一种基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法

摘要

本发明公开了一种基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法，涉及光电化学检测技术领域。本发明方法是基于MOFs复合材料构建的一种无标记DNA光电化学检测方法；所述MOFs复合材料以MIL‑101(Cr)为壳，以TiO2为核。本发明基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法具有操作简单、背景信号低、光电响应灵敏、稳定性好、特异性好的优点。有望应用于疾病相关的DNA、RNA的检测，并且拓展到其他生物分子的检测。

权利要求

1.一种MOFs复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以钛酸四丁酯为前驱体，于MIL‑101‑（Cr）内部原位合成TiO2，制备MOFs复合材料；

将乙醇、硝酸和钛酸四丁酯的混合物与MIL‑101‑（Cr）进行混合，搅拌，去除有机溶剂，加热，得到所述MOFs复合材料；

所述乙醇、硝酸和钛酸四丁酯的体积比为100 150 mL：100 150 μL：180 250 μL。

~ ~ ~

2.根据权利要求1所述的一种MOFs复合材料的制备方法，其特征在于，所述去除有机溶剂具体为通过蒸发自然干燥去除有机溶剂。

3.根据权利要求1所述的一种MOFs复合材料的制备方法，其特征在于，所述加热具体为

50 100 ℃加热1 1.5 h。

~ ~

4.根据权利要求1‑3任一项所述的制备方法制备得到的MOFs复合材料。

5.一种无标记DNA光电化学检测方法，其特征在于，基于权利要求4所述的MOFs复合材料构建的一种无标记DNA光电化学检测方法。

6.根据权利要求5所述的一种无标记DNA光电化学检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：将MOFs复合材料的水溶液滴涂至ITO电极上得到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极；

将P DNA通过共价键结合到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上，然后将T DNA溶液滴涂于其上，通过P DNA与T DNA碱基互补配对来进行T DNA的检测。

说明书

一种基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及光电化学检测技术领域，特别是涉及一种基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法。

背景技术

[0002] 光电化学检测技术涉及电解质与光活性材料之间的光生电子传递，由于其激发源与信号相分离，结合了光学方法和电化学方法，因此，具有较低的背景信号，良好的灵敏度和理想的分析性能，广泛地应用于生物检测。

[0003] 目前，用于特异性DNA检测的方法主要有电化学法、荧光法、电化学发光法以及光电化学法等。其中，光电化学方法对DNA的检测通常是将短链寡核苷酸固定基质形成生物连接层，与目标核酸杂交，产生信号变化。现有技术常使用量子点或有机分子如荧光染料标记DNA以传播光化学信号，标记过程复杂，导致检测耗时，影响因素增大。由于无标DNA检测技术能避免光化学信号传播中的复杂的标记过程，因此引起了相当大的关注。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法，检测过程无需标记，简化了操作，降低了检测时间和检测成本。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明技术方案之一，一种MOFs复合材料，所述MOFs复合材料以MIL‑101(Cr)为壳，以TiO2为核。

[0007] 本发明技术方案之二，上述MOFs复合材料的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 以钛酸四丁酯为前驱体于MIL‑101‑(Cr)内部原位合成TiO2，制备MOFs复合材料(TiO2‑in‑MOFs)。

[0009] 进一步地，将乙醇、硝酸和钛酸四丁酯的混合物与MIL‑101‑(Cr)进行混合，搅拌，去除有机溶剂，加热，得到所述MOFs材料。

[0010] 进一步地，所述乙醇、硝酸和钛酸四丁酯的体积比为100～150mL：100～150μL：180～250μL。

[0011] 进一步地，所述去除有机溶剂具体为通过蒸发自然干燥去除有机溶剂。

[0012] 进一步地，所述加热具体为50～100℃加热1～1.5h。

[0013] 加热的目的是进一步去除有机溶剂残留，得到TiO2‑in‑MOFs粉末。

[0014] 本发明技术方案之三，一种无标记光电化学检测方法，基于上述的MOFs复合材料构建的一种无标记光电化学检测方法。

[0015] 进一步地，所述检测方法包括以下步骤：

[0016] 将MOFs复合材料(TiO2‑in‑MOFs)的水溶液滴涂至ITO电极上得到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极；

[0017] 将P DNA通过共价键结合到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上，然后将T DNA溶液滴涂于其上，通过P DNA与T DNA碱基互补配对来进行TDNA的检测。

[0018] 进一步地，所述MOFs复合材料的水溶液中MOFs复合材料与水的质量体积比为5～15mg：1～3mL。

[0019] 进一步地，将所述MOFs复合材料的水溶液与所述ITO电极按用量比30‑50μL：2
1.5cm滴涂至所述ITO电极上，重复滴涂至少三次。

[0020] 进一步地，所述将P DNA通过共价键结合到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上具体为：将P DNA滴涂到所述TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上，37℃孵化1～2h。

[0021] 进一步地，将P DNA通过共价键结合到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上之后还包括将BSA溶液滴涂到电极表面并均匀涂抹，室温封闭2h的步骤。

[0022] 滴涂BSA溶液的目的是封闭电极，防止非特异性吸附。

[0023] 进一步地，所述BSA溶液的质量浓度为0.5％；所述BSA溶液与所述TiO2‑in‑MOFs‑2
ITO工作电极的用量比为10～30μL：1.5cm。

[0024] 进一步地，所述T DNA的检测具体为：将T DNA溶液滴涂在结合了P DNA的工作电极2
表面于37℃孵化1.5h；所述T DNA溶液的滴涂量为6‑7μL/cm。

[0025] 本发明技术构思：

[0026] 金属有机骨架(MOFs)是由有机配体与金属中心组装而成的多孔材料，具有更大的比表面积、更大的孔隙率、可调节的结构和可修饰的功能，从而表现出优异的吸附性能、光学性能、电学性能等。因此，它广泛应用于气体吸附分离、生物传感、催化、光学、电学、试剂缓释等领域，是一种有机‑无机杂化材料，兼有两种材料的优点。MIL‑101(Cr)材料是由一种三核的铬氧簇[Cr3O(CO2)6]及与其相适合的配体BDC组装链接所获得的材料。由于其具有较大的比表面积、较高的水稳定性以及大量的金属配位不饱和位点，已成为研究最广泛的MIL系列材料之一。

[0027] 纳米TiO2是一种重要的无机功能材料，由于其粒子具有表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应等性质，其晶体具有防紫外线、光吸收性好、随角异色效应和光催化等性能，而且它的耐候性、耐化学腐蚀性和化学稳定性较好，因此纳米二氧化钛被广泛应用于光催化、太阳能电池、有机污染物降解、涂料等领域。为了进一步的提高其性质及引进新的功能，科研人员通过尝试将金属氧化物与不同类型的材料复合以期达到预想。在这之中，将TiO2与MOFs进行复合成核壳结构的方法是一种理想的方法。

[0028] 本发明采用水热法合成MIL‑101(Cr)，使用钛酸四丁酯作为前驱体在室温下于MIL‑101(Cr)中原位合成TiO2，制备出MOF包裹TiO2复合材料——TiO2‑in‑MOFs。TiO2有序的插入MIL‑101(Cr)孔隙中，Ti通过Ti‑O‑Cr键与中心金属Cr相结合，形成有效的化学键合，TiO2的电子转移至Cr，有利于光生电子‑空穴对的分离，并且MOF本身的多孔性质，也有利于吸附更多的生物分子。将捕获DNA(P DNA)与复合材料结合，构建无标记DNA光电化学生物传感器，通过碱基互补配对实现对目标DNA(T DNA)的检测。结果表明，TiO2‑in‑MOFs‑T DNA复合电极光电性能良好，可实现对DNA稳定、灵敏、特异性良好的检测。本发明基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法有望应用于疾病相关的DNA、RNA的检测，并且拓展到其他生物分子的检测。

[0029] 本发明公开了以下技术效果：

[0030] 本发明基于MOFs复合材料的无标记DNA光电化学检测方法具有操作简单、背景信号低、光电响应灵敏、稳定性好、特异性好的优点。

附图说明

[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0032] 图1为本发明制得的MIL‑101(Cr)和TiO2‑in‑MOFs的透射电子显微镜(TEM)图；其中，(a)表示MIL‑101(Cr)，(b)表示TiO2‑in‑MOFs；

[0033] 图2为本发明制得的MIL‑101(Cr)和TiO2‑in‑MOFs的X‑射线粉末衍射(XRD)表征图；

[0034] 图3为本发明制得的MIL‑101(Cr)和TiO2‑in‑MOFs的荧光光谱表征图；

[0035] 图4为本发明制得的TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极的光电化学表征图；其中(a)为分别滴3层的MIL‑101(Cr)、TiO2‑in‑MOFs及TiO2的光电流对比图，(b)为不同层数TiO2‑in‑MOFs的光电流图谱；

[0036] 图5为检测条件对DNA光电化学生物传感器的影响；其中，(a)为孵化时间，(b)为pH值；

[0037] 图6为复合电极的光电化学线性工作曲线。

具体实施方式

[0038] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0039] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0040] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0041] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0042] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0043] 本发明所述“室温”，如无特殊说明均指18‑25℃。

[0044] 本发明实施例所用原材料如无特殊说明均自市购得到。

[0045] MIL‑101(Cr)的制备方法为本领域常规技术手段，不作为评价本发明创造性的依据。

[0046] 1实验方法

[0047] 1.1MIL‑101(Cr)的制备

[0048] 将1.60g九水硝酸铬和0.664g对苯二甲酸加入到16mL去离子水中，再加入0.004moL的氢氟酸得到混合物，将混合物在室温下超声辅助溶解30min，移入反应釜中，在
220℃条件下进行晶化8h。晶化完成后，待反应釜冷却到室温后，经10000rpm离心5min得到粗产物。将粗产物离心分离后进行洗涤，除去残留的对苯二甲酸：将粗产物用60℃DMF洗涤两次，每次3h，60℃乙醇洗涤两次，每次3h，四次洗涤分离均采用10000rpm离心5min。离心出的产物于60℃的干燥箱中干燥2h，完全干燥后，置于150℃真空下活化12h，得到MIL‑101(Cr)。

[0049] 1.2TiO2‑in‑MOFs的制备

[0050] 将120mL HPLC级乙醇、140μL浓硝酸与200μL钛酸四丁酯混合后室温下搅拌2min，加入MIL‑101‑(Cr)进行混合，将混合液移入圆底烧瓶中，恒温(18℃±0.5℃)搅拌20h。将搅拌后的混合液放在室温下自然蒸发至无明显的液体干，然后80℃沙浴1h，去除残留的有机溶剂，得到粉末状固体TiO2‑in‑MOFs。

[0051] 1.3T DNA检测

[0052] 将10mg的TiO2‑in‑MOFs加入2mL的去离子水中，超声20min形成悬浆，取50μL的悬2
浆液滴涂至1.5cm ITO电极上，干燥完全，重复滴涂三次制得TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极。
用移液枪移取10μL 100nM PDNA滴涂到TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极表面并均匀涂抹，37℃孵化1h；接着，用移液枪移取20μL 0.5％的BSA溶液滴涂到电极表面并均匀涂抹，室温封闭
2h；最后，用移液枪分别移取10μL不同浓度的T DNA溶液滴涂到电极表面，37℃孵化1.5h，用Tris‑HCl(pH＝7.4)的溶液对电极表面清洗三次得到复合电极，然后进行光电化学测试。光电流测试采用CHI600D电化学工作站，采用三电极体系，其中Pt电极为对电极，Ag‑AgCl做参比电极，所制备的复合电极为工作电极。在该测试体系中，HSX‑F/UV300氙灯作为光源，PBS作为缓冲液。光电流测试所用电压为1.5V。

[0053] 2结果

[0054] 2.1透射电子显微镜(TEM)表征

[0055] 使用透射电子显微镜(TEM)对MIL‑101(Cr)和TiO2‑in‑MOFs进行表征，观察其亚显微结构，结构如图1所示，其中(a)表示MIL‑101(Cr)，(b)表示TiO2‑in‑MOFs。由图(a)能够看出所制备的MIL‑101(Cr)形状较为规则，粒径较为均匀，约为0.6‑1.2μm左右。由图(b)能够看出，所制备的TiO2‑in‑MOFs形状规则，出现明显的八面体结构；表面光滑，表面仅有极少量TiO2存在，无明显TiO2分布。根据元素分布图，可以发现Ti元素强度较弱，主要分布在内部，框架内部Ti元素分散较为均匀。

[0056] 2.2X‑射线粉末衍射(XRD)表征

[0057] 图2为MIL‑101(Cr)和TiO2‑in‑MOFs的XRD图，由图2能够看出MIL‑101(Cr)在2θ为5.1°、8.4°、9.0°、10.2°均出现衍射峰，分别对应(511)、(753)、(1022)和(880)晶面，该特征符合MOFs材料的XRD衍射峰特征，且与P.N.DaveT.Wang等报道的MIL‑101(Cr)的衍射峰一致，因此，可判定该物质为MIL‑101(Cr)。由图2还能够看出，TiO2‑in‑MOFs在2θ为25.5°、
37.9°、47.7°、53.7°、54.7°、62.5°、75.1°均出现衍射峰，分别对应锐钛矿TiO2(JCPDS no.21‑1272)的(101)、(004)、(200)、(105)、(211)、(204)和(215)晶面；而且MIL‑101(Cr)的特征峰强度变弱了，说明成功合成了以MIL‑101(Cr)为壳、以TiO2为核的具有核壳结构的TiO2‑in‑MOFs。

[0058] 2.3荧光光谱表征

[0059] 图3为MIL‑101(Cr)和TiO2‑in‑MOFs的荧光光谱表征，激发波长为300nm，由图3能够看出，MIL‑101(Cr)在378nm和464nm处有最大发射峰，荧光强度较弱；而TiO2‑in‑MOFs同样在378nm和464nm处有发射峰，但荧光强度相对于MIL‑101(Cr)有所下降，表明TiO2和MOFs复合所形成的TiO2‑in‑MOFs有利于电子‑空穴的分离。

[0060] 2.4光电化学表征

[0061] 2.4.1TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极的制备

[0062] 通过配制5mg/mL的TiO2‑in‑MOFs溶液，分别以1、2、3、4层的滴涂层数均匀的涂抹到ITO电极表面，检测其光电流强度的变化，筛选出适合的层数，用来进行下一阶段实验。光电化学表征结果如图4所示，其中(a)为分别滴3层的MIL‑101(Cr)、TiO2‑in‑MOFs及TiO2的光电流对比图，(b)为不同层数TiO2‑in‑MOFs的光电流图谱；图中MOFs表示MIL‑101(Cr)。由图(a)能够看出MIL‑101(Cr)的光电流强度明显强于其他两种材料，且MIL‑101(Cr)和TiO2的光电流为正，TiO2‑in‑MOFs的光电流为负，相对于正电流，负电流用于DNA检测时能够避免带负电荷的DNA非特异性吸附引起的假阳性。由图(b)能够看出，滴加单层TiO2‑in‑MOFs时，光电流值较小，且为正；随着层数的增大，光电流为负，其中层数为3层时，光电性能最佳，其光电流绝对值为1.1μA。

[0063] 2.4.2检测条件的优化

[0064] 在TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上滴涂10μL 100nM P DNA，P DNA通过共价键合与TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极结合；接着，滴涂BSA进行活性位点封闭，制得DNA光电化学生物传感器。在传感器表面滴涂10μL50nM的T DNA，分别孵化0.5h、1h、1.5h、和2h，之后用Tris‑HCl洗涤表面后进行光电化学表征，研究孵化时间的影响，结果如图5(a)所示。从图5(a)可知，随着孵化时间的增大，光电流强度逐渐减弱，1.5h时光电流减小为0.3μA，孵化2h，光电流强度基本保持不变，表明孵化1.5h后，T DNA与P DNA二者已完全结合，因此，选择孵化时间为1.5h。

[0065] 实验所用的PBS溶液pH值为7.1，用稀盐酸和氢氧化钠溶液调整其pH值以分析不同pH值环境下对T DNA检测的影响，分别在pH为6.5、6.8、7.1和7.4的电解质溶液中进行光电化学表征，结果如图5(b)所示。由图5(b)可知当pH值为7.1时，光电化学性能最优，故选择PBS的pH为7.1。

[0066] 2.5T DNA的检测

[0067] 在已经连接了P DNA并使用BSA溶液进行过非特异性封闭的TiO2‑in‑MOFs‑ITO工作电极上滴涂10μL T DNA溶液，浓度分别为10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM，37℃下孵化1.5h后用pH＝7.4的Tris‑HCl洗涤，并在pH＝7.1的PBS溶液中进行光电化学表征，结果如图6所示。由图6可知，在10nM～100nM范围内，DNA浓度和光电流具有的良好的线性关系，线性方程为I＝0.00249c‑0.639。

[0068] 综上，本发明基于TiO2‑in‑MOFs复合材料成功构建出了无标记型光电化学生物检测技术，用于DNA的检测。采用水热法合成MIL‑101(Cr)，然后以MIL‑101(Cr)为框架在室温下以钛酸四丁酯作为前驱体于MIL‑101(Cr)内部原位合成出TiO2，制备出TiO2‑in‑MOFs复合材料。将TiO2‑in‑MOFs涂布于ITO电极表面，再通过共价结合将捕获探针P DNA固定在TiO2‑in‑MOFs上，构建了一种无标记型光电化学生物检测技术，用于目标T DNA的检测。探究了T DNA的孵化时间和检测环境的pH值对检测性能的影响，在10nM～100nM范围，实现对目标DNA的灵敏、特异性检测。本发明构建的光电化学检测技术无需标记，简化了操作，降低了检测时间和检测成本，具有操作简单、背景信号低、光电响应灵敏、稳定性好、特异性好等优点，有望推广应用于疾病相关DNA、RNA检测，并拓展应用到其它生物分子检测。

[0069] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。