神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备埃博拉病毒疾病药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药领域，特别涉及神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒疾病的药物中的应用，本发明通过加入神经酰胺合成分解相关的抑制剂‑D609、Fumonisin B1导致埃博拉病毒在细胞中形成的包涵体的数量减少、体积下降，还可以阻碍包涵体的成熟，显著抑制埃博拉病毒在细胞中的增殖。本文探索了在神经酰胺轴中以鞘磷脂合酶抑制剂D609、神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1为代表的小分子化合物在埃博拉病毒病治疗中的潜力，为其在临床上用于防治埃博拉病毒提供了新的依据，在埃博拉的治疗领域将有广阔的应用前景。

权利要求

1.神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒疾病的药物中的应用，其特征在于，所述神经酰胺合成分解途径中的抑制剂为神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1。

2.根据权利要求1所述的神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒疾病的药物中的应用，其特征在于，通过加入神经酰胺合成分解途径中的抑制剂导致埃博拉病毒在细胞中形成的包涵体的数量减少、体积下降，阻碍包涵体的成熟，显著抑制埃博拉病毒在细胞中的增殖。

3.根据权利要求1所述的神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述预防或治疗埃博拉病毒相关疾病的药物指如下X1)‑X5)中任一种：X1)制备用于预防或治疗埃博拉病毒感染的药物；

X2)制备用于预防或治疗埃博拉病毒所致疾病的药物；

X3)制备用于抑制埃博拉病毒复制增殖的药物；

X4)制备用于抑制埃博拉病毒产生细胞病变效应的药物；

X5)制备埃博拉病毒抑制剂。

说明书

神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备埃博拉病毒疾病药

物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒相关疾病治疗药物中的应用。

背景技术

[0002] 埃博拉病毒病(EbolaVirusDisease，EVD)是由丝状病毒埃博拉病毒(EbolaVirus，EBOV)感染导致的多脏器损害和急性出血性的人畜共患传染病，又称埃博拉出血热(EbolahemorrhagicFever，EHF)。EVD主要通过人与受感染人的体液和尸体接触传播，具有巨大的流行潜力。目前埃博拉的感染虽然存在地域局限性，但随着国际交流日益频繁，我国与非洲国家存在经济、教育等多领域的合作，更应随时做好防控EVD疫情的准备。因此，研究EBOV的致病机制，寻找EVD治疗靶点，增加疫苗选择可能性显得尤为重要。

[0003] EBOV是单股负链、不分节段RNA病毒，基因组大小约为19kb，基因组结构为：3'‑核蛋白(NP)→病毒蛋白(VP35)→基质蛋白(VP40)→糖蛋白(GP、sGP/ssGP)→VP30→VP24→聚合酶(L)‑5'。EBOV颗粒直径均匀，约为80nm，但长度和形状差异很大(高达14000nm)，其中丝状最具特征。丝状病毒EBOV颗粒的核心结构是核衣壳是，由RNA基因组、NP、VP35、VP30、VP24和L组成。EBOV包涵体(Inclusionbodies，IB)是细胞感染病毒后胞浆或核中出现的特殊结构，常用于病毒病的诊断。EBOV包涵体在感染后6‑12小时出现，位于核周区域。包涵体在病毒生命周期中发挥重要作用，一方面可以处理大量错误折叠的蛋白质，另一方面作为病毒复制和组装的位点，存储大量的病毒及宿主蛋白从而促进病毒复制、翻译以及病毒粒子在细胞内与细胞间的运输。

[0004] 三环癸烷‑9‑基黄原酸酯(Tricyclodecan‑9‑yl‑xantogenate)简称D609，以其抗病毒和抗肿瘤特性而闻名。D609主要通过抑制磷脂酰胆碱(PC)特异性磷脂酶C(PC‑PLC)和鞘磷脂合酶(SMS)发挥作用。抑制PC‑PLC会影响脂质第二信使1，2‑二酰基甘油(DAG)，抑制SMS会导致细胞内神经酰胺水平增高。有证据表明，PC‑PLC和SMS抑制会影响细胞周期并阻止细胞增殖。D609作为促炎细胞因子的拮抗剂使D609在癌症研究、减少动脉粥样硬化斑块(抑制PC‑PLC)和中风后脑梗塞(PC‑PLC或SMS)方面显示出巨大的前景。1984年D609被证明可以作为抗病毒的药物，例如单纯疱疹病毒(HSV)和人乳头瘤病毒(HPV)。近年来，D609在对水疱性口炎病毒(VSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)中都被证实存在抗病毒特性，因此D609在病毒学中的应用也逐渐凸显出重要的地位。

[0005] 伏马菌素是一组主要由串珠镰孢产生的霉菌毒素，现已分离出B1、B2和B3等15种伏马菌素。FB1通过诱导氧化应激、凋亡和细胞毒性，以及改变细胞因子的表达等方面对细胞产生毒害，但有研究阐明FB1发挥毒性的机制与不同类型的细胞，以及来自不同物种的相同类型细胞的敏感性有关。目前，尚没有统一的机制解释FB1在不同细胞和组织中的毒性模式和机制。由于FB1与细胞鞘脂具有明显的结构相似性，所以FB1可以通过抑制神经酰胺合成酶从而干扰鞘脂的代谢，从而导致细胞和组织中鞘氨醇的积累。在抗病毒方面，FB1正是通过抑制神经酰胺合酶，进一步干扰血凝素的贩运抑制甲型流感病毒(IAV)的复制，以及阻断HIV的传染性，此外，FB1还可以抑制西尼罗河病毒(WNV)的复制。因此FB1在抗病毒领域中有更多值得探索的机制。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明的首要目的在于为埃博拉病毒感染的患者提供一种神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒相关疾病的药物中的应用。

[0007] 本发明的技术方案包括以下几个方面：

[0008] 第一方面，本发明请求保护神经酰胺合成分解途径中的抑制剂在制备预防或治疗埃博拉病毒疾病的药物中的应用，通过加入神经酰胺合成分解途径中的抑制剂导致埃博拉病毒在细胞中形成的包涵体的数量减少、体积下降，阻碍包涵体的成熟，显著抑制埃博拉病毒在细胞中的增殖。

[0009] 所述预防或治疗埃博拉病毒相关疾病的药物指如下X1)‑X5)中任一种：

[0010] X1)制备用于预防或治疗埃博拉病毒感染的药物；

[0011] X2)制备用于预防或治疗埃博拉病毒所致疾病的药物；

[0012] X3)制备用于抑制埃博拉病毒复制增殖的药物；

[0013] X4)制备用于抑制埃博拉病毒产生细胞病变效应的药物；

[0014] X5)制备埃博拉病毒抑制剂。

[0015] 作为本发明的进一步优化方案，所述神经酰胺合成分解途径中的抑制剂为鞘磷脂合酶抑制剂D609或神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1。

[0016] 另一方面，本发明请求保护一种预防或治疗埃博拉病毒疾病的药物，所述药物为神经酰胺合成分解途径中的抑制剂。

[0017] 作为本发明的进一步优化方案，所述神经酰胺合成代谢分解途径的抑制剂为鞘磷脂合酶抑制剂D609或神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1。

[0018] 本发明的目的是提供一种应用于埃博拉病毒治疗的策略，通过对埃博拉病毒包涵体的作用及相关分子机制的研究，阐明了D609、FumonisinB1等药物对埃博拉病毒包涵体的影响，加入药物后，发现埃博拉病毒包涵体的形成受到抑制，包涵体发生的动态进程受到明显阻滞，从而抑制埃博拉病毒的复制。因此，以D609、FumonisinB1为代表的神经酰胺(Ceramide)合成分解途径中的抑制剂有极大的潜力在临床上用于治疗埃博拉病毒，其在埃博拉病毒病的治疗领域将有广阔的应用前景。

[0019] 另外，使用病毒样颗粒(trVLP)，通过荧光素酶的表达来模拟埃博拉病毒生命周期。在最小基因组系统中加入pGL3‑Basic质粒作为内参，加入D609、FumonisinB1会显著抑制埃博拉病毒trVLP的增殖(图1)。同时，通过免疫荧光技术发现D609、FumonisinB1显著抑制包涵体的形成(图2)，以上结果提示神经酰胺合成代谢途径可作为抵抗埃博拉病毒的靶点，利用与神经酰胺合成相关的抑制剂D609、FumonisinB1干扰埃博拉包涵体的形成，可作为埃博拉病毒病治疗的候选药物用于埃博拉病毒感染的治疗，对感染埃博拉病毒的治疗具有重大应用价值。

附图说明

[0020] 图1为D609、FumonisinB1显著抑制埃博拉trVLP的增殖；

[0021] 图2为免疫荧光检测D609、FumonisinB1显著抑制埃博拉包涵体形成；

[0022] 图3为CCK8试剂盒检测药物细胞毒性。

具体实施方式

[0023] 下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。

[0024] 一、材料

[0025] 1、细胞株和质粒

[0026] HEK293细胞为本实验室保存，公众可从协和医院细胞库购买。

[0027] 埃博拉病毒最小基因组系统相关质粒pCAGGS‑NP、pCAGGS‑VP35、pCAGGS‑VP30、pCAGGS‑L、p4cis‑vRNA‑Rluc、pCAGGS‑T7、pCAGGS‑Tim1均记载于文献“Hoenen T,Watt A,Mora A,Feldman H.Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level2Conditions With Virus‑like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes.JVis Exp.2014Sep 27；(91):52381.doi:10.3791/52381.PMID:25285674；PMCID:PMC4828136”，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。萤火虫荧光素酶质粒pGL3‑Basic购买于优宝生物。

[0028] 2、分子生物学试剂和抗体

[0029] 双荧光素酶检测试剂盒购买于Promega公司；转染试剂Lipofectamine3000购买于Thermo公司；DMEM培养基与FBS购买于GIBCO；D609(货号HY‑70072)、FumonisinB1(货号S8409)购自MCE公司；anti‑VP35抗体购买于CreativeDiagnostice公司。

[0030] 二、方法

[0031] 1、利用埃博拉病毒最小基因组检测基因复制，且使用的埃博拉最小基因组可在生物安全二级条件下模拟埃博拉病毒的生命周期，具体实验过程如下：

[0032] (1)接种HEK293(简称P0)至六孔板，培养24h；

[0033] (2)将最小基因组相关质粒pCAGGS‑NP(125ng)、pCAGGS‑VP35(125ng)、pCAGGS‑VP30(75ng)、pCAGGS‑L(1000ng)、p4cis‑vRNA‑Rluc(250ng)与pCAGGS‑T7(250ng)以及萤火虫荧光素酶质粒pGL3‑Basic(25ng)转染到P0，培养24h；

[0034] (3)上清更换为5％FBS的培养基培养24h；

[0035] (4)将病毒靶向细胞(简称p1)接种到6孔板中培养24h；

[0036] (5)将质粒pCAGGS‑NP(125ng)、pCAGGS‑VP35(125ng)、pCAGGS‑VP30(75ng)、pCAGGS‑L(1000ng)与pCAGGS‑Tim1(250ng)以及pGL3‑Basic(25ng)转染到p1，培养24h；

[0037] (6)将p1细胞上清更换为p0的细胞上清并收取P0，感染24h；

[0038] (7)将p1上清更换为5％FBS的培养基继续培养72h收取p1，如果需要继续传代病毒获得p2，则方法与p1获取流程一致；

[0039] (8)双荧光素酶检测：六孔板弃上清，PBS洗涤细胞3次，加入500μlPLB裂解液，在摇床上室温裂解20min，在50μl室温平衡的LuciferaseAssayReagentⅡ中加入10μl细胞裂解上清，轻轻混匀后放入TD‑20/20型荧光光度计测定发光值R‑1，随后再加入50μlStop&GloReagent测定发光值R‑2，最后设对照组R‑1的中位数为1，平衡R‑2的值即为荧光素酶相对活性；

[0040] HEK293细胞不同药物浓度抑制剂预处理24h，转染最小基因组系统P0相关质粒和萤火虫荧光素酶质粒pGL3‑Basic(25ng)，转染后每24h换液加药，转染后48h收细胞检测，检测方法同上；

[0041] HEK293细胞不同药物浓度抑制剂预处理24h，转染最小基因组系统P1相关质粒和萤火虫荧光素酶质粒pGL3‑Basic(25ng)，转染后每24h加P0上清孵育2h后，换液加药，转染后48h收细胞检测，检测方法同上。

[0042] 结果如图1所示，在埃博拉病毒最小基因组系统中加入pGL3‑Basic质粒作为内参，随后加入D609、FumonisinB1会显著抑制埃博拉病毒trVLP的增殖。

[0043] 2、利用免疫荧光检测D609、FumonisinB1显著抑制埃博拉包涵体形成，具体实验过程如下：

[0044] (1)准备HEK293细胞爬片；

[0045] (2)24h后分别加入DMSO作为对照以及不同梯度的抑制剂处理，D609浓度分别为20μM、40μM、80μM，FumonisinB1浓度分别为1.25μM、4μM、9μM；

[0046] (3)给药处理24h后换液重新给药，转染最小基因组相关质粒，每培养24h后换液重新给药；

[0047] (4)在转染48h后将细胞用PBS洗涤3次，每次5min，吸尽残存液体；

[0048] (5)4％多聚甲醛37℃固定15min；PBS洗涤3次，每次5min，吸尽残存液体；

[0049] (6)加入0.3％TritonX‑100(用1×PBS配制)穿孔15min；PBS洗涤3次，每次5min，吸尽残存液体；

[0050] (7)加入1ml封闭液(含1％山羊血清的1×PBST)37℃封闭30min；弃废液；

[0051] (8)孵育抗VP35抗体(封闭液1:200稀释获得)，4℃孵育过夜；1×PBST洗涤细胞3次，每次10min(简称PBST洗涤)；

[0052] (9)孵育FRITC标记的二抗，(封闭液1:200稀释获得)，室温孵育1h(避光操作)；PBST洗涤；

[0053] (10)加入10μl含有DAPI(1μg/ml)的封片液，避光静置15min后在激光共聚焦显微镜(CarlZeissLSM800)下观察；

[0054] 结果如图2所示，与加DMSO对照组相比，D609、FumonisinB1能够显著抑制包涵体的形成。

[0055] 3、利用CCK‑8测定D609、FumonisinB1的细胞毒性，具体实验过程如下细胞毒性检测：

[0056] (1)在96孔板四周加入100ulPBS，设置空白对照，接种HEK293细胞悬液(100ul/孔，约3000细胞)，孵箱中培养24h；

[0057] (2)在培养基中将D609稀释至20μM、40μM、80μM，FumonisinB1稀释至2.25μM、4.5μM、9μM，以DMSO为对照，更换新鲜培养基100μl/孔，空白对照加入100μl培养基；

[0058] (3)每24h按照步骤2换药加药；

[0059] (4)培养72h后，加CCK‑810μl/孔；

[0060] (5)孵箱孵育1‑2h后用酶标仪测定450nm处吸光值，计算细胞活力，细胞活力(％)＝[A(加药)‑A(空白)]/[A(0加药)‑A(空白)]×100。其中，

[0061] A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度；

[0062] A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；

[0063] A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

[0064] 结果如图3所示，从整体来看，D609药物工作浓度对细胞影响一致，FumonisinB1工作浓度对细胞影响一致。

[0065] 综上所述，本发明研究提示神经酰胺合成代谢途径可作为抵抗埃博拉病毒的靶点，利用与神经酰胺合成相关的抑制剂D609、FumonisinB1干扰埃博拉包涵体的形成，可作为埃博拉病毒病治疗的候选药物用于埃博拉病毒感染的治疗。

[0066] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。