杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA及其应用

摘要

本发明公开了一种杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA及其应用，属于生物技术和植物基因工程技术领域。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将ProMIXTA启动子与标记基因GUS融合，通过农杆菌GV3101介导稳定转化拟南芥，与阳性对照具有相近的表达活性。结合PdeMIXTA基因在不同组织间的表达模式及组织原位杂交实验结果，证实了ProMIXTA启动子可以启动相应的目的基因PdeMIXTA在杨絮细胞中特异表达，在杨絮细胞中特异敲除或沉默内源目的基因，有助于探究目的基因对杨絮细胞分化发育的调控作用，进而为无絮杨新种质的创制提供有效的基因工具，具有重要意义。

权利要求

1.一种杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA，其特征在于，所述启动子ProMIXTA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的表达盒。

3.含有权利要求1所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的工程菌。

5.权利要求1所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA在获得转基因杨树或转基因拟南芥中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA与载体中待表达的基因序列可操作地连接，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，所述植物为杨树或拟南芥。

7.权利要求1所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA在培育飞絮减少或不飞絮杨树新品种中的应用。

说明书

杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，涉及一种能够在杨树飞絮组织特异表达的启动子ProMIXTA以及该启动子在杨树遗传改良上的应用。

背景技术

[0002] 杨树(Populus spp.)是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国杨树栽培主要集中在华北、华中、东北和西北等地区。杨树不仅是重要的速生丰产用材林树种，而且是环境绿化的重要树种；由于其极快的生长速度和良好的细胞壁化学性质，也是第二代生物燃料生产的合适原料；其栖息地适应性强，还可广泛用于生态防护林、三北防护林、农林防护林。其自身的经济价值、生态价值和社会价值体现出的优越性，是其他树种无法具备和取代的。

[0003] 杨树飘絮造成季节性环境污染的问题，成为当前制约杨树产业发展的重要因素。杨树在生殖特征上是雌雄异株，杨树雌株材质好，生长表现普遍优于雄株，因此选育推广的杨树优良无性系以雌株为主，然而雌株杨树的蒴果生长成熟后，果实开裂产生很多杨絮四处飞扬，而且飞絮持续的时间也很长，通常能达到半个月之久。杨絮的到处散播不仅会造成环境污染，还能让人呼吸道不畅，而且由于其易燃，很容易造成火灾。因此，如何既能发挥杨树强大的生态效益和较高的经济效益，同时又能控制杨树季节性飘絮污染，是当今社会亟待解决的问题。

[0004] 启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，从而精确有效地启动基因的表达。植物常用的启动子有组成型表达启动子、组织特异表达启动子和条件诱导表达型启动子。棉纤维相关启动子主要活跃在纤维的起始和伸长阶段，属于组织特异表达启动子。组织特异性启动子是时空特异型启动子的一种，只在特定细胞、组织或器官中启动表达。在植物的遗传转化中运用组织特异表达的启动子控制目标基因的表达能够更有效地避免使用组成型启动子带来的潜在负作用。因此，分离并克隆有关表达特异的启动子可以在转录水平上有效地调节基因的表达，以实现基因在不同组织、不同器官或不同环境条件下的表达。

[0005] 杨絮是附着在种子表面的一种絮状纤维，纤维长度约9.5～15.9mm，直径约8～11μm，杨絮附着在种子表面，主要是在种子成熟后利于种子的扩散。目前的研究证实植物的MIXTA基因是调控表皮毛起始发育的关键基因，包括调控棉絮的起始发育，拟南芥毛状体的发育，金鱼草花瓣细胞的凸起分化等功能。在杨树中，杨絮是由胎座表皮毛发育而成，与棉絮的发育过程类似。目前，已经证实MIXTA基因在棉絮起始发育过程中发挥关键作用。因此研究分析杨树飞絮特异表达启动子，启动目的基因在杨絮细胞中特异表达，从而避免了目的基因对杨树其他组织器官发育的影响，并可以通过杨树遗传转化技术，实现目的基因在杨絮细胞特异高表达，在杨絮细胞中特异敲除或沉默目的基因，有助于探究目的基因对杨絮细胞分化发育的调控作用，进而为无絮杨新种质的创制提供有效的基因工具，具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种杨树飞絮特异表达启动子ProMIXTA。本发明还要解决的另一技术问题在于提供杨树飞絮特异启动子ProMIXTA在杨树转基因中的应用。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0008] 一种杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明在杨树中克隆及验证了一个杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA，ProMIXTA所启动的PdeMIXTA基因在杨絮起始发育时期特异表达，其他组织中均不表达；原位杂交进一步验证PdeMIXTA基因在胎座凸起的表皮细胞表达；ProMIXTA启动子融合GUS基因，遗传转化拟南芥，只在表皮毛中检测到GUS信号，以上证实了ProMIXTA启动子为杨树飞絮特异表达启动子。

[0010] 含有所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的表达盒。

[0011] 在所述表达盒中，所述杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的下游连接目的基因，用于驱动目的基因的特异性表达。

[0012] 含有所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的重组表达载体。

[0013] 含有所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的表达盒的重组表达载体。

[0014] 所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组植物表达载体，本发明中使用的植物表达载体是pCAMBIA1301载体质粒。

[0015] 含有所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的工程菌。

[0016] 所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA在获得转基因杨树或转基因拟南芥中的应用。

[0017] 具体包括以下步骤：将所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA与载体中待表达的基因序列可操作地连接，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，所述植物为杨树或拟南芥。

[0018] 所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA在培育飞絮减少或不飞絮杨树新品种中的应用。

[0019] 本发明以pCAMBIA1301载体为骨干载体，通过同源重组的方法，用克隆得到的启动子ProMIXTA全长替换骨干载体中GUS上游的35S启动子，用启动子ProMIXTA启动GUS报告基因，通过农杆菌GV3101介导稳定转化拟南芥，结果证实启动子ProMIXTA启动GUS在拟南芥表皮毛特异表达，与阳性对照(强启动子CaMV35s)具有相近的表达活性。结合PdeMIXTA基因在不同组织间的表达模式及组织原位杂交实验结果，证实了ProMIXTA启动子可以启动相应的目的基因在杨絮细胞中特异表达，进而验证目的基因对杨絮细胞分化发育的调控作用，方便利用基因编辑或过表达转基因技术创制无絮杨新种质。

[0020] 所述的杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA的获得方法，包括以下步骤：以杨絮的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对其进行PCR扩增得到启动子。

[0021] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：

[0022] 本发明首次发现、定位一个新的杨树飞絮特异表达启动子ProMIXTA。该启动子可以通过杨树遗传转化技术，实现目的基因PdeMIXTA在杨絮细胞特异表达，在杨絮细胞中特异敲除或沉默内源目的基因，有助于探究目的基因对杨絮细胞分化发育的调控作用，进而为无絮杨新种质的创制提供有效的基因工具，具有重要意义。

附图说明

[0023] 图1为杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA启动的PdeMIXTA基因在黑杨不同组织的表达量；选取授粉前3天雌花序(‑3DPA)，授粉当天雌花序(0DPA)，授粉后3天雌花序(3DPA)，授粉后5天雌花序(5DPA)，叶(Leaf)，叶芽(Bud)和树皮(Bark)共7个不同组织进行基因表达模式分析；柱状图数字代表三次生物重复的平均值，误差线是三次生物学重复的标准误差结果；

[0024] 图2为杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA启动的PdeMIXTA基因组织原位杂交分析图；图中，A为反义探针原位杂交结果图；B为正义探针原位杂交结果图；

[0025] 图3为启动子ProMIXTA的克隆及表达载体构建的电泳凝胶图；图中，A为以授粉后1天雌花序的DNA为模板，进行启动子ProMIXTA全长克隆的电泳凝胶图；B为构建的表达载体酶切结果电泳凝胶图；

[0026] 图4为ProMIXTA启动子遗传转化载体的构建示意图；图中，LB、RB分别为T‑DNA的左右边界序列，ProMIXTA为本发明的特异表达启动子，NOS为终止子；

[0027] 图5为ProMIXTA：：GUS转化拟南芥的GUS染色结果图；图中，A为阴性对照；B为阳性对照；C为GUS在转基因拟南芥叶片表皮毛优势表达。

具体实施方式

[0028] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0029] 实施例1

[0030] 一、杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA启动的PdeMIXTA基因表达模式分析[0031] 采集杨絮起始发育不同时间点的雌性花序，包括授粉前3天(‑3DPA)，授粉当天(0DPA)，授粉后3天(3DPA)和授粉后5天(5DPA)共4个时间节点。另外，再选择叶片(Leaf)、叶芽(Bud)和树皮(Bark)共3个营养器官作为对照。提取上述采集样品的RNA进行cDNA的反转录。设计PdeMIXTA基因的定量引物N00938F：5′‑CGGCCACTGAATTTAATAGCGGCAAT‑3′；N00938R：5′‑TCCGAAAGTCCTTCAATGATCCCCATA‑3′。以PtUBQ基因为内参基因，内参基因引物序列PtUBQF：5′‑GTTGATTTTTGCTGGGAAGC‑3′；PtUBQR：5′‑GATCTTGGCCTTCACGTTGT‑3′。实时定量PCR实验程序如下：配置20μL反应体系包括100ng的cDNA、4pmol的上下游引物，10μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，无菌超纯水补齐至20μL。反应步骤，首先95℃变性3分钟，然后进行40个反应循环包括95℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒。基因的表达‑ΔCT
计算使用2 方法，即ΔCT＝CT目的基因‑CT内参基因。利用T测验的方法分析PdeMIXTA基因在美洲黑杨不同组织中相对表达模式。结果显示，PdeMIXTA为授粉后5天内特异表达基因，不在其他组织中表达(图1)。该基因的特异表达时间节点与杨絮起始发育的时间节点完全吻合，推断ProMIXTA启动子为杨絮发育特异启动子。

[0032] 二、杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA启动的PdeMIXTA基因组织原位杂交分析[0033] 1)探针合成：将杨树PdeMIXTA的DNA序列进行同源比对，找到PdeMIXTA的特异序列，并设计正义和反义的RNA探针。PdeMIXTA：5’‑DIG‑CGAGUCGGUUUGGGGGAGGGUUAGGUAUAAUCAC‑DIG‑3’，FF：5’‑DIG‑CUCUCUUUCCGUUUUCUGCUGUGGUCACUCUG‑DIG‑3’，探针合成按照DIG RNA Labeling Kit(Roche，USA)试剂盒的方法操作。

[0034] 2)组织固定：取授粉后1DPA的美洲黑杨雌花芽洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定12h以上。

[0035] 3)脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

[0036] 4)切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62℃烤箱烤片2h。

[0037] 5)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15min‑二甲苯II 15min‑无水乙醇I 5min‑无水乙醇II 5min，风干，DEPC水浸泡。

[0038] 6)基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/m1)37℃消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

[0039] 7)阻断内源性过氧化物酶：滴加3％甲醇‑H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

[0040] 8)预杂交：滴加预杂交液，37℃孵育1h。

[0041] 9)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针FF/PdeMIXTA杂交液，浓度1uM，恒温箱42℃杂交过夜。

[0042] 10)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗10min，1×SSC，37℃洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

[0043] 11)滴加封闭液：滴加封闭血清。室温30min。

[0044] 12)滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti‑DIG‑HRP)：倾去封闭液，滴加anti‑DIG‑HRP。37℃孵育50min，后PBS洗3次×5min。

[0045] 13)滴加CY3‑TSA：滴加CY3‑TSA试剂，避光室温反应5min。后TBST洗3次×10min。PBS洗1次×5min。

[0046] 14)镜检拍照：加入显色溶液(10μL NBT/BCIP+500μL Buffer3)，室温暗处孵育过夜。随后利用奥林巴斯显微镜观察地高辛信号。

[0047] 结果显示，PdeMIXTA主要在胎座凸起的表皮细胞表达(图2)，这一结果与qRT‑PCR表达分析结果一致，进一步证实了ProMIXTA启动子为杨絮发育特异启动子。

[0048] 三、杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA克隆及表达载体构建

[0049] 根据在美洲黑杨基因组中鉴定的ProMIXTA的全长序列设计引物F：5′‑CTCTCTGACCTATCAAAATTAGGA‑3′，R：5′‑TTCTTCAATCCCACCTTATC‑3′，以NL895杨(南林895杨)授粉后3天花序的DNA为模板，同源克隆ProMIXTA(图3中的A)，将目的片段连接到Blunt载体进行测序(全长为2867bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示)。以pCAMBIA1301载体为骨干载体，通过同源重组的方法，用克隆得到的启动子ProMIXTA全长替换骨干载体中GUS上游的35S启动子，用启动子ProMIXTA启动GUS报告基因。使用EcoRV进行酶切验证，获得清晰的酶切凝胶电泳条带(图3中的B)，证明载体构建完成，该载体命名为ProMIXTA‑GUS(图4)。

[0050] 四、启动子ProMIXTA转拟南芥进行功能验证

[0051] 用于植物转化的哥伦比亚野生型拟南芥(col‑0)来自实验室保存。将拟南芥种子在75％乙醇中表面灭菌30秒，然后在无菌水中洗涤3次，然后在10％NaClO(v/v)中表面灭菌10分钟，然后再次用无菌水清洗6次，然后均匀播种在含有3％蔗糖和0.8％琼脂，pH为5.8的
1/2MS培养基中。种子首先在黑暗中于4℃培养3天，以进行春化处理，然后将其移至生长室(22‑23℃，16h光照/8h黑暗)中进行发芽，将生长约两周的拟南芥幼苗移植到营养钵中，营养土∶黑土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶3∶1∶1，在相同条件下(22‑23℃，16h光照/8h黑暗)生长。把构建完成的过表达载体ProMIXTA‑GUS转化到根癌农杆菌GV3101(pMP90)中。进行农杆菌的扩大培养，收集菌体后，用悬浮液(1/2MS+0.5％蔗糖)调整浓度到OD＝0.8，用于拟南芥的转化实验。野生型拟南芥转化采用花器官浸染法。在野生型拟南芥的盛花期(生长4周左右)，用配置好的农杆菌悬浮液浸泡花序30s，在生长室暗培养24h，再恢复正常生长条件直至成熟后分株收获种子(T1)。使用含30mg/L潮霉素的MS培养基进行T1代转基因阳性植株筛选，筛选获得阳性植株移栽到土壤中，放置在生长室(22‑23℃，16h光照/8h黑暗)中进行正常的管理。待幼苗在土壤中生长10天时，取新鲜的拟南芥叶片切成小块后置1.5mL离心管中，加入GUS染色液(10mmol/LEDTA，100mmol/L磷酸钠缓冲液pH7.0，0.1mol/L K3[Fe(CN)6]，0.1mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1％(V/V)TritonX‑100，5mg/mL X‑Glue)。将含有植物材料和GUS染液的离心管，放入37.0℃恒温温箱中，染色3h。最后倾去染色液，通过70％乙醇脱色后，在显微镜下观察转化材料的染色结果并拍照。

[0052] 转ProMIXTA：：GUS拟南芥中的GUS染色结果见图5，结果显示GUS在转基因拟南芥叶片的表皮毛上优势表达，而在非表皮毛组织中不表达，即该启动子具有拟南芥表皮毛表达特异性。上述实施例表明，本发明克隆的ProMIXTA启动子核苷酸长度为2867bp，当该启动子与GUS报告基因融合后，在拟南芥中能指导GUS报告基因在表皮毛中表达。

[0053] 综上，通过对杨树PdeMIXTA基因在不同组织间的表达模式及组织原位杂交实验，克隆到一个杨树飞絮发育特异启动子ProMIXTA。利用ProMIXTA启动子与标记基因GUS融合进行拟南芥的转化实验，证实了ProMIXTA启动子为杨絮发育特异启动子的功能。该启动子可以通过杨树遗传转化技术，实现目的基因在杨絮细胞特异表达，在杨絮细胞中特异敲除或沉默内源目的基因，有助于探究目的基因对杨絮细胞分化发育的调控作用，进而为无絮杨新种质的创制提供有效的基因工具，具有重要意义。

[0054] 以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。