一种用于发酵霉菌毒素污染饲料的复合发酵菌剂及其应用

摘要

本发明提供了一种用于发酵污染饲料的复合发酵菌剂及其应用，属于微生物技术领域。本发明所提供的复合发酵菌剂由赖氨酸芽孢杆菌HQ08(Bacillus lysinosus)和苜蓿中华根瘤菌CM77（Sinorhizobium meliloti）组成，赖氨酸芽孢杆菌HQ08的保藏编号为CGMCC No.24221，苜蓿中华根瘤菌CM77的保藏编号为CGMCC No.24222。本发明所提供的复合发酵菌剂可以有效的同时降低饲料中的玉米赤霉烯酮毒素和黄曲霉毒素B1，且均有优异的效果。

权利要求

1.一种复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合发酵菌剂是由赖氨酸芽孢杆菌HQ08和苜蓿中华根瘤菌CM77所组成的微生物复合菌剂；

其中，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 24221，保藏日期为2021年12月30日，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08的16s DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

所述苜蓿中华根瘤菌CM77，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 24222，保藏日期为2021年12月30日，所述苜蓿中华根瘤菌CM77的

16s DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的复合发酵菌剂，其特征在于，按照质量份数计，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08为1‑9份，所述苜蓿中华根瘤菌CM77为1‑9份。

3.根据权利要求2任一项所述的复合发酵菌剂，其特征在于，按照质量份数计，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08为4‑6份，所述苜蓿中华根瘤菌CM77为4‑6份。

4.根据权利要求1‑3任一项所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中还包括

5‑20份海藻糖，1‑10份甘氨酸，5‑25份甘油和20‑45份无菌水。

5.根据权利要求4所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，赖氨酸芽孢杆

9 9

菌HQ08的活菌数≥0.5*10cfu/g，所述苜蓿中华根瘤菌CM77的活菌数≥0.5*10cfu/g。

说明书

一种用于发酵霉菌毒素污染饲料的复合发酵菌剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物学技术领域，尤其涉及一种用于发酵污染饲料的复合发酵菌剂及其应用。

背景技术

[0002] 玉米、小麦、大麦和花生等农作物及其副产品在收割、晾晒和储存等环节中，经常受到霉菌毒素的污染。2015‑2020年，农副产品中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素的检出率持续增加。自2016年开始，玉米副产品中黄曲霉毒素B1的检出率骤升，并且连续3年处于较高的污染水平，而且，山东、江苏、云南、安徽等地的麸皮产品存在黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮重度污染的现象。同时，近几年，我国的玉米赤霉烯酮污染状况十分严重，玉米赤霉烯酮的超标率较往年呈明显上升趋势，其中在玉米副产品及宠物饲粮中玉米赤霉烯酮的检出率均达到100% 。

[0003] 因此，有效的降低饲料中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的污染是目前急需解决的问题。其中，生物解毒法包括微生物降解法和酶解法，具有高效、特异性强、环境友好、污染小的特点，因此，近些年来成为人们研究的热点。但是，现有技术多为针对单一毒素的菌剂而缺少可同时去除多种毒素的复合菌剂。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种用于发酵污染饲料的复合发酵菌剂及其应用。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种复合发酵菌剂，所述复合发酵菌剂是由赖氨酸芽孢杆菌HQ08和苜蓿中华根瘤菌CM77所组成的微生物复合菌剂；

[0007] 其中，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08 (Bacillus lysinosus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 24221，保藏日期为2021年12月30日；所述苜蓿中华根瘤菌CM77（Sinorhizobium meliloti），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 24222，保藏日期为2021年12月30日。

[0008] 优选地，按照质量份数计，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08为1‑9份，所述苜蓿中华根瘤菌CM77为1‑9份。

[0009] 优选地，按照质量份数计，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08为4‑6份，所述苜蓿中华根瘤菌CM77为4‑6份。

[0010] 优选地，所述复合菌剂中还包括5‑20份 海藻糖，1‑10份甘氨酸，5‑25份甘油和20‑45份无菌水。

[0011] 优选地，所述复合菌剂中，赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活菌数≥0.5*109cfu/g，所述苜9
蓿中华根瘤菌CM77的活菌数≥0.5*10cfu/g。

[0012] 优选地，所述复合菌剂用于处理黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染的饲料。

[0013] 其次，本发明提供了一种复合菌剂在降低饲料黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染中的应用，所述复合发酵菌剂是由赖氨酸芽孢杆菌HQ08和苜蓿中华根瘤菌CM77所组成的微生物复合菌剂；

[0014] 其中，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08 (Bacillus lysinosus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 24221，保藏日期为2021年12月30日；所述苜蓿中华根瘤菌CM77（Sinorhizobium meliloti），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 24222，保藏日期为2021年12月30日。

[0015] 优选地，所述复合菌剂中，按照质量份数计，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08为4‑6份，所述苜蓿中华根瘤菌CM77为4‑6份。

[0016] 优选地，所述复合菌剂中还包括5‑20份 海藻糖，1‑10份甘氨酸，5‑25份甘油和20‑45份无菌水。

[0017] 优选地，所述复合菌剂中，赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活菌数≥0.5*109cfu/g，所述苜9
蓿中华根瘤菌CM77的活菌数≥0.5*10cfu/g。

[0018] 本发明的有益效果是：

[0019] 本发明所提供的复合发酵菌剂可以有效地同时降低饲料中的玉米赤霉烯酮毒素和黄曲霉毒素B1，且均有优异的效果。

具体实施方式

[0020] 为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

[0021] 实施例1

[0022] 赖氨酸芽孢杆菌HQ08的分离与筛选

[0023] （1）配置筛选培养基1L：硫酸铵 5g，硫酸二氢钾2.5g，硫酸镁1g，磷酸氢二钠0.5g，琼脂粉15‑20g，pH调整为7, 120℃灭菌30min，冷却至室温后添加黄曲霉素B1标准品，调节终浓度为1μg/ml；

[0024] （2）称取1g土壤，溶解于100ml无菌的蒸馏水中，室温静置5min，取上清用灭菌蒸馏水稀释成不同浓度梯度，取1ml涂布于筛选培养基，37℃培养；

[0025] （3）挑取形态不同的单菌落使用LB液体培养基进行扩大培养，使用灭菌蒸馏水稀释，取1ml涂布于筛选培养基中，37℃培养；

[0026] （4）挑取单菌落，采用划线方法对菌株进行纯化，挑取生长一致的菌落进行降解率检测；

[0027] （5）即获得降解黄曲霉素B1能力较高的菌株：赖氨酸芽孢杆菌HQ08。

[0028] 实施例2

[0029] 苜蓿中华根瘤菌CM77菌株的分离与筛选

[0030] （1）初筛：

[0031] 1）配制改良版基础盐培养基（1L）：硝酸铵0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾1.5 g，氯化钠1 g，硫酸镁0.02 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.4；加入15‑20 g琼脂，混匀灭菌；

[0032] 2）调制终浓度为1 µg/mL的玉米赤霉烯酮，加入培养基中混匀，倒平板；

[0033] 3）称取自然环境中的土壤，溶解到无菌的蒸馏水或者生理盐水中，混匀静置，分别取上清、半浑浊和浑浊，接入上述平板中；

[0034] 4）放入37 ℃恒温培养箱中培养，待平板中的菌落达到70‑80 %，挑取单菌落；

[0035] 5）37 ℃，170 rpm进行扩大繁殖培养。

[0036] （2）复筛：

[0037] 1）配制LB液体培养基，加入调制终浓度为2µg/mL的玉米赤霉烯酮，混匀，摇床培养；

[0038] 2）选择平板划线法将菌株划线在复筛培养基中，以相同的培养条件培养至长出可观察的单菌落，挑取单菌落于LB液体培养基，37 ℃，170rpm进行扩大繁殖培养，即获得具有玉米赤霉烯酮降解能力的菌株：苜蓿中华根瘤菌CM77菌株。

[0039] 实施例3

[0040] 菌株的鉴定

[0041] （1）提取菌液的总DNA，作为菌液PCR模板，使用27F和1492R引物进行PCR扩增；

[0042] （2）PCR扩增反应体系（10μl）如下：

[0043] cDNA 1μl、10×Buffer 1μl、2.5 mM dNTP 0.8μl、10μM正反引物各0.5μl，rTaq酶 0.05μl、2H2O 6.15μl；

[0044] （3）设计的PCR引物的序列如下

[0045]名称 序列(5’‑3’)
27F16s AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R16s GGTTACCTTGTTACGACTT
M13(‑47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13(‑48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

[0046] （4）PCR反应条件为：

[0047] 94℃ 5min；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min；

[0048] （5）整个反应结束之后，反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下将目的条带切回，按照上海生工SanPrep柱式试剂盒说明书进行DNA回收、纯化；

[0049] （6）回收产物与PMD18‑T克隆载体进行连接，16℃连接过夜，获得目的菌株基因序列PMD18‑T重组载体，连接体系如下：回收产物 4.5μl，PMD18‑T 0.5μl，[0050] （7）将连接产物全部转入已制备好的大肠杆菌感受态DH5α中，碎冰浴30 min，42℃热激30s，置于冰上；

[0051] （8）加入650 μL已经预热至37℃的LB培养基，37℃震荡培养1h，然后5000 rpm离心3 min，弃大部分上清，将剩余约150 μL上清与沉淀吹打混匀，涂布于含有100 mg/mL氨苄青霉素钠（Amp）的LB平板上，37℃正置培养1h后，再倒置培养12‑16h；

[0052] （9）挑取平板上长势良好的单菌落，37℃培养6h后，用特异引物27F和1492R进行阳性克隆的筛选，将连接正确的菌液送至上海桑尼生物公司测序。最后，将目的菌株的cDNA序列进行Blast比对，确定菌株种属；

[0053] （10）其中，赖氨酸芽孢杆菌HQ08 (Bacillus lysinosus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 24221，保藏日期为2021年12月30日，赖氨酸芽孢杆菌HQ08的16s DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

[0054] 苜蓿中华根瘤菌CM77（Sinorhizobium meliloti），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 24222，保藏日期为2021年12月30日，苜蓿中华根瘤菌CM77的16s DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

[0055] 实施例4

[0056] 赖氨酸芽孢杆菌菌株HQ08的活化

[0057] （1）配置LB培养基，LB培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；

[0058] （2）将赖氨酸芽孢杆菌菌株HQ08，接种到LB培养基中，在25‑30℃的温度条件下培养8‑10小时，得到活化后的赖氨酸芽孢杆菌HQ08。

[0059] 苜蓿中华根瘤菌菌株CM77的活化

[0060] （1）配置LB培养基，LB培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；

[0061] （2）将苜蓿中华根瘤菌菌株CM77，接种到LB培养基中，在30‑37℃的温度条件下、170rpm摇瓶培养8‑10小时，得到活化后的苜蓿中华根瘤菌CM77菌株。

[0062] 实施例5

[0063] 制备复合发酵菌剂1

[0064] （1）将50g赖氨酸芽孢杆菌HQ08，50g苜蓿中华根瘤菌CM77，200g海藻糖，100g甘氨酸，150g甘油和450g水混合得到复合发酵菌剂1；

[0065] （2）该复合菌剂中赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活菌数为0.5*109cfu/g；苜蓿中华根瘤9
菌CM77的活菌数为0.5*10cfu/g。

[0066] 实施例6

[0067] 制备复合发酵菌剂2

[0068] （1）将90g赖氨酸芽孢杆菌HQ08，10g苜蓿中华根瘤菌CM77，200g海藻糖，100g甘氨酸，150g甘油和450g水混合得到复合发酵菌剂1；

[0069] （2）该复合菌剂中赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活菌数为0.9*109cfu/g；苜蓿中华根瘤9
菌CM77的活菌数为0.1*10cfu/g。

[0070] 实施例7

[0071] 制备复合发酵菌剂3

[0072] （1）将10g赖氨酸芽孢杆菌HQ08，90g苜蓿中华根瘤菌CM77，200g海藻糖，100g甘氨酸，150g甘油和450g水混合得到复合发酵菌剂3；

[0073] （2）该复合菌剂中赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活菌数为0.1*109cfu/g；苜蓿中华根瘤9
菌CM77的活菌数为0.9*10cfu/g。

[0074] 实施例8

[0075] 检测复合发酵菌剂1在降低饲料黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染中的作用[0076] （1）在花生粕中添加黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，其中黄曲霉毒素B1含量为300μg/kg，玉米赤霉烯酮含量为1500μg/kg；

[0077] （2）实验组中：将50g复合发酵菌剂1与950g花生粕混合，之后加入灭菌水500g；对照组中：将50g灭菌后的复合发酵菌剂与950g花生粕混合，之后加入灭菌水500g；

[0078] （2）置于30℃发酵3天后，检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量，并检测水溶性多糖的变化情况。

[0079] 表1 复合菌剂对花生粕中AFB1和ZEN的降解效果

[0080]

[0081] 表2 复合菌剂发酵对花生粕中纤维素的降解效果

[0082]

[0083] 检测结果为黄曲霉毒素B1的含量为26.1μg/kg，降低了90.8%，玉米赤霉烯酮毒素的含量为48.7μg/kg，降低了96.6%。

[0084] 同时，本发明发现发酵后的花生粕中有部分纤维素被分解为水溶性多糖，其中，对照组的水溶性多糖量为30.5%，而实验组的水溶性多糖量为35.2%，提高了15.4%，提高了花生粕的营养价值。

[0085] 实施例9

[0086] 复合发酵菌剂1发酵后的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染饲料对于南美白对虾生长的影响

[0087] （1）实验组：将黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量分别为1500μg/kg和7500μg/kg的花生粕，经过复合菌剂发酵处理后，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量分别降低为142.5μg/kg和283.5μg/kg（降解率分别为90.5%和96.3%）。然后过80目筛的白鱼粉、虾壳粉、豆粕、高筋面粉、鱼油和添加剂等，按照表3比例混合，制成团。经混合后，饲料中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量分别为28.5μg/kg和56.7μg/kg；

[0088] 表3对虾饲料配方

[0089] 成分 用量/kg白鱼粉 28
虾壳粉 4
豆粕 10
花生粕 20
高筋面粉 34
鱼油 1
添加剂 3
合计 100

[0090] （2）用F‑26型双螺杆挤条机制成条状（直径1mm），55‑60℃烘干，切割成2‑5mm长的饲料颗粒，密封，干燥保存，待用；

[0091] （3）对照组1：花生粕中不加入黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，也不用复合菌剂发酵；对照组2：花生粕中加入黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮后，不经过复合菌剂发酵，其他步骤与发酵处理的相同；

[0092] （4）选取平均体重约为5.0g的南美白对虾，经过60天的饲喂，结束后记录对虾的体重，计算对虾的增重率，计算公式如下：

[0093] 增重率（WG，%）=（Wt‑ W0）/W0×100。

[0094] 其中：Wt：终末体重（g），W0：初始体重（g）。

[0095] （5）实验结果如表4所示：

[0096] 表4 饲喂不同饲料后南美白对虾的增重情况

[0097]

[0098] 从实验结果中可以看出，对照组2的增重率为210.7%，比对照1的264.7%降低了20.4%，而实验组中对虾的增重率为269.3%，与对照组相比无显著差异，说明使用复合菌剂发酵饲料后，可以使被黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染的对虾饲料恢复为正常水平，对南美白对虾的生长没有负面影响。

[0099] 实施例10

[0100] 复合发酵菌剂1发酵后的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染饲料对刺参生长的影响

[0101] （1）实验组：将黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量分别为3000μg/kg和15000μg/kg 的花生粕，经过复合菌剂发酵处理后，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量分别降低为295.8μg/kg和625.3μg/kg（降解率分别为90.2%和95.9%），与过80目筛的马尾藻、扇贝边粉和添加剂等，按照比例混合，制成团；经混合后，饲料中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量分别为29.6μg/kg和62.5μg/kg。

[0102] 表5刺参饲料配方

[0103] 成分 用量/kg马尾藻粉 65
扇贝边粉 22
花生粕 10
添加剂 3
合计 100

[0104] （2）用F‑26型双螺杆挤条机制成条状（直径1mm），55‑60℃烘干，粉碎过筛成100目的饲料颗粒，密封，干燥保存，待用；

[0105] （3）对照组1：花生粕中不加入黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，也不用复合菌剂发酵；对照组2：花生粕中加入黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮后，不经过复合菌剂发酵，其他步骤与发酵处理的相同；

[0106] （4）选取初始体重约8g的刺参，经过60天的饲喂，结束后记录刺参的数量和体重，计算刺参的增重率，计算公式如下：

[0107] 增重率（WG，%）=（Wt‑ W0）/W0×100。

[0108] 其中：Wt：终末体重（g），W0：初始体重（g）。

[0109] （5）实验结果如表6所示：

[0110] 表6 饲喂不同饲料后刺参的增重情况

[0111]

[0112] 从实验结果中可以看出，对照组2的增重率为92.5%，比对照组1降低了36.1%，而实验组的增重率为157.9%，与对照组1没有明显差异，甚至还略高于对照1，说明使用复合菌剂发酵处理被霉菌毒素黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染的饲料原料后，可以恢复为正常水平，使刺参正常生长发育。

[0113] 本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。