一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法转让专利
申请号 : CN202210015326.6
文献号 : CN114525237B
文献日 : 2023-01-13
发明人 : 李刚 , 汪珂 , 于言 , 韩日 , 王伟佳
申请人 : 南方医科大学南方医院(CN)
摘要 :
本发明提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，是将获取的鼻息肉组织处理得到细胞沉淀，再将细胞沉淀依次在扩增培养基和分化培养基中进行培养。本发明成功建立了一种鼻粘膜类器官诱导分化模型，形成一个标准规范化上皮类器官培养体系。该体系可以使通过鼻息肉获得的鼻粘膜原代上皮细胞在体外持续扩增传代、分化发育超过60天，成为同时具有长期增殖及多细胞群分化能力的上呼吸道类器官。
权利要求 :
1.一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：是将获取的鼻息肉组织处理得到细胞沉淀，再将细胞沉淀依次在扩增培养基和分化培养基中进行培养；
所述方法具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的鼻息肉组织表面粘液先去除，然后将组织置于含2%（v/v）双抗的生理盐水中反复振荡洗涤几次；
3
步骤2，将洗涤后的组织加入HBSS缓冲液，15min内将其处理成1 2mm的组织碎块；
~
步骤3，在组织碎块中加入消化液 I，于 37℃恒温消化1 3 h，之后加入HBSS 缓冲液终~止消化，离心后保留沉淀；
步骤4，在步骤3获得的沉淀中加入消化液 II，于37℃恒温消化 8 12min 后加入 HBSS ~缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；
步骤5，在步骤4获得的沉淀中加入HBSS 缓冲液重悬沉淀，用 100μm 滤网过滤并离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀；
步骤6，在鼻粘膜上皮细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解 ，之后加入HBSS 缓冲液终止裂解，离心后获得细胞沉淀；
步骤7，在细胞沉淀中加入预冷的Advanced DMEM/F12 培养基混匀，再加入基质胶混匀，形成胶滴后接种于培养皿中静置，凝固后于37℃恒温倒置一段时间，之后加入扩增培养基于37℃、5%CO2条件下扩增培养5~7天，每间隔 2‑3 天更换一次扩增培养基；
步骤8，扩增培养后在体系中加入分化培养基继续培养15d，分化培养基隔天更换一次，分化培养15天后使用分化培养基持续培养超过60天，即得；
所述步骤3中消化液I按照终浓度的组成为：100 120U/mL的hyaluronidase，200 250U/~ ~mL的collagenase III，10 15%的FBS；
~
所述步骤4中消化液II按照终浓度的组成为：0.1 0.2mg/mL的deoxyrubonuclease，10~ ~
15ng/mLEGF，10 15%的FBS；
~
所述扩增培养基按照终浓度组成为：不含Vit‑A的B27，0.5‑2×；N‑acetylysteine，1‑
3mM；EGF，50‑500ng/mL；Noggin，50‑500ng/mL；R‑spondin 1，50‑1000ng/mL；A83‑01，200‑
500nM；Nicotinamide，10‑50mM；Glutmax，1‑5×；Gastrin，10nM‑50nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1‑3×；SB202190，10‑50μM；CHIR99021，1‑4uM；FGF4，100‑600ng/mL；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中；
所述分化培养基按照终浓度组成为：不含Vit‑A的B27，0.5‑2×；N‑acetylysteine，1‑
3mM；EGF，10 100ng/mL；Noggin，50‑500ng/mL；R‑spondin 1，50‑1000ng/mL；A83‑01，200‑~
500nM；Nicotinamide，10‑50mM；Glutmax，1‑5×；Gastrin，10nM‑50nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1‑3×；SB202190，10‑50μM； Insulin，2 5μg/mL；Hydro‑cortisone，10 50nM；
~ ~
Transferrin，1 5μg/mL；Epinephrine，1 3μM；Bovine brain extract，0.1 0.5%；Retinoic ~ ~ ~acid，5 20nM；dexamethasone，50 80nM； 8‑bromo‑cAMP，0.1 0.2mM；以上成分均溶于DMEM/~ ~ ~F12培养液中。
2.根据权利要求1所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述扩增培养基按照终浓度组成为：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；
EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，
10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
3. 根据权利要求1所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述分化培养基按照终浓度组成为：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；
EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，
10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；
Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；Epinephrine，1.5μM；
Bovine brain extract，0.2%；Retinoic acid，15nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。
说明书 :
一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法。
背景技术
[0002] 既往已有众多国内外学者讨论了上呼吸道原代培养的方法，然而均无法做到长期体外培养以及维持原代细胞的分化能力。目前鼻粘膜体外模型主要分为2D原代细胞模型、2D肿瘤细胞系及器官外植体模型。2D原代单层上皮细胞间缺少细胞外基质，中断细胞间连接从而限制了细胞的分化发育，致使其不具有体内器官组织的立体结构及多种细胞类型；
2D肿瘤细胞系中许多信号通路都发生了改变，无法用作患者个体化的研究模型；而器官型外植体模型培养过程中遗传变异和不可控的环境变量导致其可重复性不高，因此上述模型在鼻粘膜上皮生理功能及相关疾病的研究中仍具有较大的局限性。类器官是指体外3D培养胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞，通过自我更新自我组织形成具有类似于来源器官组织形态结构、功能及遗传学特征的培养物，在保持基因组和蛋白质组稳定的情况下，能够长期进行体外培养。类器官的核心在于干细胞群，其具有自我组织能力，通过调节细胞‑细胞和细胞‑细胞外基质的相互作用，完成细胞群体的自发排序，最大程度上模拟器官发生发展的基本过程，能够再现来源器官的空间结构及某些特定功能(例如，排泄，过滤，神经活动，收缩)。由于正常鼻粘膜组织不易获取，可能会涉及医学伦理问题，因而导致在鼻粘膜类器官上的研究比较滞后。鼻息肉是慢性炎症导致鼻粘膜组织间隙的极度水肿，在中鼻道形成单发或多发息肉，基底细胞自我更新和定向分化干性潜能并未破坏，在去除炎性因子的干细胞培养体系内，wnt/β‑catenin信号通路激活，可自组装形成正常的鼻粘膜结构。
本发明拟利用鼻息肉手术剩余组织实现体外长期培养鼻粘膜类器官，为鼻粘膜类器官的研究提供一种新的研究思路。
2D肿瘤细胞系中许多信号通路都发生了改变，无法用作患者个体化的研究模型；而器官型外植体模型培养过程中遗传变异和不可控的环境变量导致其可重复性不高，因此上述模型在鼻粘膜上皮生理功能及相关疾病的研究中仍具有较大的局限性。类器官是指体外3D培养胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞，通过自我更新自我组织形成具有类似于来源器官组织形态结构、功能及遗传学特征的培养物，在保持基因组和蛋白质组稳定的情况下，能够长期进行体外培养。类器官的核心在于干细胞群，其具有自我组织能力，通过调节细胞‑细胞和细胞‑细胞外基质的相互作用，完成细胞群体的自发排序，最大程度上模拟器官发生发展的基本过程，能够再现来源器官的空间结构及某些特定功能(例如，排泄，过滤，神经活动，收缩)。由于正常鼻粘膜组织不易获取，可能会涉及医学伦理问题，因而导致在鼻粘膜类器官上的研究比较滞后。鼻息肉是慢性炎症导致鼻粘膜组织间隙的极度水肿，在中鼻道形成单发或多发息肉，基底细胞自我更新和定向分化干性潜能并未破坏，在去除炎性因子的干细胞培养体系内，wnt/β‑catenin信号通路激活，可自组装形成正常的鼻粘膜结构。
本发明拟利用鼻息肉手术剩余组织实现体外长期培养鼻粘膜类器官，为鼻粘膜类器官的研究提供一种新的研究思路。
发明内容
[0003] 针对目前鼻粘膜类器官研究技术的滞后和局限性，本发明提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法。本发明的技术方案为：
[0004] 一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，是将获取的鼻息肉组织处理得到细胞沉淀，再将细胞沉淀依次在扩增培养基和分化培养基中进行培养。
[0005] 进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
[0006] 步骤1，将获得的鼻息肉组织表面粘液先去除，然后将组织置于含2％(v/v)双抗的生理盐水中反复振荡洗涤几次；
[0007] 步骤2，将洗涤后的组织加入HBSS缓冲液，15min内将其处理成1～2mm3的组织碎块；
[0008] 步骤3，在组织碎块中加入消化液I，于37℃恒温消化1～3h，之后加入HBSS缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；
[0009] 步骤4，在步骤3获得的沉淀中加入消化液II，于37℃恒温消化8～12min后加入HBSS缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；
[0010] 步骤5，在步骤4获得的沉淀中加入HBSS缓冲液重悬沉淀，用100μm滤网过滤并离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀；
[0011] 步骤6，在鼻粘膜上皮细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解，之后加入HBSS缓冲液终止裂解，离心后获得细胞沉淀；
[0012] 步骤7，在细胞沉淀中加入预冷的Advanced DMEM/F12培养基混匀，再加入基质胶混匀，形成胶滴后接种于培养皿中静置，凝固后于37℃恒温倒置一段时间，之后加入扩增培养基于37℃、5％CO2条件下扩增培养5～7天，每间隔2‑3天更换一次扩增培养基；
[0013] 步骤8，扩增培养后在体系中加入分化培养基继续培养13～18d，分化培养基隔天更换一次，即得。
[0014] 进一步地，所述步骤1中将获得的鼻息肉组织表面粘液先去除，是将鼻息肉置于8～12mMol/L的DTT溶液中作用10～20min，再用无菌医用棉签蘸取式去除表面剩余粘液。
[0015] 进一步地，所述步骤3中消化液I按照终浓度的组成为：100～120U/mL的hyaluronidase，200～250U/mL的collagenase III，10～15％的FBS。
[0016] 进一步地，所述步骤4中消化液II按照终浓度的组成为：0.1～0.2mg/mL的deoxyrubonuclease，10～15ng/mLEGF，10～15％的FBS。
[0017] 进一步地，所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，0.5‑2×；N‑acetylysteine，1‑3mM；EGF，50‑500ng/mL；Noggin，50‑500ng/mL；R‑spondin1，50‑1000ng/mL；A83‑01，200‑500nM；Nicotinamide，10‑50mM；Glutmax，1‑5×；Gastrin，10nM‑50nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1‑3×；SB202190，10‑50μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0018] 优选地，所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；
SB202190，10μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
SB202190，10μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0019] 可选地，所述扩增培养基还包括：CHIR99021，1‑4uM；FGF4，100‑600ng/mL。优选为：CHIR99021，2uM；FGF4，200ng/mL。
[0020] 进一步地，所述分化培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，0.5‑2×；N‑acetylysteine，1‑3mM；EGF，10～100ng/mL；Noggin，50‑500ng/mL；R‑spondin1，50‑1000ng/mL；A83‑01，200‑500nM；Nicotinamide，10‑50mM；Glutmax，1‑5×；Gastrin，10nM‑50nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1‑3×；SB202190，10‑50μM；Insulin，2～5μg/mL；Hydro‑cortisone，10～50nM；Transferrin，1～5μg/mL；Epinephrine，1～3μM；Bovine brain extract，0.1～
0.5％；Retinoic acid，5～20nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。
0.5％；Retinoic acid，5～20nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。
[0021] 优选地，所述分化培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；
SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2％；Retinoic acid，15nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。
SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2％；Retinoic acid，15nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。
[0022] 可选地，所述分化培养基还包括：dexamethasone，50～80nM；8‑bromo‑cAMP，0.1～0.2mM。优选为：dexamethasone，60nM；8‑bromo‑cAMP，0.1mM。
[0023] 进一步地，所述步骤7中在细胞沉淀中加入预冷的Advanced DMEM/F12培养基混匀，再加入基质胶混匀，具体为：加入的Advanced DMEM/F12培养基和基质胶量是根据所述5
细胞沉淀的总细胞数测定结果，按照10 个总细胞量/10μl基质胶的比例以及Advanced DMEM/F12培养基/基质胶＝1：1.5(v/v)的比例计。
细胞沉淀的总细胞数测定结果，按照10 个总细胞量/10μl基质胶的比例以及Advanced DMEM/F12培养基/基质胶＝1：1.5(v/v)的比例计。
[0024] 本发明利用鼻息肉手术剩余组织，采用“扩增‑分化”分段式培养法，在短期内成功培养出大量能够在体外长期培养且具有增殖‑分化功能的鼻粘膜类器官，证实了鼻息肉组织能够在体外3D环境中培养出生长稳定的上呼吸道类器官。因而，本发明成功建立了一种鼻粘膜类器官诱导分化模型，形成一个标准规范化上皮类器官培养体系。该体系可以使通过鼻息肉获得的鼻粘膜原代上皮细胞在体外持续扩增传代、分化发育超过60天，成为同时具有长期增殖及多细胞群分化能力的上呼吸道类器官。此外，本发明方法稳定性高、可操作性强，大多类器官已连续培养2个月以上仍保持良好的生物学特性，为上呼吸道纤毛功能、分泌功能，损伤修复机制，干细胞激活，肿瘤发生等机制及上呼吸道相关疾病的研究提供了理想的技术平台。
附图说明
[0025] 图1为本发明实施例1中扩增培养6天的细胞形态结构图。
[0026] 图2为本发明实施例1中分化培养15天的细胞形态结构图。
[0027] 图3为本发明实施例2中扩增培养6天的细胞形态结构图。
[0028] 图4为本发明实施例2中分化培养15天的细胞形态结构图。
[0029] 图5为本发明实施例3中扩增培养6天的细胞形态结构图。
[0030] 图6为本发明实施例3中分化培养15天的细胞形态结构图。
[0031] 图7为本发明实施例4中扩增培养第1天至分化发育至62天整个期间的细胞形态结构变化图。
[0032] 图8为本发明对比例1中6d的细胞形态结构变化图。
[0033] 图9为本发明对比例2中持续扩增培养第1天至62天整个期间的细胞形态结构变化图。
具体实施方式
[0034] 本发明实施例采用的基质胶购自美国Corning公司。
[0035] 本发明实施例采用的Insulin购自美国STEMCELL，即胰岛素。
[0036] 本发明实施例采用的Hydro‑cortisone购自美国STEMCELL，即氢化可的松。
[0037] 本发明实施例采用的Transferrin购自美国Invitrogen，即干扰素。
[0038] 本发明实施例采用的Epinephrine购自美国GIBCO公司，即肾上腺素。
[0039] 本发明实施例采用的Bovine brain extract购自瑞士Lonza，牛脑提取液。
[0040] 此外，在本发明的描述中，需要进一步说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0041] 下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0042] 实施例1
[0043] 本实施例提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，包括以下步骤：
[0044] (1)手术切下鼻息肉后向装有标本的标本瓶中迅速注入无菌生理盐水，注意盐水需淹没组织，盖紧瓶盖后贴好封口膜，放置在事先装有数个冰袋的标本运输箱里，以最快速度运送至实验室。在生物安全柜中将生理盐水换为含有RPMI‑1640培养基+2％Penicillin‑Streptomycin+2％Amphotericin B+1％FBS的组织保存液，同样注意液体需没过组织，标本瓶置于4°冰箱保存，4小时内送入实验室预处理。
[0045] (2)用眼科剪夹取组织将其置于10mMol/LDTT溶液中作用10min以去除组织表面粘液，随后用无菌医用棉签蘸取式去除表面剩余粘液(注意不要用棉签用力来回擦拭组织，易致细胞损伤)，将组织置于事先已加入5mL含2％双抗的生理盐水的15mL离心管中，反复振荡洗涤几次。
[0046] (3)将洗涤后的组织转移至6cm培养皿中并加入适量HBSS缓冲液，培养皿下垫放冰3
冻后的冰盒，用已消毒的眼科剪将组织切碎至大小1‑2mm ，切碎过程不应超过15分钟以避免组织干燥及细胞坏死。
冻后的冰盒，用已消毒的眼科剪将组织切碎至大小1‑2mm ，切碎过程不应超过15分钟以避免组织干燥及细胞坏死。
[0047] (4)将培养皿中切碎的组织块用移液枪转移至15mL离心管中，消化液I加至2‑3mL，再加入2％双抗。消化液I按照终浓度的组成为：120U/mL的hyaluronidase，250U/mL的collagenase III，10％的FBS。管口贴好封口膜后置于37℃恒温摇床消化2小时左右，每隔30分钟将离心管取出，在生物安全柜中用移液枪吹打消化的组织数次后管口贴好封口膜继续放入37℃恒温摇床中。
[0048] (5)第一次消化结束后等比例加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心，弃上清留沉淀。
[0049] (6)向沉淀中加入2‑3mL消化酶II吹打重悬，消化液II按照终浓度的组成为：0.1mg/mL的deoxyrubonuclease，10ng/mLEGF，10％的FBS。将离心管放入37℃恒温摇床消化
12min后1:1加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心。
12min后1:1加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心。
[0050] (7)离心结束弃上清，加入适量HBSS缓冲液重悬消化的组织沉淀，用100μm滤网过滤组织混合液，得到含有鼻粘膜上皮细胞的滤液。
[0051] (8)将滤液转入15mL离心管中，1100r/3min离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀。然后加入2mL红细胞裂解液，裂解5min后加入2mL HBSS终止，最后1100r/3min离心，弃上清得细胞沉淀。
[0052] (9)利用细胞计数仪测定总细胞数，全程低温冰上操作，按照105个总细胞量/10μl基质胶比例以及Advanced DMEM/F12培养基/基质胶＝1：1.5的比例，根据细胞计数结果，加入计算量的预冷Advanced DMEM/F12培养基，吹散细胞沉淀并混匀，尽可能分散为单个细胞。再加入计算量的基质胶，混匀至不分层，注意尽量不要产生气泡。
[0053] (10)用200μl移液枪(200μl枪头已于4℃预冷)将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约35μl。将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃恒温孵箱，倒置45min。加入已预热好的鼻粘膜扩增类器官培养基，约4mL。所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0054] (11)镜下观察，拍照，放入37℃恒温孵箱，每间隔2天更换一次扩增培养基。6d后换为分化培养基培养15d。分化培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；
SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2％；Retinoic acid，15nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。分化培养基隔天更换一次，视类器官生长情况进行传代。扩增期间(扩增培养基使用期)，鼻粘膜细胞不断增殖，类器官直径逐渐增大，形成致密的细胞团(图1为扩增培养6天的细胞形态结构图)；分化期(分化培养基使用期)细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官部分形成细胞排列有序且具有细胞极性的空泡细胞团(图2为分化培养15天的细胞形态结构图)。
SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2％；Retinoic acid，15nM；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。分化培养基隔天更换一次，视类器官生长情况进行传代。扩增期间(扩增培养基使用期)，鼻粘膜细胞不断增殖，类器官直径逐渐增大，形成致密的细胞团(图1为扩增培养6天的细胞形态结构图)；分化期(分化培养基使用期)细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官部分形成细胞排列有序且具有细胞极性的空泡细胞团(图2为分化培养15天的细胞形态结构图)。
[0055] 实施例2
[0056] 本实施例提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，包括以下步骤：
[0057] (1)手术切下鼻息肉后向装有标本的标本瓶中迅速注入无菌生理盐水，注意盐水需淹没组织，盖紧瓶盖后贴好封口膜，放置在事先装有数个冰袋的标本运输箱里，以最快速度运送至实验室。在生物安全柜中将生理盐水换为含有RPMI‑1640培养基+2％Penicillin‑Streptomycin+2％Amphotericin B+1％FBS的组织保存液，同样注意液体需没过组织，标本瓶置于4°冰箱保存，4小时内送入实验室预处理。
[0058] (2)用眼科剪夹取组织将其置于10mMol/LDTT溶液中作用10min以去除组织表面粘液，随后用无菌医用棉签蘸取式去除表面剩余粘液(注意不要用棉签用力来回擦拭组织，易致细胞损伤)，将组织置于事先已加入5mL含2％双抗的生理盐水的15mL离心管中，反复振荡洗涤几次。
[0059] (3)将洗涤后的组织转移至6cm培养皿中并加入适量HBSS缓冲液，培养皿下垫放冰3
冻后的冰盒，用已消毒的眼科剪将组织切碎至大小1‑2mm ，切碎过程不应超过15分钟以避免组织干燥及细胞坏死。
冻后的冰盒，用已消毒的眼科剪将组织切碎至大小1‑2mm ，切碎过程不应超过15分钟以避免组织干燥及细胞坏死。
[0060] (4)将培养皿中切碎的组织块用移液枪转移至15mL离心管中，消化液I加至2‑3mL，再加入2％双抗。消化液I按照终浓度的组成为：100U/mL的hyaluronidase，200U/mL的collagenase III，15％的FBS。管口贴好封口膜后置于37℃恒温摇床消化2小时左右，每隔30分钟将离心管取出，在生物安全柜中用移液枪吹打消化的组织数次后管口贴好封口膜继续放入37℃恒温摇床中。
[0061] (5)第一次消化结束后等比例加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心，弃上清留沉淀，
[0062] (6)向沉淀中加入2‑3mL消化酶II吹打重悬，消化液II按照终浓度的组成为：0.2mg/mL的deoxyrubonuclease，15ng/mLEGF，15％的FBS。将离心管放入37℃恒温摇床消化
10min后1:1加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心。
10min后1:1加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心。
[0063] (7)离心结束弃上清，加入适量HBSS缓冲液重悬消化的组织沉淀，用100μm滤网过滤组织混合液，得到含有鼻粘膜上皮细胞的滤液。
[0064] (8)将滤液转入15mL离心管中，1100r/3min离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀。然后加入2mL红细胞裂解液，裂解5min后加入2mL HBSS终止，最后1100r/3min离心，弃上清得细胞沉淀。
[0065] (9)利用细胞计数仪测定总细胞数，全程低温冰上操作，按照105总细胞量/10μl基质胶比例以及Advanced DMEM/F12培养基/基质胶＝1：1.5的比例，根据细胞计数结果，加入计算量的预冷Advanced DMEM/F12培养基，吹散细胞沉淀并混匀，尽可能分散为单个细胞。再加入计算量的基质胶，混匀至不分层，注意尽量不要产生气泡。
[0066] (10)用200μl移液枪(200μl枪头已于4℃预冷)将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约35μl。将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃恒温孵箱，倒置45min。加入已预热好的鼻粘膜扩增类器官培养基，约4mL。所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，2×；N‑acetylysteine，3mM；EGF，50ng/mL；Noggin，500ng/mL；R‑spondin 1，50ng/mL；A83‑01，200nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；CHIR99021，1uM；FGF4，100ng/mL；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0067] (11)镜下观察，拍照，放入37℃恒温孵箱，每间隔2天更换一次扩增培养基。6d后换为分化培养基培养15d。分化培养基按照终浓度组成包括不含Vit‑A的B27，2×；N‑acetylysteine，3mM；EGF，50ng/mL；Noggin，500ng/mL；R‑spondin 1，50ng/mL；A83‑01，200nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；
SB202190，10μM；Insulin，2μg/mL；Hydro‑cortisone，10nM；Transferrin，1μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.1％；Retinoic acid，15nM；
dexamethasone，30nM；8‑bromo‑cAMP，0.1mM。以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。分化培养基隔天更换一次。扩增期间(类器官培养基使用期)，鼻粘膜细胞不断增殖，类器官直径逐渐增大，形成致密的细胞团(图3为扩增培养6天的细胞形态结构图)；分化期(分化培养基使用期)细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官逐渐形成细胞排列有序且具有细胞极性的空泡细胞团(图4为分化培养15天的细胞形态结构图)。
SB202190，10μM；Insulin，2μg/mL；Hydro‑cortisone，10nM；Transferrin，1μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.1％；Retinoic acid，15nM；
dexamethasone，30nM；8‑bromo‑cAMP，0.1mM。以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。分化培养基隔天更换一次。扩增期间(类器官培养基使用期)，鼻粘膜细胞不断增殖，类器官直径逐渐增大，形成致密的细胞团(图3为扩增培养6天的细胞形态结构图)；分化期(分化培养基使用期)细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官逐渐形成细胞排列有序且具有细胞极性的空泡细胞团(图4为分化培养15天的细胞形态结构图)。
[0068] 实施例3
[0069] 本实施例提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，包括以下步骤：
[0070] (1)手术切下鼻息肉后向装有标本的标本瓶中迅速注入无菌生理盐水，注意盐水需淹没组织，盖紧瓶盖后贴好封口膜，放置在事先装有数个冰袋的标本运输箱里，以最快速度运送至实验室。在生物安全柜中将生理盐水换为含有RPMI‑1640培养基+2％Penicillin‑Streptomycin+2％Amphotericin B+1％FBS的组织保存液，同样注意液体需没过组织，标本瓶置于4°冰箱保存，4小时内送入实验室预处理。
[0071] (2)用眼科剪夹取组织将其置于10mMol/LDTT溶液中作用10min以去除组织表面粘液，随后用无菌医用棉签蘸取式去除表面剩余粘液(注意不要用棉签用力来回擦拭组织，易致细胞损伤)，将组织置于事先已加入5mL含2％双抗的生理盐水的15mL离心管中，反复振荡洗涤几次。
[0072] (3)将洗涤后的组织转移至6cm培养皿中并加入适量HBSS缓冲液，培养皿下垫放冰3
冻后的冰盒，用已消毒的眼科剪将组织切碎至大小1‑2mm ，切碎过程不应超过15分钟以避免组织干燥及细胞坏死。
冻后的冰盒，用已消毒的眼科剪将组织切碎至大小1‑2mm ，切碎过程不应超过15分钟以避免组织干燥及细胞坏死。
[0073] (4)将培养皿中切碎的组织块用移液枪转移至15mL离心管中，消化液I加至2‑3mL，再加入2％双抗。消化液I按照终浓度的组成为：120U/mL的hyaluronidase，250U/mL的collagenase III，10％的FBS。管口贴好封口膜后置于37℃恒温摇床消化2小时左右，每隔30分钟将离心管取出，在生物安全柜中用移液枪吹打消化的组织数次后管口贴好封口膜继续放入37℃恒温摇床中。
[0074] (5)第一次消化结束后等比例加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心，弃上清留沉淀。
[0075] (6)向沉淀中加入2‑3mL消化酶II吹打重悬，消化液II按照终浓度的组成为：0.1mg/mL的deoxyrubonuclease，10ng/mLEGF，10％的FBS。将离心管放入37℃恒温摇床消化
12min后1:1加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心。
12min后1:1加入HBSS缓冲液终止消化，1200r/5min离心。
[0076] (7)离心结束弃上清，加入适量HBSS缓冲液重悬消化的组织沉淀，用100μm滤网过滤组织混合液，得到含有鼻粘膜上皮细胞的滤液。
[0077] (8)将滤液转入15mL离心管中，1100r/3min离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀。然后加入2mL红细胞裂解液，裂解5min后加入2mL HBSS终止，最后1100r/3min离心，弃上清得细胞沉淀。
[0078] (9)利用细胞计数仪测定总细胞数，全程低温冰上操作，按照105总细胞量/10μl基质胶比例以及Advanced DMEM/F12培养基/基质胶＝1：1.5的比例，根据细胞计数结果，加入计算量的预冷Advanced DMEM/F12培养基，吹散细胞沉淀并混匀，尽可能分散为单个细胞。再加入计算量的基质胶，混匀至不分层，注意尽量不要产生气泡。
[0079] (10)用200μl移液枪(200μl枪头已于4℃预冷)将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约35μl。将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃恒温孵箱，倒置45min。加入已预热好的鼻粘膜扩增类器官培养基，约4mL。所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；CHIR99021，2uM；FGF4，200ng/mL。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0080] (11)镜下观察，拍照，放入37℃恒温孵箱，每间隔2天更换一次扩增培养基。6d后换为分化培养基培养15d。分化培养基按照终浓度组成包括：不含Vit‑A的B27，1×；N‑acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R‑spondin 1，250ng/mL；A83‑01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素‑链霉素100×溶液，1×；
SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2％；Retinoic acid，15nM；
dexamethasone，60nM；8‑bromo‑cAMP，0.1mM。以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。分化培养基隔天更换一次，视类器官生长情况进行传代。扩增期间(类器官培养基使用期)，鼻粘膜细胞不断增殖，类器官直径逐渐增大，形成致密的细胞团(图5为扩增培养6天的细胞形态结构图)；分化期(分化培养基使用期)细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官逐渐形成细胞排列有序且具有细胞极性的空泡细胞团(图6为分化培养15天的细胞形态结构图)。
SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro‑cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；
Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2％；Retinoic acid，15nM；
dexamethasone，60nM；8‑bromo‑cAMP，0.1mM。以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。分化培养基隔天更换一次，视类器官生长情况进行传代。扩增期间(类器官培养基使用期)，鼻粘膜细胞不断增殖，类器官直径逐渐增大，形成致密的细胞团(图5为扩增培养6天的细胞形态结构图)；分化期(分化培养基使用期)细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官逐渐形成细胞排列有序且具有细胞极性的空泡细胞团(图6为分化培养15天的细胞形态结构图)。
[0081] 实施例4
[0082] 本实施例提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，并且进行体外持续扩增传代、分化发育超过60天，具体步骤与实施例1的区别在于：分化培养15天后使用分化培养基持续培养，其它同实施例1。图7提供了本实施例扩增培养第1天至分化发育至62天整个期间的细胞形态结构变化图，细胞发育过程稳定而快速，到62天时细胞仍保持良好的生物学特性，显然，本方法可以使通过鼻息肉获得的鼻粘膜原代上皮细胞在体外持续扩增传代、分化发育超过60天，成为同时具有长期增殖及多细胞群分化能力的上呼吸道类器官。
[0083] 对比例1
[0084] 本对比例提供一种采用正常鼻粘膜组织衍生的上呼吸道类器官培养方法，与实施例1的区别在于：从正常鼻粘膜组织取材，其它同实施例1。图8提供了扩增培养6天的类器官形态结构图，与实施例1扩增6天的类器官在光镜下表现无明显差别(图8)，说明本发明的方法同样适用于鼻粘膜组织取材进行培养。
[0085] 对比例2
[0086] 本对比例只采用扩增方式培养鼻息肉组织，一直扩增培养至62天，没有分化培养基培养的过程，其它同实施例1，培养结果如图9所示，表明只采用扩增培养得到的类器官为囊性结构，发育缓慢，数量较少，且结构形态不完整。
[0087] 综上所述，本发明利用鼻息肉手术剩余组织能够在体外3D环境中培养出生长稳定的上呼吸道类器官。不但建立了一种鼻粘膜类器官诱导分化模型，形成一个标准规范化上皮类器官培养体系。而且该体系可以使通过鼻息肉获得的鼻粘膜原代上皮细胞在体外持续扩增传代、分化发育超过60天，成为同时具有长期增殖及多细胞群分化能力的上呼吸道类器官。
[0088] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。