一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法

摘要

本发明公开了一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，步骤如下：S1、准确称取PLGA‑PEG、卵磷脂、蓖麻油，加入乙醇、乙腈、丙酮、GA，涡混至有机相全部溶解；S2、准确称取Tween 80、屈臣氏水制成水相；S3、水相在磁力搅拌器上，以1500rpm转速搅拌均匀后，逐滴加入有机相，继续搅拌4h以上，使有机溶液挥发完全，定容得到包裹活性成分的聚合物纳米囊(NCs)。本发明采用上述的一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，载药量高、能提高GA在水溶液中的稳定性、体内能长循环的纳米囊，最终实现显著提高GA中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的口服生物利用度。

权利要求

1.一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，其特征在于，步骤如下：准确称取PLGA‑PEG 12.5mg、卵磷脂12.5mg、蓖麻油75mg，加入乙醇1mL、乙腈0.5mL、丙酮

1.5mL、银杏黄酮苷元3mg，涡混至有机相全部溶解；准确称取Tween 80 10mg、超纯水5mL制成水相；水相在磁力搅拌器上，以1500rpm转速搅拌均匀后，逐滴加入有机相，继续搅拌4h，使有机溶液挥发完全，定容至5mL得到包裹活性成分的聚合物纳米囊。

说明书

一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法。

背景技术

[0002] 银杏黄酮苷元(Ginkgo flavone aglycone，GA)是一种新型银杏提取物，主要包含槲皮素(46.61％)、山奈酚(44.23％)、异鼠李素(4.77％)3种黄酮苷元化学结构如下，总黄酮苷元95.61％。

[0003]

[0004] 有研究报道显示，黄酮苷元清除人体自由基的效价为黄酮糖苷效价的7倍。GA中槲皮素、山奈酚和异鼠李素具有较广泛的药理学活性，如抗肿瘤、保护心脑血管，在防治老年痴呆症、冠心病、高血压、心绞痛、脑功能减退、动脉粥样硬化具有广泛应用。但GA成药性差，究其原因为槲皮素、山奈酚、异鼠李素的水溶性差、稳定性差(多羟基结构易氧化)和体内药代动力学性质不佳(口服生物利用度低、半衰期极短)，这是限制GA深层次开发利用的重要因素。

[0005] 槲皮素、山奈酚、异鼠李素均为多羟基结构，化学稳定性差，极容易被氧化，且三者在水中几乎不溶(均小于1μg/mL)。三者的“首过效应”显著，在小肠吸收过程中可被小肠中药物代谢酶(特别是CYP3A4)迅速代谢，吸收进入肝脏后又被肝脏药物代谢酶迅速代谢，最终导致生物半衰期极短。此外，三者均是小肠P‑gp的底物，易受多种因素影响口服吸收过程，最终导致生物利用度极低。因此，亟需开发出银杏叶黄酮苷元高端产品，以提高GA稳定性、口服生物利用度、延长其在体内的半衰期。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，载药量高、能提高GA在水溶液中的稳定性、体内能长循环的纳米囊，最终实现显著提高GA中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的口服生物利用度。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，步骤如下：

[0008] S1、准确称取PLGA、卵磷脂、蓖麻油，依次加入乙醇、乙腈、丙酮、GA，涡混至有机相全部溶解；

[0009] S2、准确称取Tween 80、屈臣氏水制成水相；

[0010] S3、水相在磁力搅拌器上，以1500rpm转速搅拌均匀后，逐滴加入有机相，继续搅拌4h以上，使有机溶液挥发完全，定容得到包裹活性成分的聚合物纳米囊(NCs)。

[0011] 优选的，准确称取PLGA‑PEG 12.5mg、卵磷脂12.5mg、蓖麻油75mg，加入乙醇1mL、乙腈0.5mL、丙酮1.5mL、GA 3mg，涡混至有机相全部溶解。准确称取Tween 80 10mg、屈臣氏水5mL制成水相。水相在磁力搅拌器上，以1500rpm转速搅拌均匀后，逐滴加入有机相，继续搅拌4h以上，使有机溶液挥发完全，定容至5mL得到包裹活性成分的聚合物纳米囊(NCs)。

[0012] 因此，本发明采用上述一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，采用纳米沉淀法，以PLGA‑PEG为囊壳、蓖麻油为囊芯制备的纳米囊，具有尺寸大小、电位合适，物理化学性质稳定，载药量高、能提高GA在水溶液中的稳定性、体内能长循环的纳米囊，最终实现显著提高GA中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的口服生物利用度，以期实现提高靶部位的药物浓度，能够更好的发挥GA药理学作用。

[0013] 聚合物纳米囊(Nanocapsules，NCs)是油芯和包裹在外周的聚合物囊壳组成。聚合物纳米囊的优点为①避光避氧，提高药物的化学稳定性；②高载药量，脂溶性药物在油芯中形成药物储库；③加聚乙二醇(PEG)可达到长循环的目的；④降低药物与酶或转运体的接触，延长生物半衰期和提高吸收效率；⑤利用肿瘤的EPR效应，可以提高药物抗肿瘤的靶向性。

[0014] 该载药系统与GA分散片、滴丸、微胶囊相比，除可提高GA口溶解度差的问题，还可改善GA的吸收程度(降低GA在小肠中的代谢和P‑gp的影响)，同时还可延长GA体内半衰期。因此，本发明采用聚合物纳米囊在载高剂量GA的前提下，能有效解决GA的水溶性极差、稳定性差和体内药动学性质不佳的问题。

[0015] 聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)由乳酸和羟基乙酸聚合而成两亲性聚合物，是可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能。通过调整PLGA分子量和分子比例来调整药物的释放速度，进而调整药物的体内过程。

[0016] 本发明采用具有长循环功能的PLGA‑PEG聚合物材料，制备出高载药量、体内能长循环的纳米囊，最终实现显著提高GA口服生物利用度，提高靶部位的药物浓度，更好的发挥GA药理学作用，进而开发出具有极高应用价值的银杏叶黄酮苷元产品。

[0017] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

[0018] 图1是GA在人工胃液(A)、人工肠液(B)、1％Tween80 PBS溶液(C)中的稳定性折线图；

[0019] 图2是GA、PLGA‑PEG NCs和PLGA NCs在人工胃液中累积释放曲线；

[0020] 图3是GA、PLGA‑PEG NCs和PLGA NCs在PBS中累积释放曲线；

[0021] 图4是GA、PLGA NCs、和PLGA‑PEG NCs溶液放置不同时间后槲皮素、山奈酚和异鼠李素的相对含量；

[0022] 图5是大鼠静脉注射GA、PLGA  NCs和PLGA‑PEG  NCs后的C‑T曲线图

[0023] 图6是大鼠口服GA、PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs后的C‑T曲线图

具体实施方式

[0024] 以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

[0025] 除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

[0026] 一、GA‑NCs的制备

[0027] (1)试药和仪器

[0028] 银杏黄酮苷元(Ginkgo flavone Aglycone，以下简称GA)由贵州省生化工程中心何珺副教授惠赠；槲皮素(批号：1000881‑201610，99.1％)、山奈素(批号：110861‑201812，93.8％)、异鼠李素(批号：110860‑201611，99.1％)对照品均购于中国食品药品检定研究；
蓖麻油(Z23J9Y64268)购于源叶生物公司；大豆卵磷脂(供口服用药用辅料，江药准字F10354702，批号180701)购于江苏曼氏生物科技有限公司；PLGA10k(Mw 10k,LA:GA＝50:
50)，PLGA10k‑PEG2k(PLGA Mw 10k,LA:GA＝50:50)购于西安瑞禧生物技术有限公司，PD‑10脱盐层析柱柱(Sephadex G‑25medium)购于美国GE公司；95％乙醇(AR，国药集团化学试剂有限公司)，丙酮(AR，遵义高等师专化学试剂制厂)，乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，实验用水均为超纯水。

[0029] 激光粒度分析仪(NanoBrook 90Plus PALS，美国Brookhaven)，安捷伦1290系列超高效液相系统，UPLC‑TQS(美国沃特世公司 三重四级杆串联质谱仪)，电子天平(RP5002K，常州锐品精密仪器有限公司)，超纯水机(SC082767，四川沃特尔水处理设备有限公司)，低温高速离心机(Allegra 64R，美国Beckman Coulter公司)。

[0030] SD大鼠，雄性，体重为(220‑250)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物许可证编号SCXK(湘)2019‑0014。

[0031] (2)试验方法

[0032] 准确称取PLGA 12.5mg、卵磷脂12.5mg、蓖麻油75mg，依次加入乙醇1mL、乙腈0.5mL、丙酮1.5mL、GA 3mg，涡混至有机相全部溶解。准确称取Tween 80 10mg、屈臣氏水5mL制成水相。水相在磁力搅拌器上，以1500rpm转速搅拌均匀后，逐滴加入有机相，继续搅拌4h以上，使有机溶液挥发完全，定容至5mL。随后测定NCs粒径及PDI值，结果NCs粒径为184.69±4.4nm，PDI为0.14±0.04，电位为‑25.2±1.87mV。

[0033] 取GA‑NCs 50μL，加入750μL乙腈，继续加入水至1mL，10000rpm离心10min，HPLC在373nm波长下测定槲皮素、山奈素、异鼠李素峰面积，定量计算各成分，即为总药量(NCs中包封与未包封的药量)。

[0034] GA‑NCs的分离纯化方法为取2mL GA‑NCs溶液(含包载GA的GA‑NCs和未包载的GA)上PD‑10柱，柱子先行流下的2mL洗脱液弃去，继续加入3.5mL水洗脱并收集(洗脱液由澄清变混浊再变澄清)，用水将收集的洗脱液定容至5mL。取纯化后的GA‑NCs溶液50μL，加750μL乙腈，再水定容至1mL，10000rpm离心10min，HPLC测定各成分峰面积，计算槲皮素、山奈素、异鼠李素的量，即为GA包封量。

[0035] 根据公式1和2计算包封率Encapsulation Efficiency(％)和载药量Loading Efficiency(％)，结果如表1。结果3mg GA投药量下，以PLGA‑PEG和PLGA为材料的GA‑NCs包封率、载药量无明显区别，说明PEG对EE(％)和LE(％)无明显影响。该法制备的GA纳米囊载药量为29％。

[0036]

[0037]

[0038] 表1 GA‑NCs的包封率和载药量

[0039]

[0040] (3)GA‑NCs在释放介质中的物理稳定性

[0041] 分别取人工胃液、人工肠液、10％牛血清的PBS各3.8mL，加GA‑NCs(GA3mg、PLGA‑PEG)200μL，在不同时间点测定其粒径、PDI值，每组平行三次，结果见表2。结果GA‑NCs在三种释放介质中的粒径、PDI值在均稳定，推测GA‑NCs在口服吸收过程中物理稳定性良好。

[0042] 表2 GA‑NCs在胃液、肠液、10％牛血清的PBS中的粒径、PDI值

[0043]

[0044] 二、GA‑NCs体外释放实验

[0045] (1)GA在释放介质中的化学稳定性

[0046] 配制1mg/mL GA DMSO溶液，分别取125μL加入含有1％Tween 80的胃液、肠液、PBS中，定容至10mL，置于37℃水浴恒温震荡器中，于0h、12h、24h、48h取1mL用于含量测定，每种介质做3组平行样。

[0047] 结果发现，12h时GA在不同释放介质中发生不同程度的颜色改变，在人工肠液中变化最大(黄色最深)，其次为PBS和胃液。GA中各成分在释放介质中的降解曲线见图1，说明GA的多羟基结构在溶液中稳定性差，容易氧化，特别是在偏碱性条件下更不稳定。

[0048] (2)加Vc后的GA稳定性试验

[0049] 若要获得GA‑NCs的体外释放曲线，首先需要保证槲皮素、山奈素、异鼠李素的稳定性，因此，选择在溶液中添加Vc作为抗氧剂。在三种释放介质中加入不同浓度Vc(0.5％和1％)，超声过滤后制得含0.5％和1％Vc的胃液和PBS，考察GA的稳定性。

[0050] 结果槲皮素、山奈素、异鼠李素在含0.5％和1％Vc的胃液和PBS中均稳定，48h各成分均无明显变化，因此选择0.5％Vc的胃液和PBS做为释放介质进行后续GA‑NCs体外释放实验。

[0051] (3)GA‑NCs体外释放曲线

[0052] 10cm透析袋用80℃纯净水浸泡30min，分别取GA DMSO溶液、PLGA NCs、PLGA‑PEG NCs浓缩液(含GA总量约1.5mg/mL)各0.5mL，加入透析袋中并密封，将透析袋放入40mL 37℃预热的释放介质中，同法操作做3组平行样，每组每个样分别于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、3d、4d、5d、6d、7d各取1mL，各点补足同体积的释放介质，HPLC测定GA各成分含量，绘制GA体外累计释放曲线。人工胃液中各成分的累积释放曲线结果见图2，PBS中各成分的累积释放曲线结果见图3。

[0053] GA释放速度比PLGA NCs、PLGA‑PEG NCs中各成分迅速，说明PLGA NCs、PLGA‑PEG NCs对GA具有良好的缓释效果。PLGA NCs、PLGA‑PEG NCs中各成分在胃液和PBS中释放速度无明显差异，释放介质不影响槲皮素、山奈素、异鼠李素的溶出速度。PLGA NCs与PLGA‑PEG NCs比较，槲皮素、山奈素、异鼠李素释放程度无明显差异，说明PEG不影响各成分的释放。根据各成分在C18色谱柱中出峰顺序得知，三种成分脂溶性顺序为槲皮素＜山奈素＜异鼠李素，而NCs中各成分在胃液和PBS中释放速度为槲皮素＞山奈素＞异鼠李素。说明异鼠李素与脂溶性的蓖麻油油芯亲和力最大，因而释放速度最慢；槲皮素与蓖麻油油芯亲和力较小，因而释放速度最快。

[0054] 三、GA‑NCs的稳定性实验

[0055] 将GA药液和纯化后的PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs溶液分别放入玻璃瓶中，4℃保存，分别在0d、7d、14d、21d、30d取样500μL。其中300μL于1.5mL的离心管中，冻干，置于‑20℃保存，待全部样品收集完全，加入100μL DMSO、350μL乙腈、50μL水，涡混均匀，10000r/min离心10min，用HPLC测定槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量。剩余PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs溶液用于测定粒、PDI值和Zeta电位。

[0056] GA、PLGA NCs及PLGA‑PEG NCs放置不同时间后的外观性状可知，PLGA NCs及PLGA‑PEG NCs在放置30d内无出现明显变化，未出现聚集、沉淀、破乳等现象。PLGA NCs及PLGA‑PEG NCs放置不同时间后的粒径、PDI值，Zeta电位均无明显变化(表3)。

[0057] 表3  PLGA  NCs和PLGA‑PEG  NCs不同时间点的粒径、PDI值、Zeta电位

[0058]

[0059] 以0d各成分的含量为100％计算GA、PLGA NCs及PLGA‑PEG NCs溶液放置不同时间后槲皮素、山奈酚、异鼠李素的剩余含量(图4)。GA药物溶液中三个成分均快速降解，14d时槲皮素、山奈酚、异鼠李素的剩余含量分别为18.88±8.65％、23.61±14.63％、30.69±2.70％，而此时PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs溶液中三个成分剩余含量仍大于90％；30d时GA药物溶液中槲皮素、山奈酚、异鼠李素消失殆尽，而此时PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs溶液中三个成分的剩余含量仍大于80％。说明在没有特殊保护条件下(如充惰性气体、避光、加抗氧化剂等)，聚合物PLGA和PLGA‑PEG能隔绝光线和氧，提高槲皮素、山奈酚和异鼠李素的化学稳定性。这也提示，后期可通过充惰性气体、避光、加抗氧化剂等措施，进一步提高GA‑NCs的稳定性，使其符合商品要求。

[0060] 四、检测GA、PLGA‑NCs‑GA和PLGA‑PEG‑NCs‑GA口服生物利用度(1)血浆中槲皮素、山奈酚和异鼠李素分析条件

[0061] 液相条件：色谱柱Agilent Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm,1.8μm)柱，保护柱Waters Van Guard BEH C18(2.1mm×5mm,1.7μm)，流速0.25mL/min，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)‑0.1％甲酸乙腈(B)，进样体积1μL。流动相梯度为0‑0.5min，10％‑10％B；
0.5‑1.0min，10％‑30％B；1.0‑4.5min，30％‑90％B；4.5‑5.0min，90％‑90％B；5.0‑6.0min，
90％‑10％B。

[0062] 质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电压1kV；离子源温度150℃；去溶剂气温度600℃；去溶剂气N2，流速1000L/h；反吹气N2，流速150L/h；碰撞气Ar，流速0.15mL/min；质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站，扫描方式为多反应离子监测模式(MRM)。离‑ ‑
子对信息如下：槲皮素[M‑H] ，301.0→151.0；山萘酚[M‑H] ，285.0→185.0；异鼠李素[M‑‑ ‑
H] ，315.1→300.1；葛根素(IS)[M‑H] ，415.0→295.0。槲皮素、山萘酚、异鼠李素和葛根素的锥孔电压分别为25、30、30、30V，碰撞电压分别为20、30、20、20eV。

[0063] (2)试验方法

[0064] 血浆样品处理方法

[0065] 100μL血浆室温融化后，加1％甲酸水溶液10μL，涡混后，加入20μL 100ng/mL葛根素(IS)涡混后加入400μL乙腈，涡混5min，超声10min，14 000r/min离心10min，取上清液37℃N2吹干。残渣用50％甲醇水溶液200μL超声复溶，14 000r/min离心10min，上清液于UPLC‑MS/MS分析。

[0066] 大鼠分组、给药方法及处理

[0067] 灌胃给药组：取GA混合物5.0mg，加0.5％的CMC‑Na配成0.5mg/mL的GA混悬液。取PLGA NCs、PEG‑PLGA NCs适量，用生理盐水配制成GA浓度为0.5mg/mL的NCs溶液。

[0068] 静脉注射给药组：取GA混合物10.0mg于10mL容量瓶中，加入DMSO 400μL，涡混均匀，加入丙二醇和乙醇各2mL，加入生理盐水至刻度混匀，即得GA溶液(1.0mg/mL)。取制备好的PLGA NCs、PEG‑PLGA NCs适量，用生理盐水配制成GA浓度为1.0mg/mL的NCs溶液。

[0069] 选取36只健康雄性SD大鼠，分为6组(n＝6)，分别静脉注射和灌胃给药GA、PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs，各组GA剂量均为6.64mg/kg。给药后于0.08h、0.17h、0.33h、0.50h、0.75h、1h、1.5h、2h、3h、4h、8h从大鼠眼眶静脉丛取血0.3mL，并置于肝素化EP管中，5 000r/min离心10min，取血浆100μL加10μL 0.5％Vc水溶液，置于‑20℃保存直至UPLC‑MS/MS分析。

[0070] 样品定量测定后，使用药代动力学软件WinNonLin 8.2(Phenix，美国Pharsight公司)软件的NCA模型分别计算各组槲皮素、山奈酚、异鼠李素的t1/2、AUC0‑t、Tmax、Cmax、AUC0‑t、AUC0‑∞、Vd/F、Cl/F、MRT等主要药代动力学参数。结果以“均值±标准差”(X±SD)表示，应用Spss软件进行统计分析，采用t检验进行组间比较，P<0.05表示有统计学意义。

[0071] (3)口服生物利用度结果分析

[0072] 各组药动学结果见表4和表5，血浆药物浓度‑时间关系曲线(C‑T曲线)图见图5和图6。结果显示，口服给与PLGA NCs和PLGA‑PEG NCs，均可显著提高GA中三个成分的达峰浓度Cmax、口服生物利用度，且无明显吸收相，说明吸收过程较快。与GA组比，口服给予PLGA NCs后，槲皮素、山奈酚、异鼠李素的Cmax提高了7.91、5.07、5.31倍；口服给予PLGA‑PEG NCs后，槲皮素、山奈酚、异鼠李素的Cmax提高了6.53、3.87、2.89倍。GA中槲皮素、山奈酚、异鼠李素的口服生物利用度低，分别为11.05％、6.21％和2.19％。与GA比，GA制备成PLGA NCs后，槲皮素、山奈酚、异鼠李素的口服生物利用度分别提高了1.96、1.44和2.32倍；GA制备成PLGA‑PEG NCs后，槲皮素、山奈酚、异鼠李素的口服生物利用度分别提高了2.53、1.87和1.81倍。由于口服给药剂量极低(6.64mg/kg)，口服的药动学参数获得不够准确，而静脉注射给药能更简单直接体现GA中三个成分的消除过程。从图5的C‑T曲线图中可以看出，PLGA‑PEG NCs组的各成分比PLGA‑PEG NCs组代谢消除变慢，且都比GA慢。PLGA NCs的槲皮素、山奈酚、异鼠李素清除率(CL)分别是GA的0.02、0.406和0.528倍；PLGA‑PEG NCs的槲皮素、山奈酚、异鼠李素的CL分别是GA的0.014、0.94和0.75倍。以上结果说明PLGA和PLGA‑PEG能显著改善GA的口服吸收过程，能降低GA的首过效应和体内消除速度，提高GA的体循环时间，且PLGA‑PEG的作用效果优于PLGA。

[0073] 表4大鼠静脉注射GA、PLGA  NCs和PLGA‑PEG NCs后的药代动力学参数

[0074]

[0075]

[0076] 备注：“*”，“**”，“***”分别表示和GA组相比P<0.05，P<0.01，P<0.001；“#”，“##”，“###”分别表示PLGA‑PEG‑NCs‑GA和PLGA‑NCs‑GA组相比P<0.05，P<0.01，P<0.001。

[0077] 表5大鼠灌胃给予GA、PLGA  NCs和PLGA‑PEG NCs后的药代动力学参数

[0078]

[0079]

[0080] 备注：“*”，“**”，“***”分别表示和GA组相比P<0.05，P<0.01，P<0.001；“#”，“##”，“###”分别表示PLGA‑PEG‑NCs‑GA和PLGA‑NCs‑GA组相比P<0.05，P<0.01，P<0.001。

[0081] 因此，本发明采用上述一种提高银杏黄酮苷元口服生物利用度的纳米囊制备方法，载药量高、能提高GA在水溶液中的稳定性、体内能长循环的纳米囊，最终实现显著提高GA中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的口服生物利用度。

[0082] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。