16和GF‑3菌株，30°C震荡培养3d，收集离心后的上清液，用钼蓝比色法，首先取5只50mL比色管，编成1、2、4、
6、8五个号码，按号码顺序分别加入磷标准2号液（磷标准溶液：称取无水的磷酸二氢钾
0.4391g溶于1000mL水中作为1号液，含磷0.1mg/mL，吸取1号液10mL，加水稀释至100mL含磷
0.01mg/mL作为2号液，比色用。）1、2、4、6、8mL，再按顺序分别加水9、8、6、4、2mL。接着向5只管内各加浓度百分比为0.015%硫酸联氨溶液8.0mL，以及各加浓度百分比为2.5%钼酸钠稀硫酸溶液（量取140mL硫酸注入300mL水中，摇匀，冷却至室温，加入12.5g钼酸钠，溶解后加水至500mL，摇匀，静置24h备用。）2.0mL加塞，摇匀，去塞，将5只管置于正在沸腾的水浴中加热10 min，取出冷却至室温，用水稀释至50mL充分摇匀，经10min后，用分光光度计计在波长
650nm下，用1cm液槽，用水调整零点，分别测定消光值。以消光值为纵坐标，以磷（0.01、
0.02、0.04、0.06、0.08mg）为横坐标绘制标准曲线。比色时用移液管吸取被测液10mL注入
50mL比色管中，加入0.015%硫酸联氨8.0mL，加2.0mL钼酸钠稀硫酸溶液，加塞，摇匀，将比色管置于正在沸腾的水浴中加热10min，取出冷却至室温，用水稀释至50mL充分摇匀，经10min后，用分光光度计在650nm下，用1cm液槽，用水调整零点，测定消光值。对上清液中有效磷的含量进行测定，结果见表3。GF‑32a，和GD‑16溶磷效率分别为70.52%和88.35%。
6、8五个号码，按号码顺序分别加入磷标准2号液（磷标准溶液：称取无水的磷酸二氢钾
0.4391g溶于1000mL水中作为1号液，含磷0.1mg/mL，吸取1号液10mL，加水稀释至100mL含磷
0.01mg/mL作为2号液，比色用。）1、2、4、6、8mL，再按顺序分别加水9、8、6、4、2mL。接着向5只管内各加浓度百分比为0.015%硫酸联氨溶液8.0mL，以及各加浓度百分比为2.5%钼酸钠稀硫酸溶液（量取140mL硫酸注入300mL水中，摇匀，冷却至室温，加入12.5g钼酸钠，溶解后加水至500mL，摇匀，静置24h备用。）2.0mL加塞，摇匀，去塞，将5只管置于正在沸腾的水浴中加热10 min，取出冷却至室温，用水稀释至50mL充分摇匀，经10min后，用分光光度计计在波长
650nm下，用1cm液槽，用水调整零点，分别测定消光值。以消光值为纵坐标，以磷（0.01、
0.02、0.04、0.06、0.08mg）为横坐标绘制标准曲线。比色时用移液管吸取被测液10mL注入
50mL比色管中，加入0.015%硫酸联氨8.0mL，加2.0mL钼酸钠稀硫酸溶液，加塞，摇匀，将比色管置于正在沸腾的水浴中加热10min，取出冷却至室温，用水稀释至50mL充分摇匀，经10min后，用分光光度计在650nm下，用1cm液槽，用水调整零点，测定消光值。对上清液中有效磷的含量进行测定，结果见表3。GF‑32a，和GD‑16溶磷效率分别为70.52%和88.35%。
[0062] 表3 菌株溶磷效率
[0063] 菌株编号 磷含量（mg/l） 溶磷效率（%）GD‑16 206.7122 88.35%
GF‑32a 187.1507 70.52%
CK 109.7506 ‑‑
GF‑32a 187.1507 70.52%
CK 109.7506 ‑‑
[0064] 实施例5 解钾能力的测定
[0065] 用无菌去离子水制备GF‑32a，GD‑16和GF‑3菌悬液，离心后弃上清（OD600约为0.5）。接种5mL菌悬液于装有95mL缺钾培养基（配方如下：10.0 g/L蔗糖，2.0g/L Na2HPO4，1.0 g/L (NH4)2SO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L NaCl，0.5 g/L酵母粉，10.0 g/L钾长石粉，pH7.2‑7.4。115℃高压蒸汽灭菌30min）的250mL三角瓶中，以加入同体积的无菌水作为空白对照，在28℃、180rpm/min的条件下振荡培养7d。培养液经H2O2处理后在火焰光度计上测定溶液中Ｋ＋浓度。取细菌培养液10mL，加入2mL 6%H2O2，在沸水浴中消化1h，取消化液＋
8000rpm/min离心5min，取上清在火焰光度计上测定Ｋ 浓度。钾标准溶液用不加钾长石粉的缺钾培养基配制。
8000rpm/min离心5min，取上清在火焰光度计上测定Ｋ 浓度。钾标准溶液用不加钾长石粉的缺钾培养基配制。
[0066] 1mol/L中性NH4OAc溶液：称取化学纯CH3COONH4 77.09g加水稀释，定容至近1L。用HOAC或NH3·H2O调至pH 7.0，然后稀释至1L。100μg/mL钾标准贮备溶液：称取KCl（分析纯，110℃烘干2h）0.1907g溶于不加钾长石粉的缺钾培养基或无菌去离子水或1mol/L NH4OAc溶液中，定容至1L，即为含100μg/mL钾标准贮备液。钾系列标准溶液：分别准确吸取100μg/mL钾标准贮备液0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0mL放入100mL容量瓶中，用不加钾长石粉的缺钾培养基定容，即得0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL钾系列标准溶液。
[0067] 结果显示（表4），GF‑32a和GD‑16均具有解钾能力，其中，GF‑32a解钾能力最强，解钾效率高达84.37%。
[0068] 表4 菌株解钾效率
[0069] 菌株编号 钾含量（μg/mL） 解钾效率（%）GD‑16 8.94 48.10
GF‑32a 11.13 84.37
CK 6.04 ‑‑
GF‑32a 11.13 84.37
CK 6.04 ‑‑
[0070] 实施例6 菌株降解自毒物质初筛
[0071] 采用琼脂块法进行实验，将GF‑32a接种于以浓度为100mg/L酚酸类物质为唯一碳源的硅酸盐培养基琼脂平板上，GD‑16和GF‑3接种于无机盐培养基琼脂平板上（配方如下：(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 1.3g，酚酸类物质 100mg，NaCl 5g，水 1000mL，pH6.8‑
7.2），以不同的酚酸作为唯一碳源进行培养，48h后观察菌株的生长情况。结果表明，三株菌均能降解酚酸类物质，但GD‑16和GF‑3降解能力较弱，GF‑32a降解能力较强（图4）。
7.2），以不同的酚酸作为唯一碳源进行培养，48h后观察菌株的生长情况。结果表明，三株菌均能降解酚酸类物质，但GD‑16和GF‑3降解能力较弱，GF‑32a降解能力较强（图4）。
[0072] 实施例7 IAA的定性测定
[0073] 在加入L‑色氨酸（80mg/L）的硅酸盐液体培养基和LB液体培养基中分别接种纯化的GF‑32a和GD‑16、GF‑3菌株，30°C震荡培养24h，用Salkowski比色法测定菌株能否分泌IAA。操作方法如下：取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等体积的Salkowski比色液（50mL 35%HClO4+1mL 0.5mol/L FeCl3），并以加入50μL未接菌的LB液体培养基与等体积比色液的混合溶液为对照。将白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变粉红者为阳性，表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。结果空白对照、GF‑32a和GF‑3均未变色，表明为阴性，不能分泌IAA。GD‑16的颜色变为粉红色，表明为阳性说明其具备分泌IAA的能力，能够促进花生植株生长。
[0074] 实施例8 最适pH测定
[0075] 分别挑取GF‑32a和GD‑16、GF‑32a单菌落于液体硅酸盐培养基和LB液体培养基中活化，将GF‑32a按照5%的接种量接种于10mL不同pH的硅酸盐液体培养基中，将GD‑16和GF‑3按照5%的接种量接种于10mL不同pH的LB液体培养基中，培养基pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。每个处理设置3个重复。30℃，200rpm/min震荡培养，GF‑32a震荡培养‑3 ‑4 ‑5
24h后，取1mL菌悬液加入9mL无菌水中，进行系列梯度稀释，选取10 ，10 ，10 系数梯度样品涂布，30℃培养48h计数。GD‑16和GF‑3震荡培养6h后测定OD600。结果见表5和表6，GF‑32a的最适pH在6.0‑7.0之间，GD‑16最适pH为7.0左右，GF‑3最适pH为6.0左右，这表明三株菌最适pH为弱酸性或中性，为花生专用土壤修复剂的配方研制以及益生菌在花生根际土壤定殖提供了理论依据。
24h后，取1mL菌悬液加入9mL无菌水中，进行系列梯度稀释，选取10 ，10 ，10 系数梯度样品涂布，30℃培养48h计数。GD‑16和GF‑3震荡培养6h后测定OD600。结果见表5和表6，GF‑32a的最适pH在6.0‑7.0之间，GD‑16最适pH为7.0左右，GF‑3最适pH为6.0左右，这表明三株菌最适pH为弱酸性或中性，为花生专用土壤修复剂的配方研制以及益生菌在花生根际土壤定殖提供了理论依据。
[0076] 表5 不同pH下GF‑32a摇瓶发酵的计数结果（48h）
[0077] pH GF‑32a（105 cfu/mL）3.0 0.00±0.00c
4.0 0.00±0.00c
5.0 109.00±39.34b
6.0 211.33±60.80a
7.0 242.67±70.44a
8.0 1.33±1.53c
9.0 2.00±0.00c
10.0 0.00±0.00c
4.0 0.00±0.00c
5.0 109.00±39.34b
6.0 211.33±60.80a
7.0 242.67±70.44a
8.0 1.33±1.53c
9.0 2.00±0.00c
10.0 0.00±0.00c
[0078] 表6 不同pH下GD‑16和GF‑3摇瓶发酵的OD600测量值（48h）
[0079] pH GD‑16 GF‑33.0 0.1070±0.0030f 0.0687±0.0055e
4.0 0.1717±0.0035e 0.0743±0.0021ef
5.0 2.1440±0.0520c 0.49307±0.0260c
6.0 2.6640±0.0655b 1.4873±0.0738a
7.0 3.0013±0.0446a 1.3213±0.0480b
8.0 0.5773±0.0085c 0.2503±0.0218d
9.0 0.5017±0.0635d 0.0113±0.0038f
10.0 0.1063±0.0070f 0.0330±0.0066ef
4.0 0.1717±0.0035e 0.0743±0.0021ef
5.0 2.1440±0.0520c 0.49307±0.0260c
6.0 2.6640±0.0655b 1.4873±0.0738a
7.0 3.0013±0.0446a 1.3213±0.0480b
8.0 0.5773±0.0085c 0.2503±0.0218d
9.0 0.5017±0.0635d 0.0113±0.0038f
10.0 0.1063±0.0070f 0.0330±0.0066ef
[0080] 实施例9 糖类诱导的固体表面运动（SSM运动）
[0081] 分别以葡萄糖，果糖，麦芽糖，乳糖替换硅酸盐培养基中的蔗糖制备培养基，于硅酸盐固体培养基上活化GF‑32a后，接种于上述制备的硅酸盐培养基平板中央，以含蔗糖的硅酸盐培养基作为空白对照，30℃培养24h，结果发现葡萄糖，果糖，麦芽糖，乳糖和蔗糖均对胶质类芽孢杆菌于固体表面的运动没有影响（表7）。分别以蔗糖，果糖，麦芽糖，乳糖替换PDA培养基中的葡萄糖制备培养基，在LB培养基中分别添加葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖制备培养基，于LB固体培养基上活化GD‑16和GF‑3后，将GF‑32a接种于上述制备的PDA培养基和LB培养基平板中央，30℃，培养24h，结果表明（表8），与空白对照相比在LB培养基中，葡萄糖和蔗糖能诱导GD‑16在固体表面的运动能力，果糖，乳糖和蔗糖能够诱导GF‑3在固体表面的运动能力；在PDA培养基中，葡萄糖，果糖，麦芽糖对GD‑16的扩散有较好的作用，葡萄糖和蔗糖对GF‑3的扩散有较好的作用。综上所述，蔗糖和葡萄糖均能够诱导GD‑16和GF‑3在固体表面的运动能力，有助于定殖于花生根部表面，在根系表面形成菌膜。这为益生菌在花生根际、根表土壤定殖以及花生专用土壤修复剂的配方研制提供了理论依据。
[0082] 表7 不同糖类对GF‑32a扩散的影响
[0083] GF‑32a菌落直径（cm）
硅酸盐培养基（蔗糖） 0.73±0.08a
硅酸盐培养基（葡萄糖） 0.73±0.09a
硅酸盐培养基（果糖） 0.67±0.10a
硅酸盐培养基（麦芽糖） 0.91±0.24a
硅酸盐培养基（乳糖） 0.78±0.01a
硅酸盐培养基（蔗糖） 0.73±0.08a
硅酸盐培养基（葡萄糖） 0.73±0.09a
硅酸盐培养基（果糖） 0.67±0.10a
硅酸盐培养基（麦芽糖） 0.91±0.24a
硅酸盐培养基（乳糖） 0.78±0.01a
[0084] 表8 不同糖类GD‑16和GF‑3扩散的影响
[0085] GD‑16菌落直径（cm） GF‑3菌落直径（cm）LB 1.19±0.04c 0.73±0.063c
LB+葡萄糖 1.83±0.53a 1.83±0.18c
LB+果糖 1.47±0.08bc 8.05±1.34a
LB+麦芽糖 1.55±0.20abc 1.03±0.11c
LB+乳糖 1.29±0.29bc 4.21±1.32b
LB+蔗糖 1.76±0.22abc 2.35±0.21c
PDA（葡萄糖） 1.45±0.15a 2.40±0.21a
PDA（果糖） 1.46±0.04a 1.40±0.36b
PDA（麦芽糖） 1.48±0.08a 1.20±0.28b
PDA（乳糖） 1.13±0.16b 0.83±0.05b
PDA（蔗糖） 1.22±0.029b 2.42±0.60a
LB+葡萄糖 1.83±0.53a 1.83±0.18c
LB+果糖 1.47±0.08bc 8.05±1.34a
LB+麦芽糖 1.55±0.20abc 1.03±0.11c
LB+乳糖 1.29±0.29bc 4.21±1.32b
LB+蔗糖 1.76±0.22abc 2.35±0.21c
PDA（葡萄糖） 1.45±0.15a 2.40±0.21a
PDA（果糖） 1.46±0.04a 1.40±0.36b
PDA（麦芽糖） 1.48±0.08a 1.20±0.28b
PDA（乳糖） 1.13±0.16b 0.83±0.05b
PDA（蔗糖） 1.22±0.029b 2.42±0.60a
[0086] 实施例10 CaCO3促进GF‑32a生长
[0087] 挑取活化好的GF‑32a菌落于5mL硅酸盐液体培养基，30℃，200rpm，震荡过夜，制备种子液。按照5%的接种量将种子液接种于不同含量CaCO3的硅酸盐液体培养基中，30℃，200rpm/min，震荡培养3d，进行平板菌落计数，并测量发酵液pH值。取震荡培养后的发酵液‑3 ‑4 ‑5
100μL，加入到900μL无菌去离子水中，吹洗混匀，进行系列梯度稀释，获得10 、10 和10 稀释液，取100μL涂布于硅酸盐培养基上，30℃培养48h，计数。每个稀释度进行3重复。结果表明（表9）CaCO3有助于平衡GF‑32a生长代谢过程中产生的酸类物质，调节pH，且浓度在0.3‑
0.5g/L时，发酵液GF‑32a菌体数量最多。这为花生专用土壤修复剂的配方研制以及益生菌在花生根际土壤定殖提供了理论依据。
100μL，加入到900μL无菌去离子水中，吹洗混匀，进行系列梯度稀释，获得10 、10 和10 稀释液，取100μL涂布于硅酸盐培养基上，30℃培养48h，计数。每个稀释度进行3重复。结果表明（表9）CaCO3有助于平衡GF‑32a生长代谢过程中产生的酸类物质，调节pH，且浓度在0.3‑
0.5g/L时，发酵液GF‑32a菌体数量最多。这为花生专用土壤修复剂的配方研制以及益生菌在花生根际土壤定殖提供了理论依据。
[0088] 表9 不同含量CaCO3对GF‑32a生长量的影响（72h）
[0089] CaCO3浓度（g/L） 菌体浓度（106 cfu/mL）0 73.8571±21.5053d
0.1 185.1429±26.0923b
0.2 199.4286±32.5415b
0.3 408.2857±82.6856a
0.4 367.8571±20.9398a
0.5 370.8571±31.4612a
0.8 121.8571±21.8512c
1.6 158.7143±21.4065bc
0.1 185.1429±26.0923b
0.2 199.4286±32.5415b
0.3 408.2857±82.6856a
0.4 367.8571±20.9398a
0.5 370.8571±31.4612a
0.8 121.8571±21.8512c
1.6 158.7143±21.4065bc
[0090] 实施例11 益生菌的液态发酵
[0091] 菌株GF‑32a甘油菌划线于硅酸盐固体培养基，菌株GD‑16、GF‑3甘油菌划线于LB固体培养基，30°C培养48h，即得活化菌；将所述活化菌转接于种子液培养基（种子液培养基即硅酸盐细菌液体培养基和LB液体培养基）中，于30°C、200rpm培养12 h，得第一培养物，作为种子液使用。
[0092] 将第一培养物作为液态摇瓶发酵的种子液，按5%体积的接菌量转接至装有液态发酵培养基（胶质类芽孢杆菌GF‑32a发酵培养基配方如下：糖蜜2.0％、豆粕粉1.0％、MgSO4·7H20 0.2％、K2HPO4 0.08％、CaCO3 0.1％，巨大芽孢杆菌GD‑16发酵培养基配方如下：玉米淀粉 1.0%、豆粉 1.0%、(NH4)2SO4 0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、FeSO4·7H2O 0.03%、K2HPO4·
3H2O 0.02%、KH2PO4 0.01%，解淀粉芽孢杆菌GF‑3发酵培养基配方如下：玉米淀粉1.00%、豆粉 1.00%、(NH4)2SO4 0.50%、MgSO4·7H2O 0.10%、FeSO4·7H2O 0.03%、K2HPO4·3H2O 0.02%、KH2PO4 0.01%、ZnSO4·7H2O 0.04%、CaCO3 0.04%、MnSO4·H2O 0.02%）的三角瓶中，于30°C、
200rpm培养72h后得第二培养物。将所述第二培养物85°C水浴15min以杀死营养体，随后梯‑4 ‑5 ‑6
度稀释并选取浓度为10 、10 、10 的菌悬液进行平板涂布进行计数，每个处理重复3次，
30°C倒置培养24h（GF‑32a倒置培养48h）后选择每个平板中的菌落数在30至300之间的进行
8
平板计数，平板菌落计数结果分别为GF‑32a：4.13±0.07×10个/mL，GD‑16：3.36±0.03×
9 10
10个/mL，GF‑3：1.08±0.06×10 个/mL。
3H2O 0.02%、KH2PO4 0.01%，解淀粉芽孢杆菌GF‑3发酵培养基配方如下：玉米淀粉1.00%、豆粉 1.00%、(NH4)2SO4 0.50%、MgSO4·7H2O 0.10%、FeSO4·7H2O 0.03%、K2HPO4·3H2O 0.02%、KH2PO4 0.01%、ZnSO4·7H2O 0.04%、CaCO3 0.04%、MnSO4·H2O 0.02%）的三角瓶中，于30°C、
200rpm培养72h后得第二培养物。将所述第二培养物85°C水浴15min以杀死营养体，随后梯‑4 ‑5 ‑6
度稀释并选取浓度为10 、10 、10 的菌悬液进行平板涂布进行计数，每个处理重复3次，
30°C倒置培养24h（GF‑32a倒置培养48h）后选择每个平板中的菌落数在30至300之间的进行
8
平板计数，平板菌落计数结果分别为GF‑32a：4.13±0.07×10个/mL，GD‑16：3.36±0.03×
9 10
10个/mL，GF‑3：1.08±0.06×10 个/mL。
[0093] 实施例12生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）的制备
[0094] 将上述第二培养物，离心收集并菌泥，加保护剂后喷雾干燥，分别制备GF‑32a、GD‑16和GF‑3的菌剂，备用。
[0095] 按照0.2‑0.5亿/g 胶质类芽孢杆菌菌剂，0.2‑0.5亿/g巨大芽孢杆菌菌剂，0.5‑1.0亿/g解淀粉芽孢杆菌菌剂分别混合于有机肥（畜禽粪便固态发酵物75.0%‑85.0%，甘蔗滤泥3.0%‑5.0%，腐植酸3.0%‑5.0%，土5.0%‑20.0%），分别制备成GF‑32a生物有机肥、GD‑16生物有机肥和GF‑3生物有机肥，备用。
[0096] 按照0.05‑0.1亿/g 胶质类芽孢杆菌菌剂，0.2‑0.5亿/g巨大芽孢杆菌菌剂，0.5‑1.0亿/g解淀粉芽孢杆菌菌剂与有机肥（畜禽粪便固态发酵物75.0%‑85.0%，甘蔗滤泥3.0%‑
5.0%，腐植酸3.0%‑5.0%，土5.0%‑20.0%）混合，制备成复合微生物肥料，备用。
5.0%，腐植酸3.0%‑5.0%，土5.0%‑20.0%）混合，制备成复合微生物肥料，备用。
[0097] 按照0.05‑0.1亿/g 胶质类芽孢杆菌菌剂，0.2‑0.5亿/g巨大芽孢杆菌菌剂，0.5‑1.0亿/g解淀粉芽孢杆菌菌剂，畜禽粪便固态发酵物75.0%‑85.0%，甘蔗滤泥3.0%‑5.0%，腐植酸3.0%‑5.0%，硫酸钾8.0%‑10.0%，石灰石粉3.0%‑5.0%，草木灰1.0%‑3.0%，比例进行混合，制备得到生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂），备用。
[0098] 实施例13盆栽实验验证促生效果
[0099] 在温室大棚内进行冀花16号花生盆栽实验，每盆装灭菌土1kg，与5 g菌剂混合均匀，播种后定期浇水。各处理分别为0.1 亿/g胶质类芽孢杆菌GF‑32a菌剂、0.2亿/g巨大芽孢杆菌GD‑16菌剂、0.5 亿/g解淀粉芽孢杆菌GF‑3菌剂以及三种复合菌剂（0.1 亿/g GF‑32a 、0.2 亿/g GD‑16和0.5 亿/g GF‑3），并设立空白对照。每个处理3次重复，每个重复40盆，在花生苗出土后出现第一对真叶时记为第0d，统计0d，7d，14d和21d的主根长，检测各个处理的促生能力。
[0100] 由表10可知，接种复合菌株的处理与接种单一菌株的处理相比，主根长度与对照相比更长，有利于花生更好的吸收土壤中的水分和养分，有助于花生生长。
[0101] 表10 菌株对花生植株的影响
[0102]
[0103] 实施例14温室小区试验验证促生及增产效果
[0104] 于河北科技师范学院昌黎校区温室大棚进行小区试验验证花生专用土壤改良修复剂的促生和增产效果。
[0105] 土壤类型为沙壤土，前茬未种植作物，花生品种为冀花16号，处理组施用50kg/亩2
生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂），20cm深翻，每个处理3次重复，每个重复20m 。
生物有机肥为空白对照。统计出苗情况和亩产量，计算出苗率和增产率。
生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂），20cm深翻，每个处理3次重复，每个重复20m 。
生物有机肥为空白对照。统计出苗情况和亩产量，计算出苗率和增产率。
[0106] 结果显示（表11）：生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）处理的出苗率为96.67%，亩产量为341.29kg，增产率为11.96%，GF‑32a生物有机肥和GD‑16生物有机肥的出苗率分别为91.83%和91.33%，亩产量分别为330.52kg和327.09kg，在出苗率和亩产量方面显著高于常规对照。这表明GF‑32a和GD‑16生物有机肥对花生生长具有显著的促进作用。
[0107] 表11 花生出苗率和增产率
[0108] 处理 出苗率（%） 亩产量（kg/亩） 增产率（%）GF‑32a生物有机肥 91.83±1.04b 330.52±16.28b 8.42±0.73b
GD‑16生物有机肥 91.33±1.26b 327.09±15.45c 7.30±0.47c
GF‑3生物有机肥 87.33±4.01bc 306.70±13.30d 0.63±0.31d
生物菌肥（花生专用土壤改良修复剂）96.67±0.76a 341.29±16.96a 11.96±0.77a空白对照 84.33±3.01c 304.79±13.07d 0.00e
GD‑16生物有机肥 91.33±1.26b 327.09±15.45c 7.30±0.47c
GF‑3生物有机肥 87.33±4.01bc 306.70±13.30d 0.63±0.31d
生物菌肥（花生专用土壤改良修复剂）96.67±0.76a 341.29±16.96a 11.96±0.77a空白对照 84.33±3.01c 304.79±13.07d 0.00e
[0109] 实施例15田间防病促生试验
[0110] 2020年分别于河北省迁安市扣庄镇试验田（试验田土壤类型为沙土，播种前肥力水平见表12，重茬3年）和河北省迁安市扣庄乡邓新房子村试验田（试验田土壤类型为沙土，播种前肥力水平见表12，重茬2年）进行生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）及其配套方法的防病促生试验。选用花生品种为“冀花16号”，包括空白对照在内的所有处理的花生种子均利用悬浮种衣剂（3%咯菌腈+3%噻呋酰胺）进行拌种，阴干后备用。
[0111] 各个处理用量：50kg/亩GF‑32a生物有机肥、50kg/亩GD‑16生物有机肥、50kg/亩GF‑3生物有机肥、50kg/亩生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）、50kg/亩复合微生物肥料，50kg/亩有机肥和50kg/亩无机肥（硫酸钾8.0%‑10.0%，石灰石粉3.0%‑5.0%，草木灰1.0%‑3.0%，土82.0%‑88%）做为常规对照，播种前不撒施肥料的处理为空白对照。
[0112] 在播种前沙土或者沙壤土相对含水量65‑70%（含水量15‑20%）时将各个处理的肥料撒施于土壤表面，25‑30厘米深翻，所有处理播种时沟施25kg/亩无机复合肥（总养分≥45%，N‑P2O5‑K2O：15‑15‑15），按照10000‑12000穴/亩的密度覆膜播种。每个处理3次重复，于收获前10d利用五点取样法对花生果腐病病害进行分级调查并测定产量和对花生果腐病的防治效果。荚果分级标准如下：0级：荚果完好，无腐烂症状；1级：果皮有侵染斑点，果实完好；2级：荚果1/2腐烂；3级：荚果1/2以上腐烂。病情指数、防治效率、干果亩产量和增产率分别用公式（1）、（2）、（3）和（4）表示。
[0113] 病情指数＝∑（腐烂果×该腐烂果级值）/（总果数×最高级值）×100
[0114] 公式（1）
[0115] 防治效率（％）＝（空白对照区病情指数－处理区病情指数）/空白对照区病情指×100
[0116] 公式（2）
[0117] 干果亩产量=湿果亩产量×50%×85%
[0118] 公式（3）
[0119] 增产率（％）=（处理区亩产产量－空白对照对照区亩产量）/空白对照区亩产量×100
[0120] 公式（4）
[0121] 田间防病试验表明（表14）：利用悬浮种衣剂拌种冀花16号（3%咯菌腈+3%噻呋酰胺）（空白对照）仍有花生果腐病发生，重茬一年地块病情指数为36.49±3.82，且重茬年数越多花生果腐病发病越严重，重茬两年地块病情指数为33.46±4.15，可见化学药剂处理（空白对照）对花生果腐病的田间防治效果十分有限。
[0122] 在重茬3年地块中（表13），GF‑32a生物有机肥、GD‑16生物有机肥和GF‑3生物有机肥对花生果腐病的防治效率分别为52.78%±2.84%、48.62%±7.70%和50.34%±3.01%，增产率分别为17.63%±5.68%、12.97%±5.88%和14.37%±6.70%，均显著高于空白对照和有机肥。复合微生物肥料的防治效率和增产率分别为65.37%±2.21%和22.52±7.20%，显著高于生物有机肥单独施用。无机肥对花生果腐病的防治效率和增产率分别为54.64%±8.04%和15.43%±3.49%，防治效果和增产率处于单施生物有机肥和生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）之间，与二者差异不显著。生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）对花生果腐病的防治效率和增产率都显著高于其它处理，分别为90.50%±1.15%和41.39%±
3.11%，且效果较为稳定。
3.11%，且效果较为稳定。
[0123] 在重茬2年地块中（表14），单独施用XJ‑32生物有机肥、GF‑32a生物有机肥和GF‑3生物有机肥对花生果腐病的防治效率分别为56.31%±4.22%、57.49%±2.79%和58.70%±3.82%，增产率分别为14.72%±2.73%、17.50%±4.75%和16.37%±4.44%，生物有机肥之间的防治效率和增产率差异较小，但均显著高于空白对照和有机肥。复合微生物肥料的防治效率和增产率分别为70.93%和26.22%，显著高于生物有机肥单独施用。无机肥对花生果腐病的防治效率和增产率分别为61.52%±4.76%和18.57%±3.71%，略好于生物有机肥，低于复合微生物肥料。生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）对花生果腐病的防治效果和增产效果均显著高于其它处理，分别高达96.23%±1.78%和42.34%±5.63%。
[0124] 综上所述：微生物‑有机‑无机复配的生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）在防治效果和增产效果方面均显著微生物、有机肥和无机肥单独施用，这表明生物菌肥（粉剂型花生专用土壤改良修复剂）在微生物、有机肥和无机肥配方上存在协同增效作用。
[0125] 表12 试验田供试土壤肥力水平
[0126] 地点 pH 速效氮（mg·kg‑1）速效磷（mg·kg‑1）速效钾（mg·kg‑1）扣庄镇 5.81±0.18 135.63±8.53 38.72±9.26 102.37±17.52
邓新房子村 6.92±0.14 140.95±16.48 42.15±13.84 98.75±19.05
邓新房子村 6.92±0.14 140.95±16.48 42.15±13.84 98.75±19.05
[0127] 表13 扣庄镇试验田的防治效果
[0128] 处理 病情指数 防治效果（%） 亩产量（kg/亩） 增产率（%）生物菌肥（花生专用土壤改良修复剂） 3.18±0.39e 90.50±1.15a 355.95±7.83a 41.39±3.11a复合微生物肥料 11.59±0.74d 65.37±2.21b 308.45±18.12b 22.52±7.20b
GF‑3生物有机肥 16.62±1.01c 50.34±3.01c 287.93±17.61cd 14.37±6.70cd
GD‑16生物有机肥 17.19±2.58c 48.62±7.70c 284.42±14.80de 12.97±5.88de
GF‑32a生物有机肥 15.80±0.95c 52.78±2.84c 296.14±14.30c 17.63±5.68c
有机肥 27.32±5.09b 18.34±15.20d 277.00±21.26e 10.03±8.45e
无机肥 15.18±2.69cd 54.64±8.04bc 290.60±8.79cd 15.43±3.49cd
空白对照 33.46±4.15a 0.00e 251.76±6.93f 0.00f
GF‑3生物有机肥 16.62±1.01c 50.34±3.01c 287.93±17.61cd 14.37±6.70cd
GD‑16生物有机肥 17.19±2.58c 48.62±7.70c 284.42±14.80de 12.97±5.88de
GF‑32a生物有机肥 15.80±0.95c 52.78±2.84c 296.14±14.30c 17.63±5.68c
有机肥 27.32±5.09b 18.34±15.20d 277.00±21.26e 10.03±8.45e
无机肥 15.18±2.69cd 54.64±8.04bc 290.60±8.79cd 15.43±3.49cd
空白对照 33.46±4.15a 0.00e 251.76±6.93f 0.00f
[0129] 表14 邓新房子村试验田的防治效果
[0130] 处理 病情指数 防治效果（%） 亩产量（kg/亩） 增产率（%）生物菌肥（花生专用土壤改良修复剂） 1.38±0.65e 96.23±1.78a 340.81±13.48a 42.34±5.63a复合微生物肥料 10.61±1.62d 70.93±4.45b 295.55±15.15b 26.22±3.81b
GF‑3生物有机肥 15.07±1.40c 58.70±3.82c 278.64±10.63c 16.37±4.44c
GF‑32a生物有机肥 15.51±1.02c 57.49±2.79c 281.33±11.37c 17.50±4.75c
XJ‑32生物有机肥 15.94±1.54c 56.31±4.22c 274.70±6.54cd 14.72±2.73cd
有机肥 30.84±3.80b 15.48±10.44d 262.97±9.26d 9.83±3.87d
无机肥 14.04±1.74cd 61.52±4.76bc 283.91±8.89c 18.57±3.71bc
空白对照 36.49±3.82a 0.00e 239.44±3.34e 0.00e
GF‑3生物有机肥 15.07±1.40c 58.70±3.82c 278.64±10.63c 16.37±4.44c
GF‑32a生物有机肥 15.51±1.02c 57.49±2.79c 281.33±11.37c 17.50±4.75c
XJ‑32生物有机肥 15.94±1.54c 56.31±4.22c 274.70±6.54cd 14.72±2.73cd
有机肥 30.84±3.80b 15.48±10.44d 262.97±9.26d 9.83±3.87d
无机肥 14.04±1.74cd 61.52±4.76bc 283.91±8.89c 18.57±3.71bc
空白对照 36.49±3.82a 0.00e 239.44±3.34e 0.00e
[0131] 实施例16 微生物群落结构变化
[0132] 利用五点取样法采集邓新房子村试验田花生专用土壤改良修复剂处理（Qa8）和空白对照（CK）处理的花生根际土壤，送至百迈客生物科技有限公司进行基于 Illumina HiSeq 测序平台的双末端测序法（Paired‑End）微生物多样性分析。通过对 Reads 拼接过滤，聚类或去噪，并进行物种注释及丰度分析。结果显示（图5&6）：空白对照（CK）的根际土壤中镰刀菌属、Stagonosporopsis sp.等病原真菌的丰度分别为8.15%和7.84%，约占15.99%。而Qa8处理的根际土壤中镰刀菌属、Stagonosporopsis sp.等病原真菌的丰度分别降低至
1.55%和2.15%，约占3.7%，这表明Qa8处理能够显著降低病原微生物丰度。
1.55%和2.15%，约占3.7%，这表明Qa8处理能够显著降低病原微生物丰度。
[0133] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。