一种含N-卤胺抗菌高分子的骨水泥及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及医用高分子技术领域，具体涉及一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥及其制备方法和应用，由粉体和液体两部分组成。所述粉体与液体的质量体积比为2.0～2.4：1g/mL；所述粉体包括：丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物、N‑卤胺抗菌高分子粉末、引发剂、显影剂；其中，所述的N‑卤胺抗菌高分子粉末占粉体的质量分数为1～5％；所述液体包括甲基丙烯酸甲酯，促进剂，阻聚剂。本发明将甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸共聚物经过酰胺改性及卤化改性，赋予骨水泥优异的长效抗菌性，有效规避了临床上使用抗生素骨水泥造成的人体耐药性问题。可用于关节及脊柱修复等骨科领域，具有广阔的临床应用前景。

权利要求

1. 一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，其特征在于，由粉体和液体两部分组成，所述粉体与液体的质量体积比为2.0 2.4：1 g/mL；

~

所述粉体包括：按照质量百分含量计，包括丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物80.5~

90.5%、N‑卤胺抗菌高分子粉末1 5%、引发剂0.5 2.5%、显影剂8 12%；

~ ~ ~

所述液体包括甲基丙烯酸甲酯，促进剂，阻聚剂，所述甲基丙烯酸甲酯的质量百分含量为90.5 96.5%，所述促进剂的质量百分含量为1 3%；所述阻聚剂的含量为100±10 ppm；

~ ~

所述含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥的制备方法，包括以下步骤：S1. 制备N‑卤胺抗菌高分子粉末，所述N‑卤胺抗菌高分子粉末的制备包括：S11. 制备甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸共聚物：通过丙烯酸单体与甲基丙烯酸甲酯单体按照摩尔比为1: 2.3 2.5 混合，并加入偶氮二异丁腈以及N,N‑亚甲基双丙烯酰胺，在乙醇中~反应制得；

S12. 将甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸共聚物改性得到酰胺改性的共聚物：将甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸共聚物加入水中并充分混匀后，依次加入缩合剂2‑氯‑4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪和乙二胺，充分溶解后在惰性气体及冷凝回流装置保护下，70‑90 ℃条件下搅拌反应20~

24 h；

S13. 将酰胺改性的共聚物进行卤胺改性，纯化后得到含N‑卤胺抗菌高分子的粉末：将酰胺改性的共聚物用丙酮沉淀后，用水溶解并加入pH = 5 11 的0.5% 2%次氯酸钠溶液，冰~ ~浴中避光浸泡10 14 h，最后经丙酮沉淀洗涤、纯水溶解后冻干，经充分研磨即可得到含N‑~卤胺的抗菌高分子粉末；

S2. 将N‑卤胺抗菌高分子的粉末与丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物、引发剂、显影剂混合得到粉体；

S3. 将粉体与液体混合，自发固化后，即得。

2. 根据权利要求1 所述的一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，其特征在于，所述促进剂为N,N‑二甲基‑对甲苯胺；阻聚剂为对苯二酚。

3. 根据权利要求1 所述的一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，其特征在于，所述偶氮二异丁腈的质量分数为1‰ 1%，所述N,N‑亚甲基双丙烯酰胺质量分数为1‰ 5‰。

~ ~

4. 权利要求1‑3 任一项所述含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥在制备抗感染骨科植入材料中的应用。

说明书

一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医用高分子技术领域，具体涉及一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥及其制备方法和应用。技术背景

[0002] 随着现代社会的发展，疾病、创伤以及人口老龄化等因素均会造成不同程度的骨组织缺损，因此临床上对骨修复材料有迫切需求。当前以聚甲基丙烯酸甲酯 (polymethyl methacrylate,PMMA)材料为代表的骨水泥是一种以粉体和液体组成的室温固化骨水泥，该类骨水泥以其优异的流动性和可操作性以及较好的力学性能，被广泛用作临床骨修复材料。

[0003] 感染是骨缺损治疗的主要并发症，一旦感染，细菌容易在植入物表面形成具有耐免疫系统的菌斑生物膜，从而引发慢性炎症刺激和组织损伤。发展抗菌骨水泥具有迫切的临床需求。然而，当前骨水泥抗菌改性仍存在一些关键科学问题。如，载抗生素涂层长期使用会产生抗药性；以银、铜、锌、钛等金属离子为代表的无机抗菌剂的使用存在重金属累积毒性风险；小分子抗菌剂释放快，存在迁移的风险。N‑卤胺化合物属于有机非抗生素类抗菌剂，具有广谱抗菌、活性强、生物安全性好及成本低廉等特性而备受青睐。卤胺化合物前驱体在次氯酸钠水溶液中可发生氯化反应，使N‑H键变成N‑Cl键，其中带正电的氯离子氧化细胞内的蛋白质，对酶活性造成不可逆的破坏，使微生物失去活性而起到抗菌作用，不仅能够有效杀灭如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌等常见的细菌，还对耐药性细菌、真菌、酵母和病毒等有非常好的抗菌效果。氮‑卤胺抗菌剂不仅具有抗菌广谱性，其抗菌活性也十分优越，即使是在低浓度时也可迅速杀灭细菌，是一类理想的抗菌剂。因此，若能将抗菌活性成分通过化学共价键固定在高分子链上的卤胺高分子引入现有的普通骨水泥体系中，有望实现骨水泥在体内长效、广谱杀菌，进一步提高抗菌骨水泥的应用价值。

[0004] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥及其制备方法和应用。

[0006] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

[0007] 一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，由粉体和液体两部分组成，所述粉体与液体的质量体积比为2.0～2.4：1g/mL；

[0008] 所述粉体包括：丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物、N‑卤胺抗菌高分子粉末、引发剂、显影剂；其中，所述的N‑卤胺抗菌高分子粉末占粉体的质量分数为1～5％；

[0009] 所述液体包括甲基丙烯酸甲酯，促进剂，阻聚剂。

[0010] 优选地，所述粉体，按照质量百分含量计，包括丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物80.5～90.5％、N‑卤胺抗菌高分子粉末1～5％、引发剂0.5～2.5％、显影剂 8～12％。

[0011] 引发剂可以为过氧化苯酰，显影剂可以为二氧化锆。

[0012] 优选地，所述液体中甲基丙烯酸甲酯的质量百分含量为90.5％～96.5％，所述促进剂的质量百分含量为1～3％；所述阻聚剂的含量为100±10ppm；所述促进剂为N,N‑二甲基‑对甲苯胺；阻聚剂为对苯二酚。

[0013] 优选地，所述液体中还包括显色剂。(进一步优选为叶绿素铜)

[0014] 进一步，液体部分中甲基丙烯酸甲酯的质量百分含量为92％，促进剂的质量百分含量为2％；阻聚剂的含量为100±10ppm；其余为显色剂。

[0015] 所述含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

[0016] S1.制备N‑卤胺抗菌高分子的粉末；

[0017] S2.将N‑卤胺抗菌高分子的粉末与丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物、引发剂、显影剂混合得到粉体；

[0018] S3.将粉体与液体混合，自发固化后，即得。

[0019] 步骤S3具体为将含N‑卤胺抗菌高分子粉末加入无抗生素的骨水泥粉体中，混合均匀后与骨水泥液体混合，摇晃均匀后注入相应模具即得含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥。

[0020] 本发明含N‑卤胺的骨水泥，具备高效及长效的抗菌性能，避免了以往抗菌骨水泥中添加抗生素所产生的耐药性问题，且具有良好的力学性能及生物相容性。

[0021] 优选地，所述N‑卤胺抗菌高分子的粉末的制备包括：

[0022] S11.制备甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸的共聚物；

[0023] S12.将甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸的共聚物改性得到酰胺改性的共聚物；

[0024] S13.将酰胺改性的共聚物行卤胺改性，纯化后得到含N‑卤胺抗菌高分子的粉末。

[0025] 优选地，所述步骤S11中甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸的共聚物的制备通过丙烯酸单体与甲基丙烯酸甲酯单体按照摩尔比为1:1～2.5混合，并加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)以及交联剂N,N‑亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，在乙醇中反应制得。

[0026] 优选地，所述偶氮二异丁腈的质量分数为1‰～1％，所述N,N‑亚甲基双丙烯酰胺质量分数为1‰～5‰。

[0027] 具体地，反应的步骤为：将丙烯酸单体、甲基丙烯酸甲酯单体、AIBN、MBAA 加入乙醇中，充分溶解后在惰性气体和冷凝回流装置保护下60～70℃加热搅拌 10～15h。

[0028] 优选地，所述步骤S12中，酰胺改性具体为：将甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸共聚物加入水中并充分混匀后，依次加入缩合剂2‑氯‑4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪(CDMT) 和乙二胺，充分溶解后在惰性气体及冷凝回流装置保护下，70～90℃加热搅拌，反应20～24h。

[0029] 进一步地，所述缩合剂CDMT的质量分数为0.2％～2％，所述乙二胺的质量分数为2％～3％。

[0030] 优选地，所述步骤S13中，卤胺改性具体为：将酰胺改性的共聚物用丙酮沉淀后，用水溶解并加入pH＝5～11的0.5％～2％次氯酸钠溶液，冰浴中避光浸泡10～14 h，最后经丙酮沉淀洗涤、纯水溶解后冻干，经充分研磨即可得到含N‑卤胺的抗菌高分子粉末。

[0031] 所述含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥在制备抗感染骨科植入材料中的应用。

[0032] 采用本发明方法制备得到的N‑卤胺抗菌骨水泥，具备优异且长效的抗菌性能，并具有较好的力学性能及组织相容性，可满足临床需求，在骨缺损感染修复材料中具有巨大的临床应用价值。

[0033] 与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

[0034] 本发明提供了一种具有含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，利用卤胺高分子独特的杀菌性能赋予骨水泥高效且长效的抗菌能力，从根本上解决了加入抗生素易产生毒副作用以及细菌易产生耐药性的弊端。同时本发明区别于其他骨水泥的改性模式，抗菌组分与骨水泥组分共聚，增强了界面融合，所得改性骨水泥具备良好力学性能。本发明制作方法简单，易操作，改性后，生物相容性好，力学性能无影响、抗菌效果好，可用于多种骨缺损感染修复及填充，对临床具有指导意义，是一种性能优异的新型抗菌骨修复材料。

附图说明

[0035] 图1为不同骨水泥样品抗菌性能检测(细菌涂板计数法)结果；

[0036] 图2为不同骨水泥样品抗菌循环16次后的抗菌长效性能检测(细菌涂板计数法) 结果；

[0037] 图3为不同骨水泥样品在37℃，100％相对湿度环境下固化24小时后测试力学性能(压缩强度、弯曲强度、弹性模量)的结果；

[0038] 图4为不同骨水泥样品与细胞共培养1,3,7天的细胞毒性检测(CCK8实验)结果；

[0039] 图5为不同骨水泥样品与细胞共培养的细胞相容性(免疫荧光实验)检测结果；

[0040] 图6为N‑卤胺高分子的改性骨水泥对细胞毒性实验结果。

具体实施方式

[0041] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和对比例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

[0042] 除特殊说明，本实施例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂若无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。

[0043] 实施例1

[0044] 一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，包括粉体、液体；

[0045] 粉体：丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物86％、N‑卤胺抗菌高分子粉末2％、过氧化苯酰2％、二氧化锆10％；

[0046] 液体：甲基丙烯酸甲酯92％，N,N‑二甲基‑对甲苯胺2％，对苯二酚100±10ppm，其余为叶绿素铜；

[0047] 粉体与液体的质量比为2.2：1g/mL。

[0048] 含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥的制备方法

[0049] 该制备方法具体包括以下步骤：

[0050] (1)称取3.6g丙烯酸单体及5g甲基丙烯酸甲酯单体，经过滤后溶解于44mL 乙醇，在搅拌下缓慢加入0.165g偶氮二异丁腈(AIBN)、0.077g N,N‑亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，搅拌至完全溶解后，密封通0.5h氮气以去除多余氧气，然后在冷凝装置保护下置于65℃油浴锅中加热搅拌10h。

[0051] (2)待上述反应停止，将圆底烧瓶取出冷却至室温，加入44mL超纯水，充分搅拌混匀后，加入0.9g 2‑氯‑4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪(CDMT)，并缓慢滴加乙二胺4mL，充分搅拌溶解后，密封通氮气0.5h，随后在冷凝装置保护下，将圆底烧瓶置于80℃油浴中加热搅拌24h，待反应结束，冷却后得到酰胺改性的共聚物。

[0052] (3)将酰胺改性的共聚物用丙酮沉淀两次，加入10mL纯水溶解后，加入pH ＝5的1％次氯酸钠溶液，其中，次氯酸钠与上述反应物丙烯酸的摩尔质量比为1:1，然后置于4℃冰浴中避光浸泡12h，反应结束后得到卤胺改性的共聚物。

[0053] (4)将卤胺改性的共聚物用丙酮沉淀两次后，加入约10mL纯水溶解，置于冻干机中冻干24h，冻干的粉末即为含N‑卤胺的高分子粉末。

[0054] (5)冻干的粉末经过充分研磨后，按2％的质量占比加入骨水泥粉体中，充分混匀，加入骨水泥液体，粉体与液体的质量体积比为2.2：1g/mL，均匀搅拌，在室温下(23℃)进行混合固化，即制成含N‑卤胺高分子的骨水泥。

[0055] 实施例2

[0056] 一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，包括粉体、液体；

[0057] 粉体：丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物87.5％、N‑卤胺抗菌高分子粉末 0.5％、过氧化苯酰2％、二氧化锆10％；

[0058] 液体：甲基丙烯酸甲酯92％，N,N‑二甲基‑对甲苯胺2％，对苯二酚100±10ppm，其余为叶绿素铜；

[0059] 粉体与液体的质量比为2.2：1g/mL。

[0060] 制备方法同实施例1。

[0061] 实施例3

[0062] 一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，包括粉体、液体；

[0063] 粉体：丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物87％、N‑卤胺抗菌高分子粉末1％、过氧化苯酰2％、二氧化锆10％；

[0064] 液体：甲基丙烯酸甲酯92％，N,N‑二甲基‑对甲苯胺2％，对苯二酚100±10ppm，其余为叶绿素铜；

[0065] 粉体与液体的质量比为2.2：1g/mL。

[0066] 制备方法同实施例1。

[0067] 实施例4

[0068] 一种含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥，包括粉体、液体；

[0069] 粉体：丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸甲酯聚合物83％、N‑卤胺抗菌高分子粉末5％、过氧化苯酰2％、二氧化锆10％；

[0070] 液体：甲基丙烯酸甲酯92％，N,N‑二甲基‑对甲苯胺2％，对苯二酚100±10ppm，其余为叶绿素铜；

[0071] 粉体与液体的质量比为2.2：1g/mL。

[0072] 对比例1不含N‑卤胺高分子的骨水泥

[0073] 该对比例的制备方法同实施例1，粉体与液体的质量体积比为2.2：1g/mL，不同之处在于，骨水泥粉体中不加入含N‑卤胺的高分子粉末。

[0074] 对比例2含抗生素的骨水泥

[0075] 该对比例的制备方法同实施例1，粉体与液体的质量体积比为2.2：1g/mL，与实施例的区别在于，将N‑卤胺高分子粉末换成万古霉素，其中，万古霉素加入量按说明书，与骨水泥粉体的质量比为1:40。

[0076] 对比例3含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥的制备方法

[0077] 该对比例的制备方法同实施例1，不同之处在于步骤(1)中甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸的比例为1:1.2，因此加入4.32g丙烯酸及4g甲基丙烯酸甲酯。

[0078] 对比例4含N‑卤胺抗菌高分子的骨水泥的制备方法

[0079] 该对比例的制备方法同实施例1，不同之处在于步骤(1)中甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸的比例为1:2.3，因此加入2.16g丙烯酸及7g甲基丙烯酸甲酯。

[0080] 实验例1体外抗菌能力检测

[0081] 首先，将上述实施例及对比例的粉末按照对应比例加入骨水泥粉体中，混合均匀后，实施例，对比例分别加入相应体积的骨水泥液体，粉体与液体的质量体积比为2.2：1g/mL，充分搅拌均匀，注入骨水泥圆形模具(直径10mm，厚度为1mm)，在室温下进行混合固化，制备骨水泥圆片，并静置24h。

[0082] 以金黄色葡萄球菌作为本次检测模型菌株，调整菌液浓度为106CFU/mL，将制备的骨水泥圆片用75％的酒精浸泡消毒30min室温烘干后，与菌液在37℃条件下共培养12h。待培养结束后吸取各组骨水泥圆片的菌液，用涂板计数法测量细菌的数量，检测改性后骨水泥的抗菌性能。

[0083] 抗菌性能结果如图1所示，与对照组相比，实施例1～4的骨水泥样品的平均抗金黄色葡萄球菌率为分别为96.0％、84.5％、89.0％、96.1％，而对比例2～4分别为96.2％、75.3％、83.4％，对照组的骨水泥样品与实施例1～4之间存在显著统计学差异(p<0.001)，其中实施例1，4表现出优异的抗菌性能，且两者差异不大。综上分析改性后的骨水泥表现出优异的抗菌性能，说明本发明制备的含N‑卤胺抗菌高分子骨水泥可用于抗感染骨修复材料。考虑到骨水泥抗菌性能与力学性能以及组织相容性之间的平衡，下面以实施例1的改性骨水泥进行下一步抗菌性能检测、力学性能检测以及生物相容性检测。

[0084] 进一步地，我们通过对改性骨水泥的释放性抗菌以及接触性抗菌性能进行评估，以明确改性骨水泥的抗菌性能。释放性抗菌性能具体检测方法如下：调整金黄色葡萄球菌6
的菌液浓度为10CFU/mL，将经过酒精消毒的实施例1以及对照组的骨水泥圆片与菌液共培养12h后，吸取骨水泥圆片上清用涂板计数法评估溶解性抗菌性能。接触性抗菌性能实验具体检测方法如下：骨水泥圆片与菌液共培养结束后，把骨水泥圆片取出并转移至装有1mL无菌PBS缓冲液的离心管，将离心管进行超声清洗后，吸取上清液用涂板计数法测量细菌数量，检测改性后骨水泥的接触性抗菌性能。

[0085] 结果如图2所示，图中未改性的骨水泥为对照组的骨水泥，改性骨水泥为含 N‑卤胺高分子的骨水泥，结果显示，改性后的骨水泥溶解性抑菌率达到95.3％，改性后的骨水泥接触性抑菌率达到90.02％，改性后的骨水泥与对照组的骨水泥存在显著统计学性差异(p<0.001)。

[0086] 实验例2含N‑卤胺高分子的骨水泥抗菌长效性检测

[0087] 调整金黄色葡萄球菌的菌液浓度为106CFU/mL，将实施例1(改性的骨水泥)、对比例1(未改性的骨水泥)的骨水泥圆片分别与金黄色葡萄球菌共培养12h，评估共培养时样品的抗菌性能并计算相应的抗菌率，反复共培养至骨水泥样品抑菌率下降至60％以下时，将共培养的改性骨水泥圆片再次浸泡次氯酸钠溶液进行二次卤化，随后对样品的抑菌率再次进行评估，结果如图3所示，结果显示，骨水泥圆片在与菌液反复共培养10次抑菌率仍可达到75％以上，反复共培养至14次时抑菌率降至51.1％，将改性的骨水泥圆片用次氯酸钠溶液浸泡进行二次卤化后，抑菌率可恢复至78.8％，表明改性后的骨水泥具备一定的抗菌长效性且抗菌性能可再生。

[0088] 实验例3含N‑卤胺高分子的骨水泥力学性能测试

[0089] 首先，将实施例2中含N‑卤胺的高分子粉末按照2％的质量占比加入骨水泥粉体中，混合均匀后，实施例2及对比例1的粉末均加入相应体积的骨水泥液体，粉体与液体的质量体积比为2.2：1g/mL，充分搅拌均匀，注入骨水泥圆柱体模具 (直径6mm，长度为12mm，测试压缩强度)及长方形样条模具(长50mm，宽 4mm，高3mm，测试弹性模量及弯曲强度)，在室温下(23℃)进行混合固化，制备好的骨水泥模具在室温下，静置24h。随后将骨水泥模具有万能试验机进行相关力学性能的检测。压缩强度的测试方法如下：将圆柱体模具两侧表面打磨光滑后，置于万能试验机上进行测试，加载速率为5mm/s，当模具发生2％形变时记录对应的负载力，将负载力除以圆柱体模具的横截面积所得结果即为骨水泥样品的压缩强度。弯曲模量及弯曲强度的测试方法如下：将骨水泥长方形样条两侧打磨后置于万能试验机上进行三点弯曲试验。测试时跨距l＝40mm，当样条断裂时记录力及位移曲线，依据计算计算弯曲模量及弯曲强度。弯曲强度按公式QF计算，弹性模量按公式EF计算。

[0090]

[0091] 公式中：样条断裂时的作用力用F(N)表示；载荷为15和50N时相应挠度间的差值用f(mm)表示；样条被测出的平均宽度用b(mm)表示；样条被测出的平均厚度用h(mm)表示；跨距用l(40mm)表示；载荷范围用ΔF(35N)表示。经过测量并计算后，所得的结果如图4所示，其中弯曲强度平均为63.0MPa，弹性模量平均为2887MPa，压缩强度为58.6MPa，均已达到ISO5833规定的标准值(压缩强度>70MPa、弯曲强度>50MPa、弹性模量>1800MPa)，且与未改性的骨水泥相比，改性后的骨水泥的力学性能得到提升。以上结果说明，改性后的骨水泥并不影响原有骨水泥的力学性能，且能进一步提升骨水泥的力学性能。

[0092] 实验例4含N‑卤胺高分子的骨水泥细胞相容性评价

[0093] (1)含N‑卤胺高分子骨水泥表面的细胞生长情况检测

[0094] 本实验所用细胞为人源的第4代骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，来源于健康志愿者，细胞提取实验获得中山大学附属第八医院伦理委员会的审核批准。将实施例1(改性的骨水泥)及对比例1(未改性骨水泥)作为实验组、对照组，每组材料各取3个样品圆片经75％酒精浸泡消毒30min室温烘干后，放入细胞培养孔板中。hBMSCs经培养达到85％的密度时，经胰4
酶消化并计数，最后以5×10 个 /孔的密度接种于培养孔板中的骨水泥圆片表面，细胞与圆片共培养24h。

[0095] 共培养结束后将培养上清弃去，骨水泥圆片表面的细胞经过固定、破膜及封闭处理后，用鬼笔环肽染料对细胞骨架进行着色，并使用共聚焦显微镜(LSM‑880) 观察细胞生长形态(放大倍数400×)，结果如图5所示，结果表明，与对照组的未改性骨水泥相比，含N‑卤胺高分子的改性骨水泥表面生长的细胞的形态无明显改变，显示较好细胞相容性。

[0096] (2)含N‑卤胺高分子骨水泥的细胞毒性评价

[0097] 将实施例1(改性骨水泥)、对比例1(未改性骨水泥)分别作为实验组、对照组，每组材料各取3片圆片经75％酒精浸泡消毒30min室温烘干后，分别放入 3块细胞培养孔板中。4
hBMSCs经培养达到85％的密度时，经胰酶消化并计数，以 5×10个/孔的密度接种于培养孔板中的骨水泥圆片表面，细胞与骨水泥圆片分别共培养1天、3天、7天，并还设立一个空白组，只添加材料与细胞共培养所用的培养基。

[0098] 待共培养至对应天数，使用CCK‑8试剂盒检测骨水泥的细胞毒性，并用酶标仪测定各组在450mm波长下的吸光度。结果如图6所示，第1天、第3天、第7 天时未改性的骨水泥的吸光度值逐渐上升，细胞呈现稳定增殖的态势，且改性的骨水泥与未改性的骨水泥的相对吸光度基本无差异，表明含N‑卤胺高分子的改性骨水泥不影响细胞的生长，基本无毒性，显示较好的细胞相容性。

[0099] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。