一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，制备所述复合微生物制剂原料包括光合细菌、酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、蛭弧菌、复合EM菌和碳源。本发明对植物纤维通过碱溶液进行浸泡预处理，能够提高纤维素作为碳源的处理分解效果，且采用常见且纤维素含量高的农作物作为碳源，能够有效降低成本，另外通过采用物理除氧厌氧培养法获得紫色非硫光合细菌富集培养液后，再对紫色非硫光合细菌进行分离纯化，能够得到效果更佳的紫色非硫光合细菌，在制成复合微生物制剂后，其与其它菌粉的协同作用更强，为水体的净化治理与水产品的健康生长提供了良好的作用效果。

权利要求

1.一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：制备所述复合微生物制剂原料包括紫色非硫光合细菌20‑30份、酿酒酵母菌5‑10份、枯草芽孢杆菌1‑5份、蛭弧菌1‑

5份、复合EM菌5‑10份和碳源；其中所述碳源为农作物植物纤维，选自芦苇纤维、秸秆纤维和玉米芯纤维中的一种或多种；所述制备方法包含如下步骤：步骤一、制作碳源培养基：向农作物植物纤维中添加碱溶液进行浸泡预处理，向预处理之后的纤维素中添加纤维素分解菌，得到碳源混合液，并制成培养基；

步骤二、筛选纯化紫色非硫光合细菌：采用物理除氧厌氧培养法获得紫色非硫光合细菌富集培养液后，再对紫色非硫光合细菌进行分离纯化；

步骤三、菌种的液体发酵：将各菌种在其适宜的培养条件下活化培养，再分别将其接种到步骤一制成的培养基中扩大培养至对数生长期；

步骤四、菌株液混合：调节OD600=1.5，然后将各菌株培养液混合，备用；

步骤五、菌种的真空冷冻干燥：将步骤四的混合菌液进行离心处理，移去上清液后再加入冻干保护剂，之后在‑76℃的环境下预冻1‑5h，再将冻结样品移入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，制成菌粉；

步骤六、菌粉包装：采用水溶性材料将菌粉进行包裹，并在包装后贮存在阴凉、干燥、通风、清洁的仓库中，即可。

2.根据权利要求1所述的一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述碱溶液为质量分数1‑5%的NaOH溶液。

3.根据权利要求1所述的一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤二中，试管中的单菌落采用双层平板法进行纯化，且保存已经纯化的菌株。

4.根据权利要求1所述的一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤四中，若OD600>1.5，用培养液稀释至0D600=1.5；若OD600<1.5，离心后移去部分上清液，再调整至0D600=1.5。

5.根据权利要求1所述的一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤五中，离心设备温度调节在1‑5℃，且转速为3000‑6000r/min，离心时间为10min。

6.根据权利要求1所述的一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤六中，菌粉贮存环境的温度在35℃以上，所述菌粉采用真空包装或者充氮气包装。

说明书

一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于水产养殖技术领域，特别是涉及一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法。

背景技术

[0002] 复合微生物制剂，亦称“复合微生态制剂”，是一类用于增强水产养殖生物生长与免疫能力等的微生物制剂，由两种或多种微生物按适当比例共同培养，充分发挥群体优势，取得最佳应用效果。所用微生物通常有光合菌群、放线菌群、酵母菌群和乳酸菌群等多种有效微生物群。复合微生物制剂可分解养殖水体中的有机物，使氨氮、亚硝基氮等转化为无害物质，对水体净化、建立良好生态平衡环境有重要作用；菌群在新陈代谢过程中可产生多种维生素、氨基酸与生理活性物质，从而促进动植物的营养吸收、生长和提高免疫与抗病能力，增强养殖效果。

[0003] 在培育各个菌株时，通常采用葡萄糖、甲醇或者蔗糖来作为碳源以供菌株的培育，导致其成本过高，且现有的复合微生物制剂通常采用的光合细菌为普通光合细菌，在与其它微生物协同作用处理水质时，其效果有所欠缺，存在一定限制性，为此我们提出了一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法解决上述问题。

发明内容

[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明提供一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，避免了在培育各个菌株时，采用的碳源成本过高而导致其制备成本增加，并且提升了微生物在处理水质时的协同作用性。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种水产养殖用复合微生物制剂的制备方法，制备所述复合微生物制剂原料包括紫色非硫光合细菌、酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、蛭弧菌、复合EM菌和碳源，包括以下步骤：

[0006] 步骤一、制作碳源培养基：向农作物植物纤维中添加碱溶液进行浸泡预处理，向预处理之后的纤维素中添加纤维素分解菌，得到碳源混合液，并制成培养基；

[0007] 步骤二、筛选纯化紫色非硫光合细菌：采用物理除氧厌氧培养法获得紫色非硫光合细菌富集培养液后，再对紫色非硫光合细菌进行分离纯化；

[0008] 步骤三、菌种的液体发酵：将各菌种在其适宜的培养条件下活化培养，再分别将其接种到步骤一制成的培养基中扩大培养至对数生长期；

[0009] 步骤四、菌株液混合：调节OD600＝1.5，然后将各菌株培养液混合，备用；

[0010] 步骤五、菌种的真空冷冻干燥：将步骤四的混合菌液进行离心处理，移去上清液后再加入冻干保护剂，之后在‑76℃的环境下预冻1‑5h，再将冻结样品移入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，制成菌粉；

[0011] 步骤六、菌粉包装：采用水溶性材料将菌粉进行包裹，并在包装后贮存在阴凉、干燥、通风、清洁的仓库中，即可。

[0012] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤一中，所述植物纤维采用芦苇纤维、秸秆纤维和玉米芯纤维中的一种或多种。

[0013] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤一中，所述碱溶液为质量分数1‑5％的NaOH溶液。

[0014] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤二中，试管中的单菌落采用双层平板法进行纯化，且保存已经纯化的菌株。

[0015] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤四中，若OD600>1.5，用培养液稀释至0D600＝1.5；若OD600<1.5，离心后移去部分上清液，再调整至0D600＝1.5。

[0016] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤四中，各菌株液混合按照紫色非硫光合细菌20‑30份、酿酒酵母菌5‑10份、枯草芽孢杆菌1‑5份、蛭弧菌1‑5份、复合EM菌5‑10份进行配制混合。

[0017] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤五中，离心设备温度调节在1‑5℃，且转速为3000‑6000r/min，离心时间为10‑15min。

[0018] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤六中，菌粉贮存环境的温度在35℃以上，所述菌粉采用真空包装或者充氮气包装。

[0019] 与现有技术相比，本发明能达到的有益效果是：

[0020] 本发明对植物纤维通过碱溶液进行浸泡预处理，能够提高纤维素作为碳源的处理分解效果，且采用常见且纤维素含量高的农作物作为碳源，能够有效降低成本，另外通过采用物理除氧厌氧培养法获得紫色非硫光合细菌富集培养液后，再对紫色非硫光合细菌进行分离纯化，能够得到效果更佳的紫色非硫光合细菌，在制成复合微生物制剂后，其与其它菌粉的协同作用更强，为水体的净化治理与水产品的健康生长提供了良好的作用效果。

具体实施方式

[0021] 为了使本发明实现的技术手段；创作特征；达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料；试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0022] 实施例1

[0023] 步骤一、制作碳源培养基：采取一定量的玉米芯纤维纤维，并且将其放置到容器中添加质量分数2％的NaOH溶液进行浸泡预处理，将预处理之后的纤维素放入到另外容器中，同时添加纤维素分解菌，得到碳源混合液，并制成培养基；

[0024] 步骤二、筛选纯化紫色非硫光合细菌：采用物理除氧厌氧培养法获得紫色非硫光合细菌富集培养液后，再对紫色非硫光合细菌进行分离纯化，其步骤包括：

[0025] S1、取1mL紫色非硫光合细菌群富集培养液作梯度稀释，取稀释度不同的多个紫色非硫光合细菌群富集培养液，分别接种于半固体分离培养基上，充分混匀用灭菌的液体石蜡封口，塞上橡胶塞，封口膜封口，在2000～3000勒克斯(Lx)光照强度、30℃条件下培养7～10天至试管中出现深红色单菌落；

[0026] S2、挑取试管中的单菌落采用双层平板法进行纯化，先在分离培养基平板上划线，再在上面倒一层融化的培养基，造成厌氧环境，用封口膜封口，在2000～3000勒克斯(Lx)光照强度、30℃条件下培养7～10天，反复挑取单菌落，镜检，保存已纯化的菌株。

[0027] 步骤三、菌种的液体发酵：将各菌种在其适宜的培养条件下活化培养，再分别将其接种到步骤一制成的培养基中扩大培养至对数生长期。

[0028] 步骤四、菌株液混合：调节OD600＝1.5，若OD600>1.5，用培养液稀释至0D600＝1.5；若OD600<1.5，离心后移去部分上清液，再调整至0D600＝1.5；然后将步骤三纯化培养的各菌株培养液(紫色非硫光合细菌25份、酿酒酵母菌8份、枯草芽孢杆菌3份、蛭弧菌2份、复合EM菌5份)混合，备用；

[0029] 步骤五、菌种的真空冷冻干燥：将步骤四的混合菌液通过离心设备进行离心处理(离心温度为5℃，转速为5000r/min，离心15min)，移去上清液后再加入冻干保护剂海藻糖，之后在‑76℃的环境下预冻2h，再将冻结样品移入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，制成菌粉；

[0030] 步骤六、菌粉包装：采用水溶性材料将菌粉进行包裹，并在包装后贮存在阴凉、干燥、通风、清洁的仓库中，即可。

[0031] 净化效果测试：

[0032] 采用湖南省浏阳市某对虾养殖场用水做为实验水源，其中：溶氧为3.82mg/L，氨氮0.25mg/L，pH为7.05。实验使用4个水桶，体积为15L，1号桶为空白组，2号桶为酵母菌组，3号桶为乳酸菌组，4号桶为本发明复合微生物制剂组，各桶的菌种投放量为15mL/L，温度控制在25℃左右，分别在培养2、4、6、8、10、12、14、16天时测试各桶的溶氧、氨氮及pH值，取样时在各桶的表层、中层、底层分别取样，取平均值作为测定结果，结果见如下表1：

[0033] 表1

[0034]

[0035]

[0036] 由上表1可知，本发明制备得到的复合微生物制剂为水体的净化治理与水产品的健康生长提供了良好的作用效果。

[0037] 以上显示和描述了本发明的基本原理；主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。