玉米ZmBES1/BZR1-9基因在培育早花植物中的应用

摘要

本发明公开了一种玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在培育早花植物中的应用，属于基因工程领域，本发明明确了玉米ZmBES1/BZR1‑9基因与植物开花时间的关系，验证玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在促进植物提前开花中的作用。玉米ZmBES1/BZR1‑9基因具有促进植物提前开花的作用，可以用于培育早花植物。玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在促进植物发育领域，特别是促进植物提前开花领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

权利要求

1.玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在培育早花植物中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种培育早花植物的方法，其特征在于，上调玉米ZmBES1/BZR1‑9基因的表达，以获得早花的植株，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上调玉米ZmBES1/BZR1‑9基因的表达包括：设计ZmBES1/BZR1‑9基因的扩增引物进行该基因的PCR扩增，利用扩增产物和植物表达载体构建包含ZmBES1/BZR1‑9基因的重组质粒，利用农杆菌介导将重组质粒转入植物中，进行ZmBES1/BZR1‑9基因过量表达，即获得早花植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ZmBES1/BZR1‑9基因的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2‑3所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组质粒为35S‑ZmBES1/BZR1‑9‑eGFP。

说明书

玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在培育早花植物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在培育早花植物中的应用。

背景技术

[0002] 玉米(Zea mays)是继小麦和水稻之后我国第三大主粮作物，是重要的粮食、经济和饲料作物，在整个国民经济中占有举足轻重的地位。其起源可追溯至9000年前生长于墨西哥西部的大刍草(Zea mays subspecies parviglumis)。大刍草作为一个热带物种，表现出严格的光周期敏感性，需要短日(SD)条件(日照长度小于13小时)才能开花。然而，现代玉米栽培种在世界上广阔的纬度范围内分布并显示出日中性植物的特点，这得益于开花对于光周期敏感性要求的降低，以此适应了长日照环境以及不同的纬度。但是，依然有一些热带玉米品种在温带地区呈现出晚花甚至不开花的表型，这在一定程度上限制了玉米种质资源的利用。

[0003] 现今，对于植物开花早晚的调控主要采用种质管理的方法，如温度管理、肥水管理等，但是种植管理的方法调控效果有限且存在不确定性。而基因定点改良植物，则可以大幅度提高调控的成功率及效果。

[0004] BES1/BZR1是BR信号通路中的核心转录因子，在植物生长发育及逆境应答中发挥着重要作用。目前，BES1/BZR1的调控机制在模式生物拟南芥和单子叶植物水稻中得到了很好的阐释。在玉米中，除个别BR合成基因及受体编码基因功能被鉴定外，鲜有ZmBES1/BZR1基因的研究报道，并且玉米基因组的复杂性很可能导致ZmBES1/BZR1基因家族成员的进化和功能多样化。玉米中有10个ZmBES1/BZR1基因家族成员，其中ZmBES1/BZR1‑5调控逆境应答及种子大小，但是其余成员的功能及应用前景未知。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在培育早花植物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在玉米幼苗叶片中分离获得ZmBES1/BZR1‑9基因，通过该基因在植物中的过表达，明确了玉米ZmBES1/BZR1‑9基因与植物开花时间的关系，验证玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在促进植物提前开花中的作用。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供一种玉米ZmBES1/BZR1‑9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0008] 本发明还提供如上所述的玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在培育早花植物中的应用。

[0009] 本发明还提供一种培育早花植物的方法，上调植物中如上所述的玉米ZmBES1/BZR1‑9基因的表达，以获得早花的植株。

[0010] 进一步地，所述方法中上调植物中玉米ZmBES1/BZR1‑9基因的表达包括：设计ZmBES1/BZR1‑9基因的扩增引物进行该基因的PCR扩增，利用扩增产物和植物表达载体构建包含ZmBES1/BZR1‑9基因的重组质粒，利用农杆菌介导将重组质粒转入植物中，进行ZmBES1/BZR1‑9基因过量表达，即可获得早花植物。

[0011] 进一步地，所述ZmBES1/BZR1‑9基因的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2‑3所示。

[0012] 进一步地，所述重组质粒为35S‑ZmBES1/BZR1‑9‑eGFP。

[0013] 本发明公开了以下技术效果：

[0014] (1)本发明明确了玉米ZmBES1/BZR1‑9基因与植物花期的关系，验证了玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在促进植物提前开花方面的重要性。

[0015] (2)本发明提供玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在促进植物提前开花中的应用，可以用于培育早花植物。玉米ZmBES1/BZR1‑9基因在促进植物发育领域，特别是促进植物提前开花领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0017] 图1为转基因拟南芥株系检测；其中，M为DNA标准品；WT为未转基因的野生型拟南芥；Mu为未转基因的bes1‑D突变体；W9‑2和W9‑3为ZmBES1/BZR1‑9基因转化拟南芥野生型的过表达株系；B9‑3和B9‑5为ZmBES1/BZR1‑9基因转化拟南芥突变体的互补株系；

[0018] 图2为ZmBES1/BZR1‑9基因转化拟南芥突变体株系早花表型；其中，(a)各株系开花表型；(b)种子萌发至开花所需天数统计分析；WT为未转基因的野生型拟南芥；bes1‑D为未转基因的突变体；B9‑3和B9‑5为ZmBES1/BZR1‑9基因转化拟南芥突变体的互补株系；

[0019] 图3为ZmBES1/BZR1‑9基因转化拟南芥野生型株系早花表型；其中，(a)各株系开花表型；(b)种子萌发至开花所需天数统计分析；WT为未转基因的野生型拟南芥；W9‑2和W9‑3为ZmBES1/BZR1‑9基因转化拟南芥野生型的过表达株系；

[0020] 图4为转基因水稻株系检测；其中，M为DNA标准品；WT为未转基因的野生型；OE‑1和OE‑2为ZmBES1/BZR1‑9基因转化水稻的过表达株系；

[0021] 图5为ZmBES1/BZR1‑9基因转化水稻株系的早花表型；其中，(a)各株系开花表型；(b)移栽至抽穗所需天数统计分析；WT为未转基因的野生型水稻；OE‑1和OE‑2为ZmBES1/BZR1‑9基因转化水稻的过表达株系。

具体实施方式

[0022] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0023] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0024] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0025] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0026] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0027] 实施例1目的基因克隆

[0028] 取五叶期玉米幼苗叶片，液氮速冻研磨，使用总RNA提取试剂盒Trizol(TaKaRa)并TM按照其说明书提取总RNA。用PrimeScript  RT regeant Kit试剂盒(Takara公司)，以总RNA为模板进行cDNA的合成。

[0029] 利用Primer Premier 5.0软件和NCBI网站上的在线工具Primer‑BLAST设计ZmBES1/BZR1‑9基因(SEQ ID No.1)的扩增引物，具体序列(SEQ ID No.2‑3)如表1所示：

[0030] 表1 ZmBES1/BZR1‑9基因的扩增引物序列

[0031]

[0032] 按表2所示反应体系加样，进行扩增。温度循环程序为：94℃3min；98℃10s，最适退火温度72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保持。

[0033] 表2 PCR扩增反应体系

[0034]

[0035] SEQ ID No.1：

[0036] ATGAACGGGGGAGAAGGAGAAGGAGGAGGAGCGGGAAGCGGGGCGGCAGCCGGCGGGGCCGGGGCCGGGACACCGCGGGTGCCGACGTGGAGGGAGCGCGAGAACAACCGGCGGCGGGAGCGCCGGCGCCGCGCGATCGCGTCCAAGATCTTCACCGGCCTGCGCGCCCACGGCAACTACGCTCTCCGCAGGCACTGCGACAACAACGACGTGCTCAAGGCGCTGTGCGAGGAGGCCGGCTGGACCGTGGAGCCCGACGGCACCACCTACCGCAAGGGATGCAAGCCTCCGGGCAGCAGAGATCCATATACGGCTGCCTTTATCCCCGGCGGCATGGTGTCCTGCCCGGTGAGTCCGCGAGCTTACAACGGCCTCAGCTACCCGTCGTCGCCCTCCCACGTCGGCGGCAGAGGCAGCAGCTTCTTCTACGGCGGTGCGGGCAGCAGCCGCGGCGTTGTCATTGGCGGAGGCGTAGGCGGACTCCCGTGGCTCAACAACCTGTCCCGCTACTCCGACGACGCCTCGTACGCCGACGACTACTCCTTCAGCGCGCCGGTCACGCCGCAGAACGGCTCCCCGCCGCGGCGCAAGATGGCGCGCTGGGCGTCGGGCAACGCCGCCGCCGGCTCCAACGTGCAGTCGCCGTGGGCCGCCAGCCCTGGCCCCAGCCGCTACGCCTCCCTGCCAGTAACCATGCCGCATACCCCTGTCCACGGCGAGGCCGTGGCGGCCGACCCGGTGAGCCTGCTCACGGGGCTGCAGATATCCGCCGCCGCGGCCAACAAGCCACCGGCGTACAGCATGTTCGACTTCGACGCCGGGAGCTACTCGTCGAGGCCTGGGCAGAGCAGCGACGGGGCGGCATGGGCGGCGGCATCGTCTCGTGGCGCCGCCGGCGACGGTGACGCACAGGTGGCCCCGCACGGGTTCTCCTTCGGCTGGAGCGGCGGGCCGGCGTTCAGCGCGTGGGAGGGGGAGAAGGCGAGCGTGGCGTTCAACGCGTGGGAGGGGGAGAAGGCGAGCGGGGCGTTCAGCGCGTGGGAGGGGGAGAAGGTGAGCGACGAGTACGTCGACGAGGGCGACCTGGAGCTCACCCTGGGGAACTCGAGGGCCGGCGCCGGCGCTGACCGCGCTTGA

[0037] 实施例2目的基因达载体构建

[0038] 拟南芥和水稻转化分别用表达载体pCAMBIA2300‑35S‑eGFP和pCAMBIA1300‑35S‑eGFP，根据表达载体及ZmBES1/BZR1‑9基因序列，利用CE DesignV1.04软件设计引物，分别加入限制性酶切位点(表3)，由上海生物工程有限公司合成。

[0039] 表3构建表达载体的扩增引物

[0040]

[0041] 分别对PCR回收产物、pCAMBIA2300和pCAMBIA1300质粒进行双酶切，按表4反应体系进行加样。将酶切体系混匀，最适酶切反应温度酶切30min，酶切产物加入上样缓冲液后，直接电泳，回收酶切产物，按表5进行酶切片段连接。

[0042] 表4双酶切体系

[0043]

[0044] 表5连接反应体系

[0045]

[0046] 连接产物转化大肠杆菌，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定之后，组质粒菌液送测序公司进行DNA的序列测序鉴定，经测序正确的质粒将于下一步拟南芥和水稻转化。

[0047] 实施例3拟南芥转化及开花表型分析

[0048] 用农杆菌介导的花絮浸染法将pCAMBIA2300‑35S‑ZmBES1/BZR1‑9‑eGFP载体转化拟南芥突变体bes1‑D和野生型Col‑0。

[0049] 1、花序浸染法转化

[0050] (1)取含有重组质粒的农杆菌，在含有卡那霉素(Kana)和利福平(Rif)的YEP平板上划线，28℃培养2～3d。

[0051] (2)挑取农杆菌单菌落接种在3mL含Kana和Rif的YEP液体培养基中，28℃，200r/min，振荡过夜培养。

[0052] (3)在100mL液体YEP培养基中(含Kana和Rif)，接种1mL过夜培养的起始农杆菌菌液，28℃振荡培养至菌液OD600值为0.6～0.8。

[0053] (4)4℃5000r/min离心10min收集细胞，用5％蔗糖溶液悬浮菌体并调OD600值至0.8～1.0，按0.01％～0.02％的比例加入表面活性剂silwetL‑77。

[0054] (5)用拟南芥专用营养土盆栽培养拟南芥突变体bes1‑D和野生型Col‑0幼苗，开花后修剪已形成果荚和已经开放的花，用上述浸染液浸泡花序1.5～2.0min，黑暗培养10h。

[0055] (6)在适宜的条件下培养3～4周，收集种子，进行下一步筛选处理。

[0056] 2、抗性培养基筛选

[0057] (1)将收获的侵染后种子，分装至1.5mL的EP管，用500μL的70％酒精浸泡30s。

[0058] (2)吸掉酒精后，用500μL的10％NaClO浸泡5～10min，期间不断摇晃离心管以至种子与NaClO充分接触。

[0059] (3)用灭菌水清洗种子4～6次，待种子沉下后，弃上层ddH2O；200μL的0.1％琼脂水悬浮种子。

[0060] (4)将种子点播至含50mg/L Kana的1/2MS培养基中培养。

[0061] (5)重复上述步骤，收获转化的拟南芥T2代种子消毒后，播种于含有Kana的1/2MS固体培养基上，全部为绿色健壮的植株即为纯合转化体，而非纯和转化体则表现为3:1的分离(正常生长和黄化死亡植株的比例)，纯合转基因株系种子用作进一步分析。

[0062] 3、PCR鉴定

[0063] (1)取纯合转基因株系新鲜组织100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNase A(10mg/mL)，漩涡振荡1min，室温放置10min。

[0064] (2)加入130μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中。

[0065] (3)可选步骤：将上清液再次12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中。

[0066] (4)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。12000r/min离心2min，弃上清，保留沉淀。

[0067] (5)加入600μL75％乙醇，涡旋振荡5s，12000r/min离心2min，弃上清。

[0068] (6)重复步骤(5)。

[0069] (7)开盖倒置，室温5～10min，彻底晾干残余的乙醇。

[0070] (8)加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴10～60min溶解DNA，期间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。

[0071] (9)使用PCR扩增引物见表1，以提取的基因组DNA为模板进行PCR检测，程序为94℃，3min；94℃30s，最适退火温度30s，72℃60s/kb，35个循环；72℃5min；4℃保存。

[0072] 3、转基因株系表型鉴定

[0073] 将转化ZmBES1/BZR1‑9基因的拟南芥株系、野生型、突变体bes1‑D株系种子分别播种于拟南芥培养基质(营养土:石＝4:1)中，置于光照培养室培养，光周期设置为14h光照/10h黑暗，温度16～23℃，生长湿度为60％～70％。观察开花表型，统计从拟南芥种子发芽开始到开花的生长天数，每个株系的样本量为20株，重复3次。

[0074] 4、结果分析

[0075] 对有卡那霉素抗性的纯合T4代株系进行PCR检测结果表明，在野生型(WT)及突变体(Mu)中不能扩增到ZmBES1/BZR1‑9基因，但是在转化野生型的过表达株系W9‑2、W9‑3，及转化突变体的互补株系B9‑3、B9‑5均扩增到ZmBES1/BZR1‑9基因(图1)，证实ZmBES1/BZR1‑9基因成功转入拟南芥基因组中。

[0076] 对各株系进行开花表型分析发现，与野生型WT相比，突变体bes1‑D开花延迟，但是转化ZmBES1/BZR1‑9基因的互补株系B9‑3和B9‑5可恢复突变体bes1‑D的晚花表型，提前开花，即互补株系的开花时间比突变体bes1‑D显著提前。野生型WT的种子萌发至开花需要约70天，但bes1‑D突变体播种萌发至开花约84天，互补株系B9‑3和B9‑5种子萌发至开花分别需要约72和74天(图2)。同时，转化ZmBES1/BZR1‑9基因的过表达株系W9‑2和W9‑3的开花时间比对照(WT)也显著提前。野生型WT播种萌发至开花需要约70天，但过表达株系W9‑2和W9‑
3种子萌发至开花分别需要约65和58天(图3)。这些结果证实，ZmBES1/BZR1‑9基因可促进转基因拟南芥提前开花。

[0077] 实施例4水稻转化及表型性状分析

[0078] 为进一步确认ZmBES1/BZR1‑9基因促进植物提前开花的功能，我们将pCAMBIA2300‑35S‑ZmBES1/BZR1‑9‑eGFP转化水稻(日本晴)进行过量表达。

[0079] 1、农杆菌介导转化水稻

[0080] (1)水稻愈伤诱导与继代

[0081] 挑选成熟水稻种子并剥离颖壳，倒入50ml离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，再加入30％NaClO消毒20min后，无菌水冲洗5‑6遍。用灭菌过滤纸吸干水分，将种子转移到诱导培养基上，每皿20‑25颗种子。愈伤长出后用于农杆菌转化。

[0082] (2)农杆菌培养及浸染

[0083] 将含pCAMBIA2300‑35S‑ZmBES1/BZR1‑9‑eGFP载体的农杆菌EHA105在含有卡那霉素和利福平的平板上划线，28℃黑暗培养2天至出现单菌落。准备浸染液，加入AS(1000倍稀释)，调整菌体浓度至OD600为0.3‑0.5，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

[0084] 挑选愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右的愈伤组织，放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液，室温放置浸染20分钟，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3天。

[0085] (3)筛选培养

[0086] 共培养3天后的愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，加入无菌水冲洗两遍，第三遍用含有500μL/L羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30min左右，待愈伤吹干后转移到筛选培养基上进行筛选培养，培养条件28‑30度，暗培养。筛选时长3‑4周。

[0087] (4)分化再生与幼苗生根

[0088] 筛选一个月后，将阳性愈伤挑取到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗阳性愈伤，置于28‑30℃温室中光照培养。一般10天左右可将愈伤冒出绿点，在经过10天左右会有幼苗分化出。

[0089] 待分化出的幼苗长到2‑3cm左右，将幼苗转移到生根培养基上让幼苗长大，生根培养条件28‑30℃，无菌光照培养。

[0090] 2、PCR鉴定

[0091] (1)取水稻幼苗叶片100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNase A(10mg/mL)，漩涡振荡1min，室温放置10min。

[0092] (2)加入130μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中。

[0093] (3)可选步骤：将上清液再次12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中。

[0094] (4)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。12000r/min离心2min，弃上清，保留沉淀。

[0095] (5)加入600μL 75％乙醇，涡旋振荡5s，12000r/min离心2min，弃上清。

[0096] (6)重复步骤(5)。

[0097] (7)开盖倒置，室温5～10min，彻底晾干残余的乙醇。

[0098] (8)加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴10～60min溶解DNA，期间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。

[0099] (9)使用PCR引物如表1，以提取水稻苗叶片的基因组DNA为模板进行PCR检测，程序为94℃，3min；94℃30s，最适退火温度30s，72℃60s/kb，35个循环；72℃5min；4℃保存。

[0100] 3、转基因株系表型观察

[0101] 将PCR鉴定阳性的水稻种子置于28℃环境下水培催芽36h，随后移入光照培养箱中培养，培养箱生长条件为光周期为13h光照/11h黑暗，光照时温度为28℃，黑暗时温度为25℃。待植物长到四叶期后，选取长势一致的水稻苗移入大田中。将转基因株系及未转化对照WT(日本晴)按照随机区组实验设计种植，设置三个小区，每个小区每个株系种植10行，行长1m，株距0.1m，每行10株，行距0.5m。统计各株系移栽后至抽穗天数，并拍照。

[0102] 4、结果分析

[0103] 对有卡那霉素抗性的转基因水稻株系进行PCR检测结果表明，在未转基因的野生型(WT)水稻中不能扩增到ZmBES1/BZR1‑9基因，但是在过表达株系OE‑1和OE‑2中均扩增到ZmBES1/BZR1‑9基因(图4)，证实ZmBES1/BZR1‑9基因成功转入水稻基因组中。

[0104] 对各株系进行开花表型分析发现，与野生型WT相比，转化ZmBES1/BZR1‑9基因的过表达株系OE‑1和OE‑2提前开花，野生型WT幼苗移栽大田至抽穗需要约120天，转基因株系OE‑1和OE‑2幼苗移栽至抽穗分别所需约110天和112(图5)，证实ZmBES1/BZR1‑9基因确实可促进转基因水稻提前开花。

[0105] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。