多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的培养基及培养方法和用途

摘要

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的培养基及培养方法和用途。本发明提供一种培养基组合物，该培养基组合物中含有腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM等因子，利用该培养基能够大大提升由iPSC诱导分化获得的肝细胞的成熟度。表现为ASGR1+细胞比例提升，以及分泌ALB水平提升。本发明利用基因编辑和重组技术在ASGR1基因中添加报告基因，将含有这两种基因的载体导入多能干细胞，当多能干细胞诱导分化为肝细胞后，报告基因和ASGR1共表达，从而有助于检测ASGR1+肝细胞亚群在分化细胞中的比例，且利用FACS检测或分选ASGR1+细胞群，无需额外实验操作，细胞消化后可直接上机检测或分选，利用本发明的检测方法能实现高通量检测。

权利要求

1.一种培养基组合物，其特征在于，包括：

基础培养基、GlutaMAX、腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM、氢化可的松琥珀酸钠；

其中，所述基础培养基为hepatoZYME‑SFM，所述腺苷酸环化酶激活剂为Forskolin，所述ALK5抑制剂为SB431542，所述生长因子为HGF，所述GlutaMAX 的体积分数为1%，所述Forskolin的浓度为20 µM，所述SB431542的浓度为5 µM，所述HGF的浓度为20 ng/mL，所述OSM的浓度为20 ng/mL，所述氢化可的松琥珀酸钠的浓度为10 µM。

2.一种制备肝细胞的方法，其特征在于，包括：

利用多能干细胞诱导分化获得肝母细胞，将所述肝母细胞置于权利要求1中所述的培养基组合物中培养，以便获得肝细胞。

3.一种成熟肝细胞的检测方法，其特征在于，包括：

利用基因编辑技术构建含有ASGR1基因和与所述ASGR1基因共表达的报告基因的载体，将所述载体导入多能干细胞，利用权利要求2所述的制备肝细胞的方法制备获得肝细胞，检测所述肝细胞中报告基因的表达，以便检测由所述多能干细胞诱导分化获得的成熟肝细胞的量和比例。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白报告基因。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述报告基因为mCherry报告基因。

6.一种监测由多能干细胞诱导分化获得的肝细胞的方法，其特征在于，包括：利用基因编辑技术构建含有ASGR1基因和与所述ASGR1基因共表达的报告基因的载体，将所述载体导入多能干细胞，利用权利要求2所述的制备肝细胞的方法制备获得肝细胞，实时监测在由所述肝母细胞诱导分化获得肝细胞过程中ASGR1基因的表达，以便实时监测诱导分化过程中肝细胞的成熟度、ASGR1阳性细胞的位置及比例。

7.一种筛选多能干细胞诱导分化获得肝细胞的培养基组合物组分的方法，其特征在于，包括：利用权利要求3 5任一项所述的检测方法，比较由未添加待测培养基组分和添加待测~培养基组分的培养基培养获得的成熟肝细胞的量和比例，所述成熟肝细胞的量的差值和比例的差值中的至少之一高于预定阈值是所述待测培养基组分适于作为由多能干细胞诱导分化获得肝细胞的培养基组合物组分的指示。

说明书

多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的培养基及培养方法和

用途

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的培养基及培养方法和用途。

背景技术

[0002] 多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导的多能干细胞(iPSC)。2006年，山中伸弥在京都大学通过给小鼠成纤维细胞转染四个转录因子OCT3/4、SOX2、MYC和KLF4使之转化为与小鼠胚胎干细胞在形态、基因表达、扩增能力、类胚体和畸胎瘤生成能力、分化潜能等方面极其相似的细胞类型。人诱导的多能干细胞在次年被诱导成功。人多能干细胞具有自我更新和多方向分化潜能，是再生医学中重要的种子细胞。

[0003] 在特定的条件下，人iPSC可以诱导成类肝细胞(iHeps)。因为人iPSC的无限扩增能力，理论上可以生产无限量的iHeps。但实际上由于人iPSC等多能干细胞通过无血清培养基分化来的iHeps成熟性仍较低，其在小鼠肝脏移植中细胞整合效率仍不理想。

[0004] 因此，亟需开发一种能够提升由多能干细胞诱导分化获得的iHeps(类肝细胞)的成熟度的培养基组成，以及获得成熟度较高的iHeps的方法。

发明内容

[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种培养基组合物，该培养基组合物中含有腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM等因子，利用该培养基能够大大提升由iPSC诱导分化获得的肝细胞的成熟度。

[0006] 为此，本发明第一方面提供一种培养基组合物。根据本发明的实施方案，所述培养基组合物包括：

[0007] 腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM。

[0008] 现有的由多能干细胞诱导分化获得iHeps的诱导分化培养基虽然能够获得肝细+胞，但肝细胞成熟度较低，表现在ASGR1细胞比例和分泌的人血白蛋白都相对较低，不能满足科研人员对iHeps的要求。

[0009] 通过将由多能干细胞诱导分化获得的肝母细胞置于上述含有腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM的特定组成的培养基中进行诱导分化，由iPSC分化而来的肝+细胞成熟度有了显著提升，表现为ASGR1细胞比例提升(ASGR1仅在成熟肝细胞中表达)，以及分泌ALB水平提升。

[0010] 根据本发明的实施方案，所述培养基组合物还具有以下附加技术特征中的至少之一：

[0011] 根据本发明的实施方案，所述腺苷酸环化酶激活剂选自Forskolin、NKH 477、PACAP1‑27、PACAP 1‑38、dbcAMP中的至少之一。

[0012] 根据本发明的实施方案，所述腺苷酸环化酶激活剂选自Forskolin、NKH 477、dbcAMP中的至少之一。

[0013] 根据本发明的实施方案，所述腺苷酸环化酶激活剂为Forskolin。

[0014] 根据本发明的实施方案，所述ALK5抑制剂选自SB431542、LY2157299、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、RIPK2、CK1δ、MLK‑7K、RepSox、BIBF‑0775、TP0427736HCl、A‑83‑01、SD‑208、TEW‑7197、LDN‑212854、LY 3200882中的至少之一。

[0015] 根据本发明的实施方案，所述ALK5抑制剂选自SB431542、GW788388、BIBF‑0775、A‑83‑01、SD‑208中的至少之一。

[0016] 根据本发明的实施方案，所述ALK5抑制剂为SB431542。

[0017] 根据本发明的实施方案，所述腺苷酸环化酶激活剂的浓度为10‑80μM，优选20‑60μM。在培养基组合物中，腺苷酸环化酶激活剂的浓度在10‑80μM范围内，特别是20‑60μM，能够进一步提升由iPSC分化而来的肝细胞成熟度。

[0018] 根据本发明的实施方案，所述ALK5抑制剂的浓度为5‑50μM，优选5‑25μM。

[0019] 在培养基组合物中，ALK5抑制剂的浓度在5‑50μM范围内，特别是5‑25μM，能够进一步提升由iPSC分化而来的肝细胞成熟度。

[0020] 根据本发明的实施方案，所述生长因子选自HGF、KGF、IGF、EGF、FGF4中的至少之一。

[0021] 根据本发明的实施方案，所述生长因子为HGF。

[0022] 根据本发明的实施方案，所述生长因子浓度为5‑20ng/mL。

[0023] 在培养基组合物中，生长因子浓度为5‑20ng/mL时，能够进一步提升由iPSC分化而来的肝细胞成熟度。

[0024] 根据本发明的实施方案，所述OSM的浓度为10‑50ng/mL。

[0025] 在培养基组合物中，OSM的浓度为10‑50ng/mL L时，能够进一步提升由iPSC分化而来的肝细胞成熟度。

[0026] 根据本发明的实施方案，所述培养基组合物进一步包括氢化可的松琥珀酸盐。

[0027] 根据本发明的实施方案，所述氢化可的松琥珀酸盐为氢化可的松琥珀酸钠。

[0028] 根据本发明的实施方案，所述氢化可的松琥珀酸钠浓度为5‑20μM。

[0029] 根据本发明的实施方案，所述培养基组合物进一步包括基础培养基。

[0030] 根据本发明的实施方案，所述基础培养基选自hepatoZYME‑SFM、RPMI 1640、Williams’E中的至少之一。

[0031] 根据本发明的实施方案，所述基础培养基为hepatoZYME‑SFM。

[0032] 本发明第二方面提供一种制备肝细胞的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括利用多能干细胞诱导分化获得肝母细胞，将所述肝母细胞置于第一方面所述的培养基组合物中培养，以便获得肝细胞。

[0033] 根据本发明制备肝细胞的方法，通过将由多能干细胞诱导分化获得的肝母细胞置于第一方面所述的培养基组合物中进行诱导分化，由iPSC分化而来的肝细胞成熟度有了显著提升。

[0034] 本发明第三方面提供第二方面所述的制备肝细胞的方法制备获得的肝细胞在制备人工肝装置中的用途。

[0035] 本发明第四方面提供一种成熟肝细胞的检测方法。根据本发明的实施方案，所述检测方法包括利用基因编辑技术构建含有ASGR1基因和与所述ASGR1基因共表达的报告基因的载体，将所述载体导入多能干细胞，利用第二方面所述的制备肝细胞的方法制备获得肝细胞，检测所述肝细胞中报告基因的表达，以便检测由所述多能干细胞诱导分化获得的成熟肝细胞的量和比例。

[0036] 为了获得高质量、更为成熟的iHeps，有研究者通过分选获得ASGR1阳性的肝细胞，并发现这类iHeps亚群更接近原代肝细胞，成熟度更好。但是常规方式获得ASGR1阳性细胞需要一抗二抗染色，然后再进行分选或检测，步骤较为繁琐，并且无法实时观测分化细胞群+体中的ASGR1阳性细胞的位置及比例。为了更方便地获得ASGR1细胞亚群，发明人首次利用基因编辑技术(如CRISPR/Cas9)在ASGR1基因中添加报告基因，将含有这两种基因的载体导入多能干细胞，当多能干细胞诱导分化为肝细胞后，报告基因和ASGR1共表达，从而有助于+ +
检测ASGR1肝细胞亚群在分化细胞中的比例。且利用FACS检测或分选ASGR1 细胞群，无需额外的实验操作，细胞消化后可以直接上机检测或分选。利用本发明的检测方法能够实现高通量检测。

[0037] 根据本发明的实施方案，所述报告基因为荧光蛋白报告基因。

[0038] 根据本发明的实施方案，所述报告基因为mCherry报告基因。

[0039] 发明人构建了携带ASGR1和与其共表达的报告基因的iPSC，利用该细胞株，可以通过mCherry荧光来实时观测hiPSC分化效率以及分化效果，这对于优化肝分化方法，以及获得高纯度高质量的iHeps具有重要意义。

[0040] 本发明第五方面提供一种监测由多能干细胞诱导分化获得的肝细胞的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括利用基因编辑技术构建含有ASGR1基因和与所述ASGR1基因共表达的报告基因的载体，将所述载体导入多能干细胞，利用第二方面所述的制备肝细胞的方法制备获得肝细胞，实时监测在由所述肝母细胞诱导分化获得肝细胞过程中ASGR1基因的表达，以便实时监测诱导分化过程中肝细胞的成熟度、ASGR1阳性细胞的位置及比例。

[0041] 根据本发明的实施方案，所述报告基因为mCherry报告基因。mCherry可以在荧光显微镜下直接观察，因此，可以通过实时观测以优化多能干细胞向肝样细胞定向分化的方案。

[0042] 本发明第六方面提供一种筛选多能干细胞诱导分化获得肝细胞的培养基组合物组分的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括利用第四方面所述的检测方法，比较由未添加待测培养基组分和添加待测培养基组分的培养基培养获得的成熟肝细胞的量和比例，所述成熟肝细胞的量的差值和比例的差值中的至少之一高于预定阈值是所述待测培养基组分适于作为由多能干细胞诱导分化获得肝细胞的培养基组合物组分的指示。

[0043] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0044] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0045] 图1显示了采用本发明实施例3中方法将iPSC分化为iHeps(类肝细胞)的过程；

[0046] 图2显示了本发明实施例1中供体质粒和打靶载体的构建过程；

[0047] 图3显示了本发明实施例1中Donor Foxa2的质粒图谱；

[0048] 图4显示了本发明实施例1中打靶载体ASGR1 CRISPR‑Cas9的质粒图谱；

[0049] 图5显示了本发明实施例2中通过Junction PCR筛选目的克隆的电泳结果；

[0050] 图6显示了本发明实施例2中PKID‑CRE的线性图谱；

[0051] 图7显示了本发明实施例2中筛选去除抗性基因的目的克隆的电泳结果；

[0052] 图8显示了本发明实施例3中由hiPSCs分化成iHeps的荧光显微镜观察结果；

[0053] 图9显示了本发明实施例4中由hiPSCs分化成的iHeps中成熟肝细胞marker，CYP3A4、ALB、CYP2C19、HNF4α鉴定结果；

[0054] 图10显示了本发明实施例5中ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂提升了iPSC分化+而来的肝细胞成熟度的影响，图A显示了AGSR1 细胞比例，图B显示了ALB分泌量，图中S3代表第三阶段分化培养基中未加Forskolin和SB431542的对照组，S3+FS代表添加了Forskolin和SB431542的的实验组。

具体实施方式

[0055] 下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

[0056] 实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。

[0057] 此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

[0058] 培养基组合物

[0059] 在本发明中，培养基组合物是指用于配制培养基时所用到的组合物。根据本发明的一个实施方案，培养基组合物包括：腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM。培养基组合物除了含有腺苷酸环化酶激活剂、ALK5抑制剂、生长因子、OSM之外，也可以含有其他的组分，但这四种组分是培养基组合物中必须含有的。

[0060] 根据本发明的一个实施方案，腺苷酸环化酶激活剂选自Forskolin、NKH 477、PACAP1‑27、PACAP 1‑38、dbcAMP中的至少之一，即腺苷酸环化酶激活剂可以是Forskolin、NKH477、PACAP 1‑27、PACAP 1‑38、dbcAMP中的任一种或两种或两种以上。

[0061] 根据本发明的一个实施方案，腺苷酸环化酶激活剂的浓度为10‑80μM。

[0062] 根据本发明的一个优选的实施方案，腺苷酸环化酶激活剂为Forskolin，浓度为20‑60μM。

[0063] 根据本发明的一个实施方案，所述ALK5抑制剂包括但不限于SB431542、Galunisertib(LY2157299)、LY2109761、，SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、RIPK2、CK1δ、MLK‑7K、RepSox(E‑616452)、BIBF‑0775、TP0427736 HCl、A‑83‑01、SD‑208、Vactosertib(TEW‑7197)、LDN‑212854、LY 3200882中的至少之一，即ALK5抑制剂可以是其中的任一种或两种或两种以上。

[0064] 根据本发明的一个实施方案，ALK5抑制剂的浓度为5‑50μM。

[0065] 根据本发明的一个优选的实施方案，ALK5抑制剂为SB431542，浓度为5‑25μM。

[0066] 根据本发明的一个实施方案，生长因子选自HGF、KGF、IGF、EGF、FGF4中的至少之一。

[0067] 诱导培养基中的生长因子可以包括KGF、IGF、EGF、FGF4中的一种或多种。在一些实施方案中，生长因子如KGF可以添加到诱导内胚层细胞向肝母细胞分化的培养基中。在一些实施方案中，生长因子如EGF可以任选地添加到诱导肝母细胞向肝细胞分化的培养基中。

[0068] 根据本发明的一个实施方案，OSM(制瘤素M)的浓度为10‑50ng/mL。

[0069] 根据本发明的一个实施方案，培养基组合物进一步包括氢化可的松琥珀酸盐，氢化可的松琥珀酸盐可以为氢化可的松琥珀酸钠，如氢化可的松21‑琥珀酸钠(HCC)，氢化可的松琥珀酸钠浓度为5‑20μM。根据本发明一个实施例的培养基组合物中含有的基础培养基可以是hepatoZYME‑SFM、RPMI 1640、Williams’E中的至少之一，优选hepatoZYME‑SFM。

[0070] 诱导的多能干细胞

[0071] 根据本发明一个实施例的诱导的多能干细胞(iPSC)是指通过人工方式来源于非多能细胞的多能干细胞类型。

[0072] 作为肝细胞来源的诱导的多能干细胞可以通过诱导获得自哺乳动物如任何哺乳动物(例如，牛、牛、猪、犬、猫、马、灵长类动物)、优选人的部分或完全分化的细胞，得到诱导的多能干细胞。来源包括骨髓、成纤维细胞、胎儿组织(例如，胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。在优选的实施方案中，诱导的多能干细胞获得自诱导的成纤维细胞、脂肪来源的干细胞、神经干细胞或来自尿液或外周血的细胞。在更优选的实施方案中，诱导的多能干细胞获得自尿液或外周血细胞。然而，iPSC可以获得自其他细胞类型，包括但不限于：多能干细胞、血液来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞、和结缔组织细胞。iPSC可以获得自从哺乳动物受试者得到的样品。受试者可以是任何哺乳动物(例如，牛、牛、猪、犬、猫、马、灵长类动物)，包括人。细胞的样品可以获得自多种不同来源中的任一种，包括骨髓、肝脏、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。

[0073] 在优选的实施方案中，诱导的多能干细胞获得自尿液或血液来源的细胞。在更优选的实施方案中，诱导的多能干细胞获得自外周血来源的细胞。

[0074] 可以通过使用本领域技术人员已知的技术将充当细胞来源的适当的器官或组织分解来分离细胞。例如，可以将组织或器官机械分解和/或用消化酶和/或削弱相邻细胞之间连接的螯合剂处理，从而可以将组织分散以形成个体细胞的悬浮液，而没有可察觉的细胞损坏。可以通过将组织切碎并且用一种或多种酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等处理切碎的组织来完成酶解离。也可以通过多种方法完成机械破坏，包括但不限于使用粉碎机、搅拌机、筛、均化器、压力盒(pressure cell)、或声波器(insonator)。

[0075] 报告基因

[0076] 根据本发明的一个实施方案，本发明提供的报告基因包括但不限于荧光蛋白基因、细胞表面抗原、荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β‑半乳糖苷酶基因、分泌性人胎盘碱性磷酸酶基因、PET报告基因等。本发明提供的报告基因可以是mCherry报告基因。例如，通过给ASGR1基因添加荧光蛋白报告基因mCherry，使得多能干细胞分化为肝细胞后，+ +mCherry和ASGR1共表达，这样可非常真实方便地找到并定位ASGR1细胞，观测和检测ASGR1肝细胞亚群在分化细胞中的比例；利用FACS检测或分选ASGR1细胞群，无需额外的实验操作，细胞消化后可以直接上机检测；mCherry可以在荧光显微镜下直接观察，因此，可以通过实时观测以优化多能干细胞向肝样细胞定向分化的方案。

[0077] 基因打靶

[0078] 常规基因打靶技术由于需要相对复杂的载体构建以实现同源重组以及正负筛选的低效性(一千个抗药性细胞克隆只有一个正确整合)导致这项技术发展局限在某几个的实验室。而后，科学家发现断裂的基因可以提高同源重组效率1000倍以上，这极大鼓励了研究者通过定制化的核酸酶进行高效同源重组。定制化的核酸酶如ZFN，TALEN和CRISPR系统极大推动了基因修饰转向基因编辑发展。CRISPR/Cas9系统是利用原核生物的免疫防御机制而仿生创造出来通过可以自由定制的20个碱基对的引导RNA(gRNA)来识别基因组中任意序列，相对于ZFN和TALEN需要合成一个新的蛋白质来识别序列，CRISPR/Cas9极大的简化了核酸酶的构建过程，目前也是最广泛被应用的基因编辑核酸酶。根据本发明的一个实施方案，利用CRISPR/Cas9和重组技术在ASGR1基因中添加报告基因，将含有这两种基因的载体导入多能干细胞，当多能干细胞诱导分化为肝细胞后，报告基因和ASGR1共表达，从而有助于检测ASGR1+肝细胞亚群在分化细胞中的比例。

[0079] 诱导分化

[0080] 可以通过在足够的时间段内在含有诱导培养基在中提供诱导多能干细胞(iPSCs)(例如诱导人多能干细胞(hiPSCs))以将细胞诱导为肝脏细胞。使iPSCs与含有有效诱导和/或增强iPSCs分化为肝脏细胞量的诱导剂的培养基接触足够的时间，将所述细胞诱导分化为肝脏细胞。

[0081] 在本发明的一个实施方案中，iPSC分化为iHeps的过程分为三个阶段。如附图1展示：1)第一阶段，培养基中培养iPSC细胞，在培养的1‑2天将iPSC分化为终末内胚层(Definitive endoderm(DE))；2)第二阶段，在诱导分化的第3‑9天将DE诱导为肝母细胞(hepatoblast)；3)在诱导分化的第10‑23天，将肝母细胞诱导分化为iHeps。

[0082] 细胞的分离

[0083] 通过从培养源中提取(例如，通过密度梯度离心和/或流式细胞仪)，可以得到基本上纯化的肝脏细胞群体。纯度可以通过任何适当的方法进行测量。例如，通过流式细胞仪(例如，FACS分析)，可以将肝脏细胞99％‑100％纯化。例如，通过使用与肝脏细胞上的标记结合的分子(例如，抗体、抗体衍生物、配体或Fc‑肽融合分子)并且从而对结合分子的细胞进行阳性选择(即，阳性选择)，可以将肝脏细胞分离。阳性选择方法的其他实例包括优先促进在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的希望的细胞类型的生长的方法。备选地，通过使用与在希望的细胞类型上不存在、但是在不希望的细胞类型上存在的标记结合的分子，可以从希望的细胞中移除含有这样的标记的不希望的细胞(即，阴性选择)。其他阴性选择方法包括优先杀伤在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的不希望的细胞类型或抑制其生长。因此，通过使用阴性选择、阳性选择、或它们的组合，可以制备干细胞的富集群体。

[0084] 人多能干细胞(hPSC)来源的肝细胞与原代成人肝细胞相比仍有差距，这类细胞更准确地被认为是“肝细胞样细胞”(HLC)。与成人肝细胞不同，HLC通常仍有胎儿肝细胞标志物甲胎蛋白(AFP)的表达，并且在解读功能上尚不及成熟肝细胞。这主要是分化细胞的异质性导致的。为了获得成熟度更高一些的HLC，需要特定的方法分离HLC群体中的某些成熟度高的细胞。ASGR1长期以来一直被认为是肝脏表面标志物(Ashwell和Morell，1974年；Schwartz等人，1981年)，可用于纯化hPSC衍生的HLC(Basma等，2009)。ASGR1作为肝细胞身份标志物的效用已经确立，在hPSC衍生的HLC中表达ASGR1的细胞亚群比未纯化的细胞更类+ +
似于成熟的肝细胞。现有技术无法实时观测ASGR1亚群的比例，若要获得ASGR1 细胞比例的结果需要经过一抗二抗孵育，耗时耗力，且会产生一些非特异性的结合，并不能完全真实反应实际情况，因此这种方式并不适合定向分化方法的优化。本发明首次利用基因编辑(如CRISPR/Cas9)和重组技术在ASGR1基因中添加报告基因，将含有这两种基因的载体导入多能干细胞，当多能干细胞诱导分化为肝细胞后，报告基因和ASGR1共表达，从而有助于检测+ +
ASGR1肝细胞亚群在分化细胞中的比例。且利用FACS检测或分选ASGR1 细胞群，无需额外的实验操作，细胞消化后可以直接上机检测或分选。利用本发明的检测方法能够实现高通量检测。

[0085] 在本发明的一个实施方案中，利用报告基因如mCherry定位、分析ASGR1+的肝细胞，具体来讲，通过报告基因的荧光检测报告基因的表达，可以确认贴壁细胞群体中ASGR1+ +阳性细胞的位置，也可以在细胞消化后检测ASGR1 细胞的比例，或分选ASGR1 细胞。在本发明一个实施方案中通过检测mCherry表达，比如通过免疫荧光或FACS的方法，可以定位，检+
测或者分选ASGR1细胞。

[0086] 细胞的培养和保存

[0087] 可以将细胞在培养物中储存以用于以后的回收和使用。根据已知方法，如在Doyle等，(eds.)，1995，Cell&Tissue Culture：Laboratory Procedures(细胞&组织培养：实验室操作)，John Wiley&Sons，Chichester中描述的那些，可以将细胞低温保存以进行储存。例如，可以将细胞在“冷冻培养基”中悬浮，如含有15‑20％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜6
(DMSO)的培养基，其具有或不具有5‑10％甘油，密度为例如约4‑10x 10  细胞/ml。将细胞分配至玻璃或塑料瓶中，之后将其密封并且转移至可编程或被动冰箱的冷冻室。可以通过经验确定冷冻的最佳速率。例如，可以使用通过熔化热提供‑1℃/min的温度变化的冷冻程序。一旦含有细胞的瓶达到‑80℃，即将它们转移至液氮存储区域。可以将低温保存的细胞储存数年的时间段。

[0088] 在本发明的说明书和附图中，“Larm”和“LHA”可进行同等替换，均是指左侧同源臂；“Rarm”和“RHA”可进行同等替换，均是指右侧同源臂。

[0089] 下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0090] 实施例1 sgRNA序列及供体质粒构建

[0091] 供体质粒(Donor construct)设计见图2。供体质粒包括LHA‑P2A‑mCherry‑loxP‑PGK‑PuroR‑loxP‑RHA；其中LHA为左侧同源臂，P2A为一种自剪切2A肽，mCherry为一种荧光蛋白，loxP为loxP位点，PGK为磷酸甘油酸酯激酶基因来源的哺乳动物启动子，PuroR为嘌呤霉素(puromycin)抗性基因pac，RHA为右侧同源臂。

[0092] 根据图2设计载体，在ASGR1终止密码子前插入P2A‑mCherry‑loxP‑PGK‑PuroR‑loxP表达框，设计过程如下：设计左右臂(LHA、RHA)引物ASGR1‑LARM‑PF：CTGgaattcCTCCACGTGAAGCAGTTCGT，如SEQ  ID  NO:1所示；ASGR1‑LARM‑PR:
GCGgctagcAAGGAGAGGTGGCTCCTGGCTG，如SEQ ID NO:2所示，ASGR1‑RARM‑PF:GTGgctagcGTCggcgcgccTTTATTTCTTCAATGCCTCGACCTGC，如SEQ ID NO:3所示；ASGR1‑RARM‑PR:
GTGaagcttCACTCAACAAATTCGGGTGGT，如SEQ ID NO:4所示(LARM表示左臂，RARM表示右臂)，以ASGR1基因为模板，克隆出EcoRI‑LARM‑BmtI，AscI‑RARM‑HindIII两个片段，BmtI‑P2A‑mCherry‑loxP‑PuroR‑cassette‑loxp‑AscI来自于已构建的载体Donor Foxa2(质粒图谱如图3所示)，将三个片段酶切后连接到经酶切的EcoRI‑PMD18‑T‑HindIII片段上就构建成ASGR1供体载体(Donor construct)。

[0093] 在http://crispor.tefor.net/上，针对ASGR1基因设计目的位点sgRNA序列GAAGAAATAAATTAAAGGAG，如SEQ  ID  NO:5所示；合成引物ASGPR‑g1‑top：caccGAAGAAATAAATTAAAGGAG，如SEQ  ID  NO:6所示；ASGPR‑g1‑bottom:
aaacCTCCTTTAATTTATTTCTTC，如SEQ ID NO:7所示克隆到pSpCas9(BB)‑2A‑GFP(PX458)(Addgene plasmid#48138)构建打靶载体ASGR1 CRISPR‑Cas9。打靶载体结构如附图4。

[0094] ASGR1‑LARM的核酸序列如SEQ ID NO:8所示，具体如下：

[0095] ctccacgtgaagcagttcgtgtctgacctgcggagcctgagctgtcagatggcggcgctccagggcaatggtaaggaggccagcccggcccgctctctgcctccccccttctctgggcagcgcttagcccctgcgccccgtttctcccgctcaggctcagaaaggacctgctgcccggtcaactgggtggagcacgagcgcagctgctactggttctctcgctccgggaaggcctgggctgacgccgacaactactgccggctggaggacgcgcacctggtggtggtcacgtcctgggaggagcaggtgaggacccggagggtctgggaggctggctggcctcggagagatcaccacccgccttctctctcctcagaaatttgtccagcaccacataggccctgtgaacacctggatgggcctccacgaccaaaacgggccctggaagtgggtggacgggacggactacgagacgggcttcaagtgagtgcgcgccctccctcggcctgggtccggccgccttcgcgccctggggccctgggctgaggagtctggagcgacccgcctgcggatccgacctcctggggcccacagctggctctgtccccaggaactggaggccggagcagccggacgactggtacggccacgggctcggaggaggcgaggactgtgcccacttcaccgacgacggccgctggaacgacgacgtctgccagaggccctaccgctgggtctgcgagacagagctggacaaggccagccaggagccacctctcctt

[0096] ASGR1‑RARM的核酸序列如SEQ ID NO:9所示，具体如下：

[0097] tttatttcttcaatgcctcgacctgccgcaggggtccgggattgggaatccgcccatctgggggcctcttctgctttctcgggaattttcatctaggattttaagggaaggggaaggatagggtgatgttccgaaggtgaggagcttgaaacccgtggcgctttctgcagtttgcaggttatcattgtgaactttttttttttaagagtaaaaagaaatatacctaaaccttctgttagttgtctggttattggggattcggaagcaggagtgggctggttggcattacgaagccttagcgggtgctgtggcatcatgagaactgtgtgggctttgggccagaatggccagactttgttatttacagatacgtgagtttgggcaaattattgttctctgtgtcccagctgtaaacaagccatcttactggaggccatcctacttggagcaatacccccaggaggagaactacccgaattttttttttgtaagatggagtcttgctctgttgcccaggctggaatgcaatggcacgatctcagctcactgcaacctctgccccccgggttcaagtgattctcctgcctcagcctcccgagtacctgagatcacaggagtgcaccatcacgcccggctaatttttgtatttttagtagagaccgggtttcaccattgttggccaggctggcctcgaattcctgacctcaagtgatctgcccccctcggcttcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgcccccggcagaaccacccgaatttgttgagtg

[0098] P2A的核酸序列如SEQ ID NO:10所示，具体如下：

[0099] gccactaacttctccctgttgaaacaagcaggggatgtcgaagagaatcccgggcca

[0100] mCherry的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，具体如下：atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa

[0101] loxp‑PGK‑PuroR‑loxp的核酸序列如SEQ ID NO:12所示，具体如下：

[0102] ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattaggtctgaagaggagtttacgtccagccaagcttaggatctcgacctcgaaattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcatccatctagatctcgagcagctgaagcttaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccacaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgacgcccgccccacgacccgcagcgcccgaccgaaaggagcgcacgaccccatgcatcgatgatatcagatccccgggatgcagaaattgatgatctattaaacaataaagatgtccactaaaatggaagtttttcctgtcatactttgttaagaagggtgagaacagagtacctacattttgaatggaaggattggagctacgggggtgggggtggggtgggattagataaatgcctgctctttactgaaggctctttactattgctttatgataatgtttcatagttggatatcataatttaaacaagcaaaaccaaattaagggccagctcattcctcccactcatgatctatagatctatagatctctcgtgggatcattgtttttctcttgattcccactttgtggttctaagtactgtggtttccaaatgtgtcagtttcatagcctgaagaacgagatcagcagcctctgttccacatacacttcattctcagtattgttttgccaagttctaattccatcagaagctggtcgagatccggaacccttaatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat

[0103] 实施例2 ASGR1‑mCherry细胞株构建

[0104] 1)第一步筛选

[0105] 将2.5ug ASGR1打靶载体与2.5ug ASGR1 CRISPR‑Cas9载体通过核转染转到80万hiPSC中，铺板到6孔板一个孔中。Day 4开始加入0.05‑1mg/ml嘌呤霉素(puromycin)处理，直到99％的细胞都死亡，Day 5撤掉puromycin换mTeSR1培养基，等克隆长到合适大小进行鉴定，鉴定引物F1/R1:AGACGGGCTTCAAGTGAGTG(如SEQ  ID  NO:13所示)/CCTGCTTCCGAATCCCCAAT(如SEQ ID NO:14所示)，F2/R2:GGATGTAGGGCTGACCTCGTT(如SEQ ID NO:15所示)/ACAGCTTCAAGTAGTCGGGG(如SEQ  ID  NO:16所示)，F3/R3:
GGTGCATGACCCGCAAGCCC(如SEQ ID NO:17所示)/TTTGTTGCTTCTGTTCCGCAG(如SEQ ID NO:18所示)。如图5，通过Junction PCR筛选目的克隆，选择两个等位基因(allele)都被修饰的20号单细胞来源的克隆进行下一步筛选。

[0106] 2)Cre重组酶切除药筛标记筛选

[0107] 通过瞬转Cre酶表达质粒PKID‑CRE(CIB)(质粒线性图谱如附图6所示)到第一步筛选出来的克隆20#里面，然后通过引物F3/R3，F4/R4:AAGGGCGAGATCAAGCAGAG(如SEQ ID NO:19所示)/TTTGTTGCTTCTGTTCCGCAG(如SEQ ID NO:20所示)筛选出两个等位基因都切除掉Puromycin抗性基因的目的克隆(PKID‑CRE能够切除Puromycin抗性基因(也即图2中的PuroR))，即F3/R3阴性，F4/R4阳性的克隆。如图7中的20#‑5#，20#‑8#，20#‑13#为目的克隆。

[0108] 实施例3类肝细胞(iHeps)分化

[0109] 本实施例通过三阶段将实施例2获得的hiPSCs(20#‑13#)分化成iHeps。1)第一阶段利用RPMI1640+Activin A(100ng/mL)和WNT3α(20ng/mL)处理hiPSC 24小时(Day 0)，之后2天使用不含WNT3α的第一阶段培养基(Day1‑Day2)。这样三天就能诱导生成Definitive endoderm(DE)。2)第二阶段是将DE诱导为hepatoblasts，这一阶段使用第二阶段培养基培养day3至day9，第二阶段培养基组成：80％knockout DMEM(KO‑DMEM)，20％knockout serum replacement(KSR)，0.5％GlutaMAX，1％非必需氨基酸(NEAA)，0.1mMβ‑巯基乙醇(beta‑mercaptoethanol)和1％DMSO。3)随后，在Day10开始更换第三阶段培养基S3培养7天或以上。S3培养基含有hepatoZYME‑SFM，1％GlutaMAX，10μMhydrocortisone 21‑hemisuccinate sodium salt(HCC)，20.0ng/mL HGF和20ng/mL OSM(oncostatin M)，Forskolin 20.0μM，SB431542 5.0μM。第三个阶段后，iHeps中相对成熟肝细胞群体会表达ASGR1，且mCherry同步表达，通过红色荧光可以直观看到ASGR1的表达情况(如图8)。

[0110] 实施例4 ASGR1‑mCherry iHeps的鉴定

[0111] 本实施例通过免疫荧光鉴定ASGR1‑mCherry细胞株分化的iHeps。

[0112] 将实施例3中分化获得的iHeps分成四个相同待测样品，分别通过4％多聚甲醛室温固定10min，之后用0.5％的PBST洗三遍。分别孵育一抗CYP3A4、ALB、CYP2C19、HNF4α、4℃过夜。第二天用PBST洗三遍后孵育对应绿色荧光二抗，最后将DAPI加入样品中进行孵育。

[0113] 四种成熟肝细胞marker，CYP3A4、ALB、CYP2C19及肝细胞特异的肝细胞核因子HNF4α鉴定结果如图9所示。表明采用实施例3中方法成功将hiPSCs诱导分化成iHeps，且由于iHeps中相对成熟肝细胞群体会表达ASGR1，图9中大量的红色荧光(mCherry)和绿色荧光表明采用本发明的诱导分化方法能够大大提升iPSC分化而来的肝细胞成熟度。

[0114] 实施例5 ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂提升了iPSC分化而来的肝细胞成熟度

[0115] 为了验证本发明中培养基组成对iPSC诱导分化获得肝细胞成熟度的影响，按照实施例3中类肝细胞分化的相同方法，将在第三阶段(iHeps诱导成熟阶段)的培养基中去除ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂的培养基作为对照，其他分化过程与实施例3中完全相同，比较对照组和实施例3中实验组，从而确定ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂对iPSC诱+导分化获得的肝细胞成熟度的影响，FACS测得的AGSR1 细胞比例和ELISA测得细胞培养上清中ALB分泌量比较结果参见附图10中的A图和B图，图中S3代表未添加ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂的对照组，S3+FS代表添加了ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂的实验组(采用实施例3诱导分化方法)。

[0116] 附图10中的A图和B图表明，添加ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂后，由iPSC诱+导分化而来的HLC成熟度提升，表现为群体中ASGR1亚群比例提升，分泌的ALB水平提升。

[0117] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0118] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。