氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用

摘要

本发明公开一种氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用，属于生物工程技术领域。本发明首次从海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalusM15)中获得对圆柚醇具有较高转化能力的氧化还原酶，通过定点突变获得了更高能力的氧化还原酶突变体。与现有的能够催化圆柚醇的氧化还原酶相比，该氧化还原酶及其突变体具有良好的底物耐受度、转化率高及高耐盐性。本发明所提供的氧化还原酶及其突变体，为体外酶催化方式合成圆柚酮提供了条件，实现以绿色、高效的方式催化圆柚醇合成圆柚酮产物。本发明将为圆柚酮的合成提供一种重要的工具酶，并为圆柚酮的合成工业带来巨大的经济效益。

权利要求

1.氧化还原酶突变体在生物合成圆柚酮中的应用，其特征在于：所述氧化还原酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.2经如下任意一种突变而得：（1）第69位氨基酸由赖氨酸K突变为苏氨酸T；

（2）第69位氨基酸由赖氨酸K突变为苏氨酸T，且第136位氨基酸由甘氨酸G突变为精氨酸R；

（3）第69位氨基酸由赖氨酸K突变为苏氨酸T，且第136位氨基酸由甘氨酸G突变为丙氨酸A。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述氧化还原酶突变体提高底物耐盐性和/或转化率；所述的底物为圆柚醇。

3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于：编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基因序列如SEQ ID No.3所示。

4.权利要求1～2任一项中所述的氧化还原酶突变体。

5.编码权利要求4所述的氧化还原酶突变体的基因。

6.含有权利要求5所述基因的重组表达载体或重组表达微生物细胞。

7.权利要求6所述的重组表达载体或重组表达微生物细胞在生物合成圆柚酮中的应用。

说明书

氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用。

背景技术

[0002] 圆柚酮(Nootkatone，又称为诺卡酮)，是一种具有柚香气及略带苦味的倍半萜类化合物，在阿拉斯加雪松中首次被提取出来，并存在于葡萄柚和柑桔等植物中。纯的圆柚酮是白色至微黄色的晶体，被FDA和EPA批准用于调配圆柚、橙子、热带水果等食用香精和烟用香精。以喷雾形式存在的圆柚酮是一种有效的针对孤星蜱(lone star ticks)和鹿蜱(deer ticks)的杀虫剂，此外对蚊子、臭虫、虱子等也具有很好的杀灭效果。因圆柚酮具有很好的挥发性，且对人类无毒，因而被认为是环境友好的杀虫剂。2014年，CDC正式批准两家公司可以生产圆柚酮类杀虫剂。此外，近年来研究发现圆柚酮具有抑制癌细胞增生和对神经炎症、阿尔茨海默病的潜在治疗作用，其研发引起了医药行业的浓厚兴趣，因而应用前景巨大。

[0003] 圆柚酮作为倍半萜类化合物中的一种，化学结构复杂，使得其工业化大规模生产遭遇障碍。目前圆柚酮的生产方法主要有三种：物理提取法、化学合成法和生物催化转化法。以葡萄柚为原料通过蒸馏、萃取等工艺分离出来的圆柚酮，其有效浓度低、分离提纯等工序复杂、易受季节和气候变化的影响等问题的困扰，不能满足工业需求。目前，工业上最常用的方法是由相对廉价的前体物质瓦伦西亚烯(valencene)化学合成圆柚酮，但其氧化反应中使用的催化剂如三氧化铬、乙酰丙酮酸钴或其他一些重金属盐类，产生较多毒性废物，有悖于绿色发展理念。为了满足圆柚酮愈发增长的市场需求，利用生物催化转化方法不受原料的限制、可以避免在植物萃取过程中带来的高能耗、低产量及环境污染等问题，具有很大的优势。

[0004] 近年来，微生物的代谢工程取得了重大进展。构建高效的微生物细胞工厂，提高其生理性能，有望将较为廉价的原料底物高效转化为高附加值的目标产品，大幅度降低微生物发酵的生产成本。在酵母和大肠杆菌等微生物中构建相关酶的异源表达来生产圆柚酮备受关注。研究人员从C.sinensis中分离出瓦伦西亚烯合成酶基因，在大肠杆菌中能有效进行地功能表达，也可用于后续生产圆柚酮(Chappell J.et al.Novel sesquiterpene synthase gene and protein:US,US20120196340A1[P].2006.)。进一步发现来源于P.sapidus的瓦伦西亚烯双加氧酶(ValOx)在大肠杆菌的细胞质中表达，通过中间体过氧化氢将瓦伦西亚烯转化为圆柚醇和圆柚酮(Zelena K.et al.Functional expression of a valencene dioxygenase from Pleurotussapidus in E.coli[J].Bio Tec,2012,108:231‑239.)。模式生物酵母是目前最常用的基因表达宿主之一，其培养条件简单，遗传背景清晰，易于进行基因改造，其中海洋酵母对醋酸、甲酸、糠醛、香草醛和盐等抑制性化合物的存在比陆地酵母明显更耐受，其中耐受度最高的海洋嗜杀酵母是Wickerhamomyces anomalus M15，其耐盐性是酿酒酵母NCYC2592 1.6倍(Greetham D.et al.Exploring the tolerance of marine yeast to inhibitory compounds for improving bioethanol production[J].Sustainable Energy&Fuels,2019,3(3).)。因此，利用基因工程手段，进一步获得高效且具有环境耐受特性的圆柚醇脱氢酶仍是本技术领域的当务之急。

[0005] NCBI收录了一种来源于海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus NRRL Y‑366‑8)的假定蛋白，原名为WICANDRAFT_92107(NCBI登录号为XP_019039214.1)，共包含264个氨基酸；其编码基因(NCBI登录号为XM_019186339.1)的核苷酸序列共包含795个核苷酸。至今，未见有文献报道该蛋白任何实际的功能和应用。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用，旨在解决生物合成圆柚酮过程中现有醇脱氢酶所能耐受的底物浓度低、转化率低及耐盐性较差和在工业生产上不理想的问题。

[0007] 本发明首次从海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus M15)中获得对圆柚醇具有较高转化能力的氧化还原酶，通过定点突变获得了更高能力的氧化还原酶突变体。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0009] 本发明提供一种氧化还原酶和/或其突变体在生物合成圆柚酮中的应用。

[0010] 本发明中，所述氧化还原酶来源于海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus M15)的NRRL，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共包含264个氨基酸。

[0011] 本发明中，所述氧化还原酶NRRL编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共包含795个核苷酸。

[0012] 进一步的，氧化还原酶NRRL编码基因经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

[0013] 本发明还涉及一种氧化还原酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.2的第69位和第136位氨基酸中的一个或两个位点突变而得；进一步的，第69位氨基酸由赖氨酸K突变为苏氨酸T，第136位氨基酸由甘氨酸G突变为精氨酸R或丙氨酸A；

[0014] 更进一步的，所述的氧化还原酶突变体，氨基酸序列为SEQ ID No.2的第69位氨基酸由赖氨酸K突变为苏氨酸T，第136位氨基酸由甘氨酸G突变为精氨酸R，具体氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0015] 优选的，所述的氧化还原酶突变体中，编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基因序列如SEQ ID No.3所示。

[0016] 在本发明另一方面，所述的氨基酸序列SEQ ID No.2经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

[0017] 本发明中，提供了一种含有所述的氧化还原酶及其突变体编码基因的重组表达载体；优选的，所述重组载体为所述的氧化还原酶及其突变体与2μ型高拷贝质粒YEp352进行重组得到的重组表达载体。

[0018] 本发明中，提供了一种包含本发明所述的氧化还原酶及其突变体编码基因的重组表达载体的重组表达细胞；优选的，所述重组表达细胞为含有所述具有氧化还原酶及其突变体与载体重组得到的重组表达载体再转化至宿主细胞得到的重组表达细胞。宿主细胞，本发明优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，更优选酿酒酵母CEN.PK2‑1 Ca菌株。

[0019] 本发明中，还涉及用于制备圆柚酮的方法。

[0020] 本发明中，提供了两种利用包含本发明所述氧化还原酶及其突变体编码基因的重组表达载体的重组表达细胞来实现圆柚酮的生物合成。

[0021] 一种为全细胞体外催化方法，即通过外源添加前体物质圆柚醇并利用本发明所述的重组表达细胞进行体外转化以得到圆柚酮。所述反应底物为圆柚醇。

[0022] 本发明所述的转化效率，表示为在一定时间内将前体物质圆柚醇转化为目标产物圆柚酮的比例。

[0023] 另一种方法中，圆柚酮以生物发酵(即，通过在含有培养基的反应器中培养表达相关酶的重组表达细胞)制备。

[0024] 在一个优选实施例中，宿主细胞是真核细胞，特别地选自酿酒酵母CEN.PK2‑1 Ca菌株(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2‑1 Ca)。已经利用专利申请号201910271558.6所述技术，对该宿主细胞进行了基因组改造，包括敲除了甲羟戊酸途径的限制因子rox1，并下调了倍半萜类物质前体FPP的下游支路途径相关酶erg9的表达强度，来提高前体物质FPP的供应量。并利用国际专利申请号PCT/NL2010/050848所述来源于黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)的瓦伦西亚烯合成酶ValC将FPP转化为圆柚酮前体物质瓦伦西亚烯。随后利用专利WO 2006/079020所述的来源于纯天仙子(Hyoscyamus muticus)的细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenase，CYP450)HPO和Urban,Pd等人在1997年文章中描述的来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的细胞色素还原酶AtCPR(Urban,P.,etal.Cloning,yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH‑cytochrome P450reductases with P450 CYP73A5.J.Biol.Chem.1997,272,19176–19186.)，将瓦伦西亚烯进一步氧化为圆柚醇。进而利用本发明所述的氧化还原酶或其突变体将圆柚醇转化为最终所需产物圆柚酮。

[0025] 本发明还保护所述氧化还原酶及其突变体作为圆柚醇脱氢酶在生物合成圆柚酮中具有高耐盐性的用途。

[0026] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0027] (1)本发明提供了一个海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus M15)来源的氧化还原酶NRRL，该酶是首次发现的海洋嗜杀酵母来源的以圆柚醇作为底物的氧化还原酶。同时，本发明也在国内外首次公开了氧化还原酶NRRL及其突变体在催化圆柚醇合成圆柚酮中的应用。

[0028] (2)本发明为通过体外酶催化方式合成圆柚酮提供了条件，实现以绿色、高效的方式催化圆柚醇合成相应的圆柚酮。克服了通过物理提取法或者化学合成方法获得圆柚酮时，存在产量低、效率低、操作繁琐、环境污染严重、成本高的缺陷。

[0029] (3)与现有的能够催化圆柚醇的氧化还原酶相比，NRRL及其突变体具有良好的底物耐受度、转化率高及高耐盐性。相较已发现的来源于柑橘的ABA2(NCBI登录号为HM036684.1)圆柚醇脱氢酶的效果明显更优。结果显示在相同条件下，利用本发明所述的氧化还原酶得到的底物目标转化率更高，分别为柑橘的ABA2的近3.8倍之多。另外，本发明所提供的部分圆柚醇脱氢酶突变体，在同等条件下对圆柚醇转化效率可以是序列表SEQ ID No.2所示的氧化还原酶近2.4倍之多，具有更好的对底物耐受性，且在不同浓度(6％、9％、12％、15％、18％(W/V))的NaCl中的耐受性有所提高。

[0030] (4)本发明将为圆柚酮合成提供一种重要的工具酶，将为圆柚酮的合成工业带来巨大的经济效益。

附图说明

[0031] 图1是质粒构建及反应示意图。

[0032] 图2是相关醇脱氢酶全细胞催化的气相检测结果图。

[0033] 图3是圆柚酮的GC‑MS质谱图。

[0034] 图4是NRRL的基因序列经密码子优化前后的表达菌株催化性能比较。

[0035] 图5是氧化还原酶突变体底物转化效率。

[0036] 图6是不同浓度NaCl(W/V)对氧化还原酶或氧化还原酶突变体转化率的影响。

具体实施方式

[0037] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0038] 下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要指出的是，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以在此基础上做出若干变动和改进，例如改变表达载体的种类，更改表达载体构建的方法，改变宿主细胞的种类等。这些都属于本发明的保护范围。

[0039] 实施例中所用的S.cerevisiae CEN.PK2‑1 Ca、S.c.PK2‑M均在“CN201910271558‑生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用”中公开。

[0040] 实施例中的海洋嗜杀酵母Wickerhamomyces anomalus M15在文献“Greetham D.et al.Exploring the tolerance of marine yeast to inhibitory compounds for improving bioethanol production[J].Sustainable Energy&Fuels,2019,3(3).”中公开。

[0041] 实施例1：氧化还原酶NRRL的克隆及表达载体的构建

[0042] 将海洋嗜杀酵母Wickerhamomyces anomalus M15接种于5mL YPD(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L)液体培养基中于30℃培养至对数生长期。使用Yeast DNA Kit试剂盒(购自Omega公司)从海洋嗜杀酵母中提取基因组总DNA。

[0043] 针对来源于海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus NRRL Y‑366‑8)的假定蛋白[名称为WICANDRAFT_92107(NCBI登录号为XP_019039214.1)，共包含264个氨基酸；其编码基因(NCBI登录号为XM_019186339.1)的核苷酸序列，共包含795个核苷酸]的编码基因序列设计一对特异性的引物，同时每条引物在5′端引入与载体同源的碱基序列用于同源重组克隆方法构建YEp352表达载体，取上述的总DNA溶液0.5μL(约10ng)作为模板，所用PCR酶为KOD FX(购自TOYOBO，日本)，扩增得到目的基因片段，即氧化还原酶NRRL基因片段，经测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；将该序列在NCBI中进行比对，发现其与上述来源于海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus NRRL Y‑366‑8)的假定蛋白的同源性为100％。

[0044] 其中，具体扩增引物如下(下划线标示序列为与载体序列同源的碱基)：

[0045] NRRL‑F：5′‑AGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGACTTTAAACACCCAAA‑3′；

[0046] NRRL‑R：5′‑GACCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTTTAATGATACATTATTCCA‑3′；

[0047] 表1.KOD‑FX PCR体系及条件

[0048]

[0049] PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因片段大小是否正确，并用寡聚核苷酸纯化试剂盒(购自Omega公司)对扩增片段进行纯化，用微量分光光度计检测基因片段的浓度，扩增得到目的基因片段，即氧化还原酶NRRL基因片段。

[0050] 使用Yeast DNA Kit试剂盒提取酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2‑1 Ca的基因组。以基因组为模板，以TDH3‑F/TDH3‑R引物对扩增TDH3启动子片段，以ADH1‑F/ADH1‑R引物对扩增ADH1终止子片段。

[0051] 所用引物序列如下(下划线标示序列为同源的碱基)：

[0052] TDH3‑F：5′‑TGACCATGATTACGAATTCTTTACCGTCGACACAGTTTATTCCTGGCATC‑3′；

[0053] TDH3‑R：5′‑GACCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTTTTGTTTGTTTATGTGTGT‑3′；

[0054] ADH1‑F：5′‑GAATAAACACACATAAACAAACAAAAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAG‑3′；

[0055] ADH1‑R：5′‑TTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATAGGGTAGGGGAATTTC‑3′；

[0056] 用YEp352‑F1/YEp352‑R1引物对扩增购自Invitrogen公司的YEp352质粒载体片段。

[0057] YEp352‑F1：5′‑GATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGG‑3′；

[0058] YEp352‑R1：5′‑GTCGACGGTAAAGAATTCGTAATCAT‑3′；

[0059] 利用ClonExpress II重组克隆试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将所获得的TDH3启动子片段、ADH1终止子片段和YEp352质粒载体片段进行多片段同源重组连接，获得载体YEp352‑TDH3promoter‑ADH1terminator，简写为YEp352‑TDH3p‑ADH1t。

[0060] 用YEp352‑F2(5′‑AGCTTTGGACTTCTTCGCC‑3′)和YEp352‑R2(5′‑TTTGTTTGTTTATGTGTGTT‑3′)扩增YEp352‑TDH3p‑ADH1t，然后利用ClonExpress II重组克隆试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将YEp352‑F2/R2扩增得到的载体片段和上述所获得的目的基因进行同源重组连接。

[0061] 然后将10μL连接产物利用化学法转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂LB/Amp(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15g/L琼脂，121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度Ampicillin 1000mg/mL)平板，37℃培养12至16小时后，得到重组菌E.coli(YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t)，构建图谱见图1。挑取重组菌接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度Ampicillin 1000mg/mL)，在37℃、220rpm下培养12小时，然后利用快速质粒小提试剂盒(购自天根(北京)股份有限公司)提取质粒，并送至生工生物工程(上海)有限公司进行基因测序。利用Snapgene软件对测序结果进行分析，得到含所述氧化还原酶基因重组质粒YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t。

[0062] 实施例2：重组表达细胞的构建

[0063] 利用酵母转化试剂盒S.c.Easy Comp Transformation Kit(购自美国Invitrogen公司)，将实施例1中构建的重组表达质粒YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t转化至酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2‑1 Ca感受态细胞中。

[0064] 1)每25μL感受态细胞加入500ng的重组质粒和250μL  Solution  III(Transformation solution)；

[0065] 2)通过涡旋振荡器振荡均匀，在30℃恒温培养箱中放置15min；

[0066] 3)取出后再次振荡混匀，30℃放置15min，后再重复该操作两次；

[0067] 4)然后取200μL重组酵母细胞在营养缺陷型平板SD/ΔUra(6.7g/L YNB，2g/L氨基酸混合物，20g/L葡萄糖，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸)上均匀涂板，于30℃培养2～4天。

[0068] 直至平板上长出单克隆，得到重组表达细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca(YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t)。

[0069] 实施例3：全细胞体外催化制备圆柚酮

[0070] 挑取实施例2所获得的重组表达细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca(YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t)至含5mL SD/ΔUra液体培养基的试管中，30℃、220rpm下培养24小时。然后按初始OD600＝0.05的接种量转接至装有50mL SD/ΔUra液体培养基的250mL摇瓶中，30℃、220rpm下培养24小时。随后收集总OD600为50的菌液，在3000rpm、4℃离心5min，弃上清。然后将重组表达细胞用磷酸化钾缓冲液(50mM，pH 7.4)重悬定容至1mL，得到50OD600/mL的反应液。加入20μL 100mM的圆柚醇溶液(含1％(v/v)Triton‑100，用二甲基亚砜溶解)，使得底物终浓度为2mM，在25℃、220rpm下催化24小时。

[0071] 产物检测方法如下(后续实施例中的产物检测方法和实施例3相同)：

[0072] 反应结束后，将反应液转移至2mL离心管中，并加入1mL乙酸乙酯震荡萃取10min，随后在最大转速下离心5min，分离有机层和水层后取500μL上层乙酸乙酯至1.5mL离心管中，再加入500μL乙酸乙酯。最后经0.22μm有机滤膜过滤至色谱瓶中待气相检测。所用气相为Hewlett‑Packard 5890II气相色谱仪，色谱柱为5％Ph‑Me硅氧烷柱，规格为30m×0.10mm×0.10μm；检测器为氢火焰检测器(FID)；载气为N2。

[0073] 检测方法如下：1μL样品分流进样，分流比15：1；进样口温度250℃；检测器温度350℃；柱温100℃保持5min，再以20℃/min升温至200℃，200℃保持5min，总时间为15min。

[0074] 所用气相为Hewlett‑Packard 5890II气相色谱仪，色谱柱为石英毛细管柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm，检测器为质量选择检测器(MSD)。程序同上述一致。质量扫描的方式：选择离子扫描。质谱条件：电子轰击(EI)电离源，电子能量70e V。

[0075] 标准品经GC‑FID检测，检测出圆柚酮的保留时间为19.540min，部分候选醇脱氢酶全细胞催化的气相检测结果如图2所示，并通过GC‑MS进一步定性分析物质结构，结果如图3所示。样品的色谱图和质谱图分别与标准品对照，与标准品一致，故所构建的重组酵母菌株均能成功转化瓦伦西亚烯生成圆柚醇和圆柚酮。

[0076] 最终，所述氧化还原酶的重组表达细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca(YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t)对圆柚醇的转化率为100％。

[0077] 同样的，按照实施例1至3所述方法，本发明同时构建了来源于柑橘的氧化还原酶ABA2(NCBI登录号为HM036684.1)重组表达细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca(YEp352‑TDH3p‑ABA2‑ADH1t)，并测试了在上述相同条件下它们的催化能力。检测结果如图2所示，结果分别为实施例3所述转化效果的26％。本发明所述氧化还原酶的重组表达细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca(YEp352‑TDH3p‑NRRL‑ADH1t)在相同条件下的催化效率，为ABA2对应重组表达细胞的3.8倍，显示出本发明所述氧化还原酶的良好对圆柚醇转化能力。

[0078] 实施例4：氧化还原酶NRRL密码子优化

[0079] 对筛选得到的可催化圆柚醇至圆柚酮的氧化还原酶NRRL序列，根据酿酒酵母的密码子适应性指数(condonadaptableindex，CAI)进行评估，利用德泰生物(http://www.detaibio.com/)软件进行分析，将催化性能较高且CAI较低的氧化还原酶NRRL序列委托生工生物工程公司(上海)进行密码子优化和序列合成。按实施例1和实施例2所述方法，将经密码子优化后的NRRL(cp)序列构建至YEp352‑TDH3p‑ADH1t表达盒中，得到YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑ADH1t质粒，进一步得到重组表达细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca(YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑ADH1t)。其中，NRRL(cp)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

[0080] 按实施例3所述方法，与原始序列的菌株分别进行全细胞催化实验，评估优化前后的催化性能差异，结果如图4所示，当底物浓度增加，所有菌株对底物转化率均有降低趋势；但经过密码子优化的NRRL(cp)菌株下降幅度较低，当底物浓度为4和6mM时，相较原始菌株，转化率提高1.26倍。说明经密码子优化过后，能够一定程度上提升NRRL(cp)在宿主菌中的表达水平，从而进一步提升其催化性能。

[0081] 实施例5：氧化还原酶NRRL突变体的制备

[0082] 通过对氧化还原酶NRRL的蛋白质空间结构进行模拟分析，确定其突变位点为第69位赖氨酸K突变为苏氨酸T以及第136位甘氨酸G突变为精氨酸R或丙氨酸A。

[0083] 根据NRRL优化序列SEQ ID NO.3所示(NRRL(cp))设计定点突变的突变引物，通过基因的定点突变方法，将氧化还原酶NRRL基因发生突变，获得新的氧化还原酶基因。以重组质粒YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑ADH1t为模板，利用快速PCR技术，其中重组质粒的通用引物为：

[0084] YEp352‑F3：5′‑GTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTG‑3′；

[0085] YEp352‑R3：5′‑CCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTA‑3′；

[0086] 对第69位引入单突变，引物为(下划线标示序列为突变碱基)：

[0087] NRRL(cp)：K69T‑F：5′‑CTTCTACGAAGCAAGAAATTTTCGAT‑3′；

[0088] NRRL(cp)：K69T‑R：5′‑CTTGCTTCGTAGAAGAATCACATGGA‑3′；

[0089] NRRL(cp)：G136R‑F：5′‑AATTGCGTAACCAACCAGGTAAAATT‑3′；

[0090] NRRL(cp)：G136R‑R：5′‑TGGTTACGCAATTCTTCGAACTTCT‑3′；

[0091] NRRL(cp)：G136A‑F：5′‑AATTGGCTAACCAACCAGGTAAAATT‑3′；

[0092] NRRL(cp)：G136A‑R：5′‑TGGTTAGCCAATTCTTCGAACTTCT‑3′；

[0093] 上述引物分别和通用引物YEp352‑F3/YEp352‑R3进行扩增，扩增体系和条件如表2所示：

[0094] 表2.PCR扩增体系和条件

[0095]

[0096] PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因片段大小是否正确，并用寡聚核苷酸纯化试剂盒对扩增片段进行纯化，用微量分光光度计检测基因片段的浓度，得到NRRL(cp)：K69T‑F/R、NRRL(cp)：G136R‑F/R和NRRL(cp)：G136A‑F/R DNA片段。

[0097] 采用实施例1的方法，得到含所述氧化还原酶单点突变基因的三种重组质粒，分别是：YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑K69T/G136R/G136A‑ADH1t；

[0098] 实施例6：氧化还原酶NRRL双位点突变体的制备

[0099] 分别以实施例5构建的重组质粒YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑K69T‑ADH1t为模板，对第136位引入单突变，实现双位点突变体的构建，引物如NRRL(cp)：G136R‑F/R、NRRL(cp)：
G136A‑F/R所示。

[0100] 采用实施例1和实施例5的方法，得到含所述氧化还原酶双点突变的两种重组质粒，分别是：YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑K69T‑G136R/K69T‑G136A‑ADH1t；

[0101] 实施例7：氧化还原酶突变体的催化效率和底物耐受性

[0102] 采用实施例2的重组表达细胞构建的方法，将构建完成的5种重组表达载体，转化至酿酒酵母S.c.CEN.PK2‑1 Ca感受态细胞中，得到5种重组表达细胞，再利用实施例3的全细胞体外催化方法，来测试对应氧化还原酶突变体的转化效率。

[0103] 结果如图5所示，相对于原始氧化还原酶NNRL(cp)，氧化还原酶突变体获得了明显提升的体外圆柚醇转化效率和底物耐受性。其中有益的突变位点为：NRRL(cp)：K69T、NRRL(cp)：G136R、NRRL(cp)：G136A、NRRL(cp)：K69T‑G136R、NRRL(cp)：K69T‑G136A。相对于相同试验体系中原始的氧化还原酶NRRL(cp)，上述有益突变体的氧化还原酶转化效率为107％(如NRRL(cp)：G136R)至247％(如NRRL(cp)：K69T‑G136R)。对于许多测试的氧化还原酶突变体，这种转化效率的通常与底物耐受性提升一起出现，结果如表3所示，因此指出以下事实：转化效率的提升主要不因这些突变体在酿酒酵母中的表达增加而引起。

[0104] 表3：与SEQ ID NO.2相比具有修饰的氧化还原酶的底物耐受性和转化效率汇总[0105]

[0106] a：修饰的氧化还原酶氨基酸残基的位置；残基编码始于SEQ ID NO.2中的N端苏氨酸残基(＝Met‑1)。

[0107] b：测试方法参考实施例3，差别在于投入的圆柚醇底物浓度不同。

[0108] c：相对于采用野生型氧化还原酶(＝对照)所获得转化效率的经修饰的氧化还原酶(＝样品)转化效率，即{(Nootkatone[样品]/底物浓度[样品])/(Nootkatone[对照]/底物浓度[对照])×100％。

[0109] d：所述酶在测试条件下仍能保持60％以上转化率的耐受浓度。

[0110] e：氧化还原酶野生型(SEQ ID NO.2)。

[0111] f：()括号内表示在突变为对应氨基酸时所使用的密码子。

[0112] 实施例8：氧化还原酶突变体的耐盐性

[0113] 按照实施例3的全细胞体外催化方法，在反应体系中加入3％、6％、9％、12％、15％、18％NaCl(W/V，g/100mL)，在25℃、220rpm下催化24小时，研究其对氧化还原酶突变体底物转化率的影响。

[0114] 结果如图6所示，WT(未经突变的NRRL)在3％NaCl(W/V)反应体系中催化24h，其底物转化率未受影响；在6％、9％、12％、15％、18％NaCl(W/V)中处理24h后，上述具有较高底物催化效率和耐受性的五个突变体：NRRL(cp)：K69T、NRRL(cp)：G136R、NRRL(cp)：G136A、NRRL(cp)：K69T‑G136R、NRRL(cp)：K69T‑G136A，随着NaCl(W/V)浓度的提升，底物转化率有降低趋势，但突变体的底物转化率都比WT高，表明突变体的耐盐性较WT有所提高。

[0115] 综合上述结果，其中最优突变体NRRL(cp)：K69T‑G136R，本发明所述的氧化还原酶突变体，通过单点或双点突变，获得了相较于野生型氧化还原酶更高的转化效率、底物耐受性和耐盐性，具有很好的工业应用前景。

[0116] 实施例9：利用生物发酵的方式以简单碳源制备圆柚酮

[0117] 利用专利申请号201910271558.6所述技术，对宿主细胞S.c.CEN.PK2‑1 Ca进行了基因组改造，即敲除了甲羟戊酸途径的限制因子rox1，并下调了倍半萜类物质前体FPP的下游支路途径相关酶erg9的表达强度，来提高前体物质FPP的供应量，最终获得S.c.PK2‑M菌株。并将国际专利申请号PCT/NL2010/050848所述来源于黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)的瓦伦西亚烯合成酶ValC基因(NCBI登录号为JX040471)(该基因的表达盒中的启动子为PDC1，终止子为SAG1)和经N端调控区域截除的酿酒酵母内源HMG‑CoA还原酶tHMG1(为甲羟戊酸途径限速步骤酶)基因(NCBI登录号为NM_001182434)(该基因的表达盒中的启动子为TEF1，终止子为CYC1)导入至实施例4所得的重组表达载体YEp352‑TDH3p‑NRRL(cp)‑ADH1t中，获得重组表达载体YEp352‑ValC‑tHMG1‑NRRL(cp)。另外将p414‑TEF1p‑Cas9‑CYC1t载体(Addgene公司的商业化质粒)中的TEF1p‑Cas9‑CYC1t替换为来源于专利WO 2006/079020所述的纯天仙子(Hyoscyamus muticus)的细胞色素P450单加氧酶HPO基因(NCBI登录号为EF569601)(该基因的表达盒中的启动子为HXT7，终止子为TPI1)和Urban,Pd等人在1997年文章中描述的来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的细胞色素还原酶AtCPR基因(NCBI登录号为NM_118585)(该基因的表达盒中的启动子为HXT7，终止子为TPI1)(Urban,P.,et al.Cloning,yeast expression,and characterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH‑cytochrome P450 reductases with P450 CYP73A5.J.Biol.Chem.1997,272,19176–19186.)，获得重组表达载体p414‑HPO‑AtCPR。将重组表达载体YEp352‑ValC‑tHMG1‑NRRL(cp)和p414‑HPO‑AtCPR一起转化至前面已构建成功的高产FPP工程菌株S.c.PK2‑M中，获得重组表达细胞S.c.PK2‑M(YEp352‑ValC‑tHMG1‑NRRL(cp)和p414‑HPO‑AtCPR)，简称“PK2‑VHN(cp)‑HA”。

[0118] 将PK2‑VHN(cp)‑HA菌株接种于含有5mL SD/ΔTrp‑Ura培养基(6.7g/L YNB，2g/L氨基酸混合物，20g/L葡萄糖，20mg/L亮氨酸)的试管中，于30℃、220rpm摇床培养20小时左右，待菌液OD600达到1～3时，转接至含有10mL SD/ΔTrp‑Ura培养基的50mL锥形瓶中，并覆盖20％正十二烷(2mL)有机相，于25℃、220rpm摇床发酵96小时。

[0119] 发酵结束后，取上层的正十二烷有机相500μL，与等体积乙酸乙酯混合后，按照实施例4所述气相检测方法进行产物检测。

[0120] 最终发酵结果中，圆柚酮的产量为24mg/L，占总萜(瓦伦西亚烯、圆柚醇和圆柚酮总和)产量的20％。而将所用的氧化还原酶换成来源于源于柑橘的ABA2，所获得的圆柚酮产量只有2.5mg/L，占总萜产量的2.6％。即说明了使用本发明所述的氧化还原酶后，可以将圆柚酮的发酵产量提升9.6倍，纯度提升12倍。而继续换用氧化还原酶突变体，如NRRL(cp)：K69T‑G136R，所获得的圆柚酮产量提升至42mg/L，为使用野生型氧化还原酶的1.75倍。证明了本发明所述氧化还原酶的催化性能较以往报道的同工酶更加优良，所能耐受的底物浓度也更高，利用所述的氧化还原酶及其突变体，可以获得更高的圆柚酮发酵产量和纯度更高的产品。

[0121] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。