一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法

摘要

本发明涉及一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法，属于遗传工程技术领域；所述方法包括人胚胎干细胞的复苏与传代、诱导得到中胚层细胞、诱导得到CD34+造血干细胞、分离纯化CD34+造血干细胞、诱导得到NK细胞、扩增培养；所述人胚胎干细胞为人胚胎干细胞系H9；所述人胚胎干细胞的复苏与传代，将人胚胎干细胞复苏后进行传代，传至第2代，细胞汇合度为80%以上时，用于诱导得到中胚层细胞；本发明采用人胚胎干细胞诱导分化得到NK细胞，在效靶比为20:1时，对HELA肿瘤细胞系的杀伤率为94.25%，对LOVO肿瘤细胞系的杀伤率为91.24%。

权利要求

1.一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法，其特征在于：+

所述方法包括人胚胎干细胞的复苏与传代、诱导得到中胚层细胞、诱导得到CD34造血+干细胞、分离纯化CD34造血干细胞、诱导得到NK细胞、扩增培养；

所述人胚胎干细胞为人胚胎干细胞系H9；

所述人胚胎干细胞的复苏与传代为，将人胚胎干细胞复苏后进行传代，传至第2代，细胞汇合度为80%以上时，用于诱导得到中胚层细胞；

所述诱导得到中胚层细胞的方法为，将传至第2代、细胞汇合度为80%以上的人胚胎干6

细胞，加入含有因子的E3培养基，控制细胞密度为0.8×10 个/mL，控制搅拌速度为15转/分，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24h，形成细胞聚集物；将细胞聚集物离心，弃上清，加入6

含有因子的SFDM培养基中培养，控制细胞密度为1×10 个/mL，在37℃、5%CO2的培养箱中培养2天后，更换含有因子的SFDM培养基，继续在37℃、5%CO2的培养箱中诱导2天得到中胚层细胞；

所述含有因子的E3培养基，为E3培养基中添加终浓度为50μg/mL的L‑抗坏血酸2‑磷酸酯镁、5ng/mL的亚硒酸钠、50ng/mL的FGF2、50ng/mL的VEGF、2μM的CHIR 99021、10μM的Blebbistatin、10μM的Y‑27632的因子；

所述E3培养基为75%Vol的DMEM培养基和25%Vol F‑12培养基混合而成；

所述含有因子的SFDM培养基，为SFDM培养基中添加终浓度为25ng/mL BMP4、50ng/mL VEGF、50ng/mL FGF2的因子；

所述SFDM培养基的制备方法为：将50%Vol的IMDM培养基和50%Vol F‑12培养基混合，添加终浓度为100μg/mL的聚乙烯醇、100μg/mL HSA、1×的MEM非必需氨基酸溶液、0.1×的化学成分明确的脂质浓缩液、125μM的L‑抗坏血酸2‑磷酸酯镁、10ng/mL的IGF1；

+

所述诱导得到CD34造血干细胞的方法为，将中胚层细胞，离心后弃上清，加入含造血支6

持因子的SFDM培养基，控制细胞密度为0.8×10 个/mL，在37℃、5%CO2的培养箱中培养2天+后，更换含造血支持因子的SFDM培养基，继续诱导2天得到CD34造血干细胞；

所述含造血支持因子的SFDM培养基，为SFDM培养基中添加终浓度为50ng/mL SCF、

20ng/mL TPO、10ng/mL FLT‑3L、20ng/mL IL‑3、25ng/mL BMP4的造血支持因子；

+

所述诱导得到NK细胞的方法为，收集分离纯化后的CD34造血干细胞，加入含有因子的6

NK细胞分化培养基，控制细胞密度为1×10 个/mL，放在37℃、5%O2、5%CO2的培养箱中培养2周，每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基；

所述含有因子的NK细胞分化培养基，为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/mL的SCF、50ng/mL TPO、50ng/mL的FLT‑3L、50ng/mL的IL‑7、2ng/mL的IL‑2因子；

所述NK细胞分化培养基为Stemspan SFEM中添加终浓度为1%Vol谷氨酰胺、0.5%Vol双抗、250μM的抗坏血酸磷酸酯镁、2mM的烟酰胺；

所述扩增培养的方法为，收集NK细胞，转移到新的培养瓶中培养，加入含有因子的NK无6

血清培养基，细胞密度为1×10个/mL，放在37℃、5%O2、5%CO2培养箱中培养2周，每三天进行半量更换含有因子的NK无血清培养基；

所述含有因子的NK无血清培养基，为NK无血清培养基中添加终浓度均为10ng/mL的IL‑

2、IL‑7、IL‑15、IL‑21因子。

说明书

一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

[0002] 以细胞为基础的疗法治疗复发或难治性癌症已经引起了人们的兴趣和重视。除了CAR‑T细胞的研究，使用从外周血或脐带血中分离NK细胞进行的临床试验也在迅速扩大，这种方法需要为每个患者收集NK细胞，导致NK细胞存在供体差异和异质性。相比之下，人胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(hiPSC)来源的NK细胞提供了更同质的细胞群，可以在临床规模上生产。这些特性使hESC或hiPSC衍生的NK细胞成为开发标准化、“现成”免疫治疗产品的理想细胞群。

[0003] CN109415699A为日本国立大学申请的CD4CD8双阳性T细胞的制备方法，可以由hESC/ hiPSC细胞诱导分化为T细胞，但没有涉及NK细胞的培养。

[0004] CN104711225A是由胚胎干细胞诱导分化为NK细胞，NK细胞的纯度为97%以上，但是其杀伤效率达到92.21%时的效靶比为40:1。

[0005] 综上所述，现有技术使用胚胎干细胞诱导分化为NK细胞，虽然具有较高的纯度，但存在杀伤力不足的技术问题。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的不足，本发明提供一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法，实现以下发明目的：

[0007] 在保证诱导得到的NK细胞具有较高纯度的同时，提高NK细胞的杀伤力。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

[0009] 一种由人胚胎干细胞诱导分化为NK细胞的方法，所述方法包括人胚胎干细胞的复+ +苏与传代、诱导得到中胚层细胞、诱导得到CD34造血干细胞、分离纯化CD34造血干细胞、诱导得到NK细胞、扩增培养；

[0010] 所述人胚胎干细胞为人胚胎干细胞系H9；

[0011] 所述人胚胎干细胞的复苏与传代，将人胚胎干细胞复苏后进行传代，传至第2代、细胞汇合度为80%以上时，用于诱导得到中胚层细胞；

[0012] 所述诱导得到中胚层细胞的方法为，将传至第2代，细胞汇合度为80%以上的人胚6
胎干细胞，加入含有因子的E3培养基，控制细胞密度为0.8×10个/mL，控制搅拌速度为15转/分，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24h，形成细胞聚集物；将细胞聚集物离心，弃上清，加
6
入含有因子的SFDM培养基中培养，控制细胞密度为1×10个/mL，在37℃、5%CO2的培养箱中培养2天后，更换含有因子的SFDM培养基，继续在37℃、5%CO2的培养箱中诱导2天得到中胚层细胞；

[0013] 所述含有因子的E3培养基，为E3培养基中添加终浓度为50μg/mL的L‑抗坏血酸2‑磷酸酯镁、5ng/mL的亚硒酸钠、50ng/mL的FGF2、50ng/mL的VEGF、2μM的CHIR 99021、10μM的Blebbistatin、10μM的Y‑27632的因子；

[0014] 所述E3培养基为75%Vol的DMEM培养基和25%Vol F‑12培养基混合而成；

[0015] 所述含有因子的SFDM培养基，为SFDM培养基中添加终浓度为25ng/mL BMP4、50ng/mL VEGF、50ng/mL FGF2的因子；

[0016] 所述SFDM培养基的制备方法为：将50%Vol的IMDM培养基和50%Vol F‑12培养基混合，添加终浓度为100μg/mL的聚乙烯醇、100μg/mL HSA、1×的MEM非必需氨基酸溶液、0.1×的化学成分明确的脂质浓缩液、125μM的L‑抗坏血酸2‑磷酸酯镁、10ng/mL的IGF1；

[0017] 所述诱导得到CD34+造血干细胞的方法为，将中胚层细胞，离心后弃上清，加入含6
造血支持因子的SFDM培养基，控制细胞密度为0.8×10个/mL，在37℃、5%CO2的培养箱中培+
养2天后，更换含造血支持因子的SFDM培养基，继续诱导2天得到CD34造血干细胞；

[0018] 所述含造血支持因子的SFDM培养基，为SFDM培养基中添加终浓度为50ng/mL SCF、20ng/mL TPO、10ng/mL FLT‑3L、20ng/mL IL‑3、25ng/mL BMP4的造血支持因子；

[0019] 所述诱导得到NK细胞的方法为，收集分离纯化后的CD34+造血干细胞，加入含有因6
子的NK细胞分化培养基，控制细胞密度为1×10个/mL，放在37℃、5%O2、5%CO2的培养箱中培养2周，每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基；

[0020] 所述含有因子的NK细胞分化培养基，为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/mL的SCF、50ng/mL TPO、50ng/mL的FLT‑3L、50ng/mL的IL‑7、2ng/mL的IL‑2因子；

[0021] 所述NK细胞分化培养基为Stemspan SFEM中添加终浓度为1%Vol谷氨酰胺、0.5%Vol双抗、250μM的抗坏血酸磷酸酯镁、2mM的烟酰胺。

[0022] 所述分离纯化CD34+造血干细胞，分离纯化后的CD34+造血干细胞的纯度为96.9%。

[0023] 所述扩增培养的方法为，收集NK细胞，转移到新的培养瓶中培养，加入含有因子的6
NK无血清培养基，细胞密度为1×10个/mL，放在37℃、5%O2、5%CO2培养箱中培养2周，每三天进行半量更换含有因子的NK无血清培养基；

[0024] 所述含有因子的NK无血清培养基，为NK无血清培养基中添加终浓度均为10ng/mL的IL‑2、IL‑7、IL‑15、IL‑21因子。

[0025] 与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

[0026] 本发明采用人胚胎干细胞诱导分化得到NK细胞，在效靶比为20:1时，对HELA肿瘤‑细胞系的杀伤率为94.25%，对LOVO肿瘤细胞系的杀伤率为91.24%，且本发明诱导的CD3+ 
CD56 NK细胞的纯度为81.3%。

附图说明

[0027] 图1为本发明复苏后的胚胎干细胞的显微镜图；

[0028] 图2为本发明诱导的中胚层细胞的显微镜图；

[0029] 图3为本发明纯化后的CD34+造血干细胞的流式图；

[0030] 图4为本发明诱导的NK细胞的显微镜图；

[0031] 图5为本发明诱导的CD3‑CD56+NK细胞的流式散点图；

[0032] 图6为本发明诱导的NK细胞对HELA细胞的杀伤率的折线图；

[0033] 图7为本发明诱导的NK细胞对LOVO细胞的杀伤率的折线图。

具体实施方式

[0034] 实施例1 人胚胎干细胞的复苏与传代

[0035] 人胚胎干细胞系H9、Vitronectin（人玻连蛋白）、ROCK抑制剂Blebbistatin 、EDTA消化液均购自安徽中盛溯源生物科技有限公司。

[0036] （1）六孔板包被

[0037] 室温条件下解冻包被蛋白Vitronectin，分装成120μL/管，取120μL Vitronectin加入9 mL的DMEM/F12培养基，轻柔混匀稀释，按照1.5mL/孔，分装于六孔板中，轻轻摇晃混匀，得到Vitronectin包被液包被的六孔板。室温静置2h后使用，使用时，将六孔板倾斜，用移液管吸尽包被液。

[0038] （2）细胞的复苏

[0039] 将水浴锅预热至37℃，取出1支冷冻的人胚胎干细胞系H9（1mL），置于37℃水浴锅中，手持轻轻摇晃，1 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出，得到细胞悬液。用75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入超净台中；将细胞悬液移到事先准备好的50mL离心管中，随后逐滴加入10 mL DMEM/F12培养基，过程中轻柔晃动混匀细胞，在850rpm转速下，离心5 min。吸弃上清，加入4 mL含有Blebbistatin （终浓度为2.5µM）的ncEpic完全培养基（预温至室温），混匀细胞，尽量避免吹打，得到细胞培养液。

[0040] 将步骤（1）包被的六孔板中， 2孔的Vitronectin包被液吸弃，将混匀的细胞培养液按照2mL/孔接种到上述2个孔中，水平十字摇匀三次，置于37℃，5%CO2浓度的培养箱中培养。24小时后换新的ncEpic完全培养基（每孔加入2mL），之后每天更换培养基。

[0041] （3）细胞的传代

[0042] 细胞汇合度达85%左右时进行传代（如图1），按照1:5进行传代。

[0043] 所述1:5进行传代，是指1孔细胞传到5孔细胞中继续扩增培养。

[0044] 具体的传代方法为：

[0045] 将Vitronectin包被的六孔板，提前放置超净台中1小时恢复至室温。

[0046] 准备20mL的ncEpic完全培养基，并按4000：1的体积比加入5µL的10mM 的ROCK抑制剂Blebbistatin，恢复至室温，得到预温的含Blebbistatin的ncEpic完全培养基。所述ncEpic完全培养基中，Blebbistatin的终浓度为2.5nM。

[0047] 当复苏的细胞汇合度达85%时，将2个细胞孔内的培养基吸弃，加入2 mL/孔的 DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸弃。加入2mL/孔的EDTA消化液使溶液完全覆盖孔底，置于37℃培养箱中孵育7 min。避免震荡摇晃细胞，倾斜吸弃EDTA 消化液，及时加入2 mL/孔预温的含Blebbistatin的ncEpic完全培养基，水平十字摇晃六孔板，使细胞脱离基质，得到2孔消化后的细胞。

[0048] 吸弃包被的六孔板中的Vitronectin包被液，加入预温的含Blebbistatin的ncEpic完全培养基2 mL/孔，将2孔消化后的细胞平均分配到10个孔中。水平十字摇匀三次，置于37℃，5%CO2浓度的培养箱中培养。24小时后换新ncEpic完全培养基，之后每天更换ncEpic完全培养基。

[0049] 传至第2代的细胞，当细胞汇合度为80%以上时，用于下述试验。

[0050] 实施例2 诱导ESC向CD34+造血干细胞分化

[0051] （1）诱导得到中胚层细胞

[0052] A、当实施例1得到的第2代胚胎干细胞、汇合度为80%以上时，将培养基吸弃，加入6
含有因子的E3培养基，其中细胞密度为0.8×10 个/mL，记为第0天，在超低附着(ULA)烧瓶中，在摇杆平台上以15转/分的连续搅拌下，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24h，形成细胞聚集物。

[0053] 所述含有因子的E3培养基，为E3培养基中添加终浓度为50μg/mL的L‑抗坏血酸2‑磷酸酯镁（Ascorbic acid 2‑phosphate magnesium ）、5ng/mL的亚硒酸钠(Sodium selenite，购自Merck)、50ng/mL的FGF2（人碱性成纤维细胞生长因子）、50ng/mL的VEGF（血管内皮生长因子）、2μM的CHIR 99021（糖原合酶激酶‑3抑制剂）、10μM的Blebbistatin（非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制剂）、10μM的Y‑27632（ROCK抑制剂）（上述因子除已有标注外均购自MCE）；

[0054] 所述E3培养基为75%Vol的DMEM培养基和25%Vol F‑12培养基混合而成（均购自Gibco公司）。

[0055] B、将诱导1天后的细胞聚集物收集到50mL离心管中，在400g下离心5min，弃上清，6
加入20mL含有因子的SFDM培养基中培养，细胞密度为1×10个/mL，37℃、5%CO2的培养箱中培养2天后更换含有因子的SFDM培养基，继续在37℃、5%CO2的培养箱中诱导2天得到中胚层细胞（如图2），记为第5天。

[0056] 所述含有因子的SFDM培养基，为SFDM培养基中添加终浓度为25ng/mL BMP4、50ng/mL VEGF、50ng/mL FGF2的因子；

[0057] 所述SFDM培养基的制备方法为：将50%Vol的IMDM培养基和50%Vol F‑12培养基混合，添加终浓度为100μg/mL 的聚乙烯醇（购自Merck）、100μg/mL HSA（人血清白蛋白，购自MCE）、1×的MEM非必需氨基酸溶液（non‑essential amino acid supplement，货号为11140050，购自Invitrogen）、0.1×的化学成分明确的脂质浓缩液(chemically‑defined lipid supplement，货号为11905031，购自Invitrogen)、125μM的L‑抗坏血酸2‑磷酸酯镁（购自MCE）、10ng/mL 的IGF1（胰岛素样生长因子‑1，购自MCE）。

[0058] 所述1×为将MEM非必需氨基酸溶液稀释到1倍；

[0059] 所述0.1×为将化学成分明确的脂质浓缩液稀释到0.1倍。

[0060] （2）诱导得到CD34+造血干细胞

[0061] 将诱导5天得到的中胚层细胞收集到50mL离心管中，在400g下离心5min，弃上清，6
加入含造血支持因子的SFDM培养基，控制细胞密度为0.8×10个/mL，所述培养基中含有终浓度为50ng/mL SCF、20ng/mL TPO、10ng/mL FLT‑3L、20ng/mL IL‑3、25ng/mL BMP4的造血支持因子。在37℃、5%CO2的培养箱中培养2天后更换含造血支持因子的SFDM培养基，继续诱+
导2天得到CD34造血干细胞，记为第9天。

[0062] 实施例3 免疫磁珠分离纯化CD34+造血干细胞

[0063] （1）收集CD34+造血干细胞，将其在Accutase™细胞消化溶液中，37℃消化20分钟，获得单细胞悬液。单细胞悬液在MACs缓冲液(PBS含5 mg/mL BSA，1 mM EDTA)中洗涤，通过100µm细胞滤网过滤去除聚集物。

[0064] （2）利用美天旎生产的CD34顺磁微珠标记CD34+造血干细胞，根据试剂盒说明书进+ + +行操作，收获CD34 细胞并计数。用流式细胞仪分析CD34 细胞纯度，结果表明该CD34造血干细胞的纯度为96.9%（如图3）。

[0065] 实施例4 诱导CD34+造血干细胞分化为NK细胞

[0066] 收集分离纯化后的CD34+造血干细胞（纯度为96.9%的CD34+造血干细胞），转移到新6
的培养瓶中培养，加入含有因子的NK细胞分化培养基；细胞密度为1×10 个/mL，放在37℃、低氧(5%O2)、5%CO2培养箱中培养2周，每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基。

[0067] 所述含有因子的NK细胞分化培养基，为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/mL的SCF、50ng/mL TPO、50ng/mL的FLT‑3L、50ng/mL的IL‑7、2ng/mL的IL‑2因子；

[0068] 所述NK细胞分化培养基为Stemspan SFEM（购自STEMCELL）中添加终浓度为 1%Vol谷氨酰胺、0.5%Vol双抗、250μM的抗坏血酸磷酸酯镁、2mM的烟酰胺。

[0069] 实施例5 NK细胞的扩增培养

[0070] 收集分化后的NK细胞，转移到新的培养瓶中培养，加入含有因子的NK无血清培养6
基，细胞密度为1×10个/mL，放在37℃、低氧(5% O2)、5%CO2培养箱中培养2周（如图4），每三天进行半量更换含有因子的NK无血清培养基。

[0071] 所述含有因子的NK无血清培养基，为NK无血清培养基中添加终浓度均为10ng/mL的IL‑2 、IL‑7 、IL‑15、IL‑21因子。

[0072] 所述NK无血清培养基，购自北京同立海源生物科技有限公司。

[0073] 收集扩增后的NK细胞，利用流式抗体进行细胞标志物CD3和CD56的检测，结果如图‑ +5所示，CD3CD56NK细胞的比率为81.3%。

[0074] 本发明所述NK细胞的诱导时间为23天，扩增时间为14天。

[0075] 实施例6 NK细胞杀伤活性的测定

[0076] 以CN104711225A专利中NK细胞的诱导方法诱导的NK细胞作为对照组，以结肠癌细胞系LOVO和子宫颈癌细胞系HELA作为靶细胞，效应细胞为本发明诱导的NK细胞（纯度为81.3%）和以CN104711225A诱导的NK细胞（纯度为97%）。

[0077] 效靶比分别为20:1、10:1、5:1和1:1，靶细胞数量为1×104/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。检测时间为细胞混合后4h。

[0078] 其中各实验组和各对照组如下：

[0079] 各实验组：各靶细胞+不同的NK细胞；

[0080] 对照组1：靶细胞最大释放LDH，需加入一定体积的细胞裂解液；

[0081] 对照组2：靶细胞自发释放LDH；

[0082] 对照组3：效应细胞自发释放LDH；

[0083] 对照组4：空白培养基的背景；

[0084] 对照组5：体积校准的背景，空白培养基加入一定体积的细胞裂解液。

[0085] 检测方法：采用CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒（Promega公司）进行检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶（LDH）。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐（INT）转化为红色的甲臜（formazan）。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。

[0086] 细胞毒性计算公式为：

[0087]

[0088] 实验结果如图6、图7和表1所示，本发明诱导的NK细胞和对照组的NK细胞对肿瘤细胞HELA和LOVO均表现出显著的特异性细胞毒性作用，但是前者的细胞毒性作用要高于后者，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。其中本发明诱导的NK细胞在效靶比20:1时对HELA的细胞毒性高达94.25％，对LOVO的细胞毒性为91.24%，而对照组NK细胞对HELA的细胞毒性为70.32％，对LOVO的细胞毒性为64.35%。

[0089] 表1 本发明NK细胞和对照组NK细胞对肿瘤细胞系的体外杀伤作用

[0090] 。