一种金属纳米线生物传感器及其制备方法和应用。所述金属纳米线生物传感器包括：基底；设置在基底一侧表面的绝缘层，绝缘层上设置有凹槽；设置在凹槽中的金属纳米线，并且金属纳米线的厚度大于或等于凹槽的深度；设置在绝缘层一侧的信号采集电极，信号采集电极包括电极垫、电极连接线和纳米线连接部，纳米线连接部与金属纳米线连接，电极垫与外部电路连接；绝缘保护层，绝缘保护层设置在绝缘层、金属纳米线和信号采集电极远离基底一侧的表面并且暴露出金属纳米线的传感区和信号采集电极的电极垫。本申请提的金属纳米线生物传感器不会受到流体冲刷与微流控管道键合过程的剪切力影响，金属纳米线线体更牢固，传感器的稳定性和灵敏度更高。
绝缘层，所述绝缘层设置在所述基底一侧表面，所述绝缘层上设置有凹槽；
金属纳米线，所述金属纳米线设置在所述凹槽中，并且所述金属纳米线的厚度大于或等于所述凹槽的深度；
信号采集电极，所述信号采集电极设置在所述绝缘层远离所述基底的一侧，所述信号采集电极包括电极垫、电极连接线和纳米线连接部，所述电极垫和所述纳米线连接部分别设置在所述电极连接线的两端，所述纳米线连接部与所述金属纳米线连接，所述电极垫与外部电路连接；
绝缘保护层，所述绝缘保护层设置在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的表面并且暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫。
2.根据权利要求1所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述纳米线连接部为矩形的。
3.根据权利要求1所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述纳米线连接部的宽度为
4.根据权利要求1所述的金属纳米线生物传感器，其中，沿着从所述电极垫到所述纳米线连接部的方向，所述电极连接线的宽度逐级递减。
5.根据权利要求1所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述金属纳米线凸出所述凹槽的部分的厚度不超过所述金属纳米线的厚度的30％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述金属纳米线包括第一金属连接层和第一金属传感层，所述第一金属连接层设置在所述凹槽底面上，所述第一金属传感层设置在所述第一金属连接层远离所述凹槽底面一侧的表面。
7.根据权利要求6所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述第一金属连接层的材料选自铬和钛中的任意一种或多种，所述第一金属传感层的材料选自锌、银、镍、金和铂中的任意一种或多种。
8.根据权利要求6所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述第一金属连接层的厚度为
5nm至40nm，所述第一金属传感层的厚度为35nm至160nm。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述金属纳米线的宽度为50nm至500nm，所述金属纳米线的长度为50μm至400μm。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述凹槽的深度为40nm至150nm。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述信号采集电极包括第二金属连接层和第二金属传感层，所述第二金属连接层设置在所述绝缘层上，所述第二金属传感层设置在所述第二金属连接层远离所述绝缘层一侧的表面。
12.根据权利要求11所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述第二金属连接层的材料选自铬和钛中的任意一种或多种，所述第二金属传感层的材料选自锌、银、镍、金和铂中的任意一种或多种。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述基底的材料为刚性材料或柔性材料。
14.根据权利要求13所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述基底的材料选自硅片、玻璃和有机聚合物中的任意一种或多种。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述绝缘层的材料选自二氧化硅和氮化硅中的任意一种或多种。
16.根据权利要求15所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述绝缘层的厚度为0.1μm至2μm。
17.根据权利要求1至5中任一项所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述绝缘保护层的材料选自二氧化硅、氮化硅和光刻胶中的任意一种或多种。
18.根据权利要求17所述的金属纳米线生物传感器，其中，所述绝缘保护层包括一层或多层。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的金属纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：S10：在基底一侧表面形成绝缘层；
S40：在所述绝缘层远离所述基底一侧设置信号采集电极；
S50：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的表面设置绝缘保护层，并且使所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫暴露出。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其中，步骤S20包括：S21：在所述绝缘层远离所述基底一侧的整个表面涂覆第一光刻胶层；
S22：将所述第一光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述绝缘层的金属纳米线区；
S23：在暴露出的所述绝缘层的金属纳米线区进行刻蚀，形成所述凹槽；
S31：在所述凹槽和所述第一光刻胶层剩余区域的表面磁控溅射第一金属层；
S32：将所述第一光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的第一金属层去除，保留所述凹槽表面的第一金属层，即为所述金属纳米线。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其中，步骤S23中，刻蚀形成所述凹槽的方法为干法刻蚀或湿法刻蚀。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其中，所述干法刻蚀为深反应离子刻蚀或等离子干法刻蚀。
23.根据权利要求19所述的制备方法，其中，步骤S40包括：S41：在所述绝缘层和所述金属纳米线远离所述基底一侧的整个表面涂覆第二光刻胶层；
S42：将所述第二光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述绝缘层的信号采集电极区；
S43：在暴露的所述绝缘层的信号采集电极区和所述第二光刻胶层剩余区域的表面磁控溅射第二金属层；
S44：将所述第二光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的第二金属层去除，保留所述绝缘层的信号采集电极区表面的第二金属层，即为所述信号采集电极。
所述绝缘保护层包括二氧化硅绝缘保护层和氮化硅绝缘保护层中的任意一层或多层，步骤S50包括：S51：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第三光刻胶层；
S52：将所述第三光刻胶层的部分区域曝光和显影，使所述第三光刻胶层的剩余区域仅覆盖所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
S53：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极的暴露的表面以及所述第三光刻胶层的剩余区域的表面磁控溅射一层或多层绝缘保护层；
S54：将所述第三光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的绝缘保护层去除，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
或者，所述绝缘保护层为光刻胶绝缘保护层，步骤S50包括：S51’：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第四光刻胶层；
S52’：将所述第四光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的第四光刻胶层即为所述绝缘保护层；
或者，所述绝缘保护层包括第一绝缘保护层和第二绝缘保护层，所述第一绝缘保护层包括二氧化硅绝缘保护层和氮化硅绝缘保护层中的任意一层或多层，所述第二绝缘保护层为光刻胶绝缘保护层，步骤S50包括：S51”：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第五光刻胶层；
S52”：将所述第五光刻胶层的部分区域曝光和显影，使所述第五光刻胶层的剩余区域仅覆盖所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
S53”：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极的暴露的表面以及所述第五光刻胶层的剩余区域的表面磁控溅射二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层；
S54”：将所述第五光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层去除，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层即为所述第一绝缘保护层；
S55”：在所述第一绝缘保护层、所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫的整个表面涂覆第六光刻胶层；
S56”：将所述第六光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的第六光刻胶层即为所述第二绝缘保护层。
25.根据权利要求1至18中任一项所述的金属纳米线生物传感器在生物标志物检测中的应用。
S100：在所述金属纳米线生物传感器的暴露的金属纳米线表面引入连接物；
S200：所述连接物将生物探针分子与所述金属纳米线连接在一起；
S300：对连接有生物探针分子的所述金属纳米线进行封闭；
S400：采用步骤S300得到的连接有生物探针分子的金属纳米线生物传感器进行生物标志物检测。
27.根据权利要求26所述的应用，其中，步骤S200中的所述生物探针分子为修饰物修饰的生物探针分子；步骤S100包括采用修饰所述生物探针分子的修饰物或所述生物探针分子自身的基团充当连接物；
或者，步骤S200还包括：在所述连接物将生物探针分子与所述金属纳米线连接在一起之后，采用修饰物修饰所述生物探针分子。
28.根据权利要求27所述的应用，其中，所述修饰物选自氨基、羧基、醛基、巯基、生物素、链霉亲和素、亚甲基蓝、二茂铁、金属纳米粒子和辣根过氧化物酶中的任意一种或多种。
29.根据权利要求26所述的应用，其中，步骤S200中，连接生物探针分子的方式为氨基活化连接、羧基活化连接、醛基‑亚胺形成连接、生物素与链霉亲和素的特异性结合、巯基与金属金的自组装。
30.根据权利要求29所述的应用，其中，连接生物探针分子的反应时间为1h至4h，反应溶剂为PBS缓冲液或Tris‑HCl缓冲液，反应温度为室温至37℃。
31.根据权利要求26所述的应用，其中，所述生物探针分子包括抗体、互补链核酸探针、核酸适配体。
32.根据权利要求26所述的应用，其中，步骤S100中，所述连接物选自氨基、羧基、醛基、生物素、巯基和链霉亲和素中的任意一种或多种。
33.根据权利要求32所述的应用，其中，所述连接物的引入方式为自组装法或物理吸附法。
34.根据权利要求26所述的应用，其中，步骤S300中，对所述金属纳米线进行封闭采用的封闭试剂选自牛血清蛋白、6‑巯基‑1‑己醇和甘氨酸中的任意一种或多种；溶剂为PBS缓冲液或Tris‑HCl缓冲液；封闭时间为10min至1h。
35.根据权利要求26所述的应用，其中，步骤S400包括：将含有待检测生物标志物的样本与所述金属纳米线生物传感器的金属纳米线接触，静置孵育，使用电化学方法通过信号采集电极采集电学数据，换算得到样本中待检测生物标志物的浓度。
36.根据权利要求35所述的应用，其中，所述电化学方法包括循环伏安法、电化学阻抗法、时间‑电流曲线、差分脉冲伏安法、差分常规脉冲伏安法、方波伏安法、交流伏安法。
37.根据权利要求35所述的应用，其中，所述待检测生物标志物包括心肌肌钙蛋白cTnI、前列腺特异性抗原PSA、表面活性蛋白SPA、miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA、ssDNA、雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸、尿酸。
一种金属纳米线生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本申请涉及但不限于生物测试技术领域，尤指一种金属纳米线生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 纳米线生物传感器是一类新型高灵敏度生物检测器件。与常规基于电阻抗的传感器相比，其纳米尺度的线宽使其具有更明显的表面电荷效应、更快的物质转移速度以及与待测物质尺度更相近的双电子层电容。基于其优异的电学性能，纳米线生物传感器被应用于微量生物标志物的定量检测中，对于癌症、心血管等重大疾病的早期诊断、治疗与预后具有重要意义。通过在纳米线表面固定单链核酸、核酸适配体或抗体等生物探针分子，可以实现不同生物标志物的检测，例如使用固定互补链核酸探针的金纳米线传感器可以实现低浓度miRNA的检测等，有望进一步提高检测的灵敏度，满足更多疾病预防、治疗与愈后的生物指标诊断需求。
发明内容
[0003] 以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制本申请的保护范围。
[0004] 本申请提供了一种金属纳米线生物传感器，所述金属纳米线生物传感器包括：
[0005] 基底；
[0006] 绝缘层，所述绝缘层设置在所述基底一侧表面，所述绝缘层上设置有凹槽；
[0007] 金属纳米线，所述金属纳米线设置在所述凹槽中，并且所述金属纳米线的厚度大于或等于所述凹槽的深度；
[0008] 信号采集电极，所述信号采集电极设置在所述绝缘层远离所述基底的一侧，所述信号采集电极包括电极垫、电极连接线和纳米线连接部，所述电极垫和所述纳米线连接部分别设置在所述电极连接线的两端，所述纳米线连接部与所述金属纳米线连接，所述电极垫与外部电路连接；
[0009] 绝缘保护层，所述绝缘保护层设置在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的表面并且暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫。
[0010] 在本申请的实施例中，所述纳米线连接部可以为矩形的。
[0011] 在本申请的实施例中，所述纳米线连接部的宽度可以为100μm至500μm。
[0012] 在本申请的实施例中，沿着从所述电极垫到所述纳米线连接部的方向，所述电极连接线的宽度可以逐级递减。
[0013] 在本申请的实施例中，所述金属纳米线凸出所述凹槽的部分的厚度可以不超过所述金属纳米线的厚度的30％。
[0014] 在本申请的实施例中，所述金属纳米线可以包括第一金属连接层和第一金属传感层，所述第一金属连接层设置在所述凹槽底面上，所述第一金属传感层设置在所述第一金属连接层远离所述凹槽底面一侧的表面。
[0015] 在本申请的实施例中，所述第一金属连接层的材料可以选自铬和钛中的任意一种或多种，所述第一金属传感层的材料选自锌、银、镍、金和铂中的任意一种或多种。
[0016] 在本申请的实施例中，所述第一金属连接层的厚度可以为5nm至40nm，所述第一金属传感层的厚度可以为35nm至160nm。
[0017] 在本申请的实施例中，所述金属纳米线的宽度可以为50nm至500nm，所述金属纳米线的长度可以为50μm至400μm。
[0018] 在本申请的实施例中，所述凹槽的深度可以为40nm至150nm。
[0019] 在本申请的实施例中，所述信号采集电极可以包括第二金属连接层和第二金属传感层，所述第二金属连接层设置在所述绝缘层上，所述第二金属传感层设置在所述第二金属连接层远离所述绝缘层一侧的表面。
[0020] 在本申请的实施例中，所述第二金属连接层的材料可以选自铬和钛中的任意一种或多种，所述第二金属传感层的材料可以选自锌、银、镍、金和铂中的任意一种或多种。
[0021] 在本申请的实施例中，所述基底的材料可以为刚性材料或柔性材料。
[0022] 在本申请的实施例中，所述基底的材料可以选自硅片、玻璃和有机聚合物中的任意一种或多种。
[0023] 在本申请的实施例中，所述绝缘层的材料可以选自二氧化硅和氮化硅中的任意一种或多种。
[0024] 在本申请的实施例中，所述绝缘层的厚度可以为0.1μm至2μm。
[0025] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层的材料可以选自二氧化硅、氮化硅和光刻胶中的任意一种或多种。
[0026] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层可以包括一层或多层。
[0027] 本申请还提供了如上所述的金属纳米线生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
[0028] S10：在基底一侧表面形成绝缘层；
[0029] S20：在所述绝缘层远离所述基底一侧设置凹槽；
[0030] S30：在所述凹槽中设置金属纳米线；
[0031] S40：在所述绝缘层远离所述基底一侧设置信号采集电极；
[0032] S50：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的表面设置绝缘保护层，并且使所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫暴露出。
[0033] 在本申请的实施例中，步骤S20可以包括：
[0034] S21：在所述绝缘层远离所述基底一侧的整个表面涂覆第一光刻胶层；
[0035] S22：将所述第一光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述绝缘层的金属纳米线区；
[0036] S23：在暴露出的所述绝缘层的金属纳米线区进行刻蚀，形成所述凹槽；
[0037] 步骤S30可以包括：
[0038] S31：在所述凹槽和所述第一光刻胶层剩余区域的表面磁控溅射第一金属层；
[0039] S32：将所述第一光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的第一金属层去除，保留所述凹槽表面的第一金属层，即为所述金属纳米线；
[0040] 任选地，步骤S23中，刻蚀形成所述凹槽的方法为干法刻蚀或湿法刻蚀；还任选地，所述干法刻蚀为深反应离子刻蚀或等离子干法刻蚀。
[0041] 在本申请的实施例中，步骤S40可以包括：
[0042] S41：在所述绝缘层和所述金属纳米线远离所述基底一侧的整个表面涂覆第二光刻胶层；
[0043] S42：将所述第二光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述绝缘层的信号采集电极区；
[0044] S43：在暴露的所述绝缘层的信号采集电极区和所述第二光刻胶层剩余区域的表面磁控溅射第二金属层；
[0045] S44：将所述第二光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的第二金属层去除，保留所述绝缘层的信号采集电极区表面的第二金属层，即为所述信号采集电极。
[0046] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层包括二氧化硅绝缘保护层和氮化硅绝缘保护层中的任意一层或多层，步骤S50可以包括：
[0047] S51：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第三光刻胶层；
[0048] S52：将所述第三光刻胶层的部分区域曝光和显影，使所述第三光刻胶层的剩余区域仅覆盖所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
[0049] S53：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极的暴露的表面以及所述第三光刻胶层的剩余区域的表面磁控溅射一层或多层绝缘保护层；
[0050] S54：将所述第三光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的绝缘保护层去除，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫。
[0051] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层为光刻胶绝缘保护层，步骤S50可以包括：
[0052] S51’：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第四光刻胶层；
[0053] S52’：将所述第四光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的第四光刻胶层即为所述绝缘保护层。
[0054] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层包括第一绝缘保护层和第二绝缘保护层，所述第一绝缘保护层包括二氧化硅绝缘保护层和氮化硅绝缘保护层中的任意一层或多层，所述第二绝缘保护层为光刻胶绝缘保护层，步骤S50可以包括：
[0055] S51”：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第五光刻胶层；
[0056] S52”：将所述第五光刻胶层的部分区域曝光和显影，使所述第五光刻胶层的剩余区域仅覆盖所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
[0057] S53”：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极的暴露的表面以及所述第五光刻胶层的剩余区域的表面磁控溅射二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层；
[0058] S54”：将所述第五光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层去除，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层即为所述第一绝缘保护层；
[0059] S55”：在所述第一绝缘保护层、所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫的整个表面涂覆第六光刻胶层；
[0060] S56”：将所述第六光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的第六光刻胶层即为所述第二绝缘保护层。
[0061] 本申请还提供了如上所述的金属纳米线生物传感器在生物标志物检测中的应用。
[0062] 在本申请的实施例中，所述应用可以包括：
[0063] S100：在所述金属纳米线生物传感器的暴露的金属纳米线表面引入连接物；
[0064] S200：所述连接物将生物探针分子与所述金属纳米线连接在一起；
[0065] S300：对连接有生物探针分子的所述金属纳米线进行封闭；
[0066] S400：采用步骤S300得到的连接有生物探针分子的金属纳米线生物传感器进行生物标志物检测。
[0067] 在本申请的实施例中，步骤S200中的所述生物探针分子可以为修饰物修饰的生物探针分子。
[0068] 在本申请的实施例中，步骤S100可以包括采用修饰所述生物探针分子的修饰物或所述生物探针分子自身的基团充当连接物。
[0069] 在本申请的实施例中，步骤S200还可以包括：在所述连接物将生物探针分子与所述金属纳米线连接在一起之后，采用修饰物修饰所述生物探针分子。
[0070] 在本申请的实施例中，所述修饰物可以选自氨基、羧基、醛基、巯基、生物素、链霉亲和素、亚甲基蓝、二茂铁、金属纳米粒子和辣根过氧化物酶中的任意一种或多种。
[0071] 在本申请的实施例中，步骤S200中，连接生物探针分子的方式可以为氨基活化连接、羧基活化连接、醛基‑亚胺形成连接、生物素与链霉亲和素的特异性结合、巯基与金属金的自组装。
[0072] 在本申请的实施例中，连接生物探针分子的反应时间可以为1h至4h，反应溶剂可以为PBS缓冲液或Tris‑HCl缓冲液，反应温度可以为室温至37℃。
[0073] 在本申请的实施例中，所述生物探针分子可以包括抗体、互补链核酸探针、核酸适配体。
[0074] 在本申请的实施例中，步骤S100中，所述连接物可以选自氨基、羧基、醛基、生物素、巯基和链霉亲和素中的任意一种或多种。
[0075] 在本申请的实施例中，所述连接物的引入方式可以为自组装法或物理吸附法。
[0076] 在本申请的实施例中，步骤S300中，对所述金属纳米线进行封闭采用的封闭试剂可以选自牛血清蛋白、6‑巯基‑1‑己醇和甘氨酸中的任意一种或多种；溶剂为PBS缓冲液或Tris‑HCl缓冲液；封闭时间可以为10min至1h。
[0077] 在本申请的实施例中，步骤S400可以包括：将含有待检测生物标志物的样本与所述金属纳米线生物传感器的金属纳米线接触，静置孵育，使用电化学方法通过信号采集电极采集电学数据，换算得到样本中待检测生物标志物的浓度。
[0078] 在本申请的实施例中，所述电化学方法可以包括循环伏安法、电化学阻抗法、时间‑电流曲线、差分脉冲伏安法、差分常规脉冲伏安法、方波伏安法、交流伏安法。
[0079] 在本申请的实施例中，所述待检测生物标志物可以包括心肌肌钙蛋白cTnI、前列腺特异性抗原PSA、表面活性蛋白SPA、miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA、ssDNA、雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸、尿酸。
[0080] 本申请提供了一种新的金属纳米线生物传感器结构设计与加工工艺方案，可以实现高稳定性的金属纳米线生物传感器的快速制备，用于特定生物标志物的高灵敏度检测。具体地，通过将金属纳米线设置在凹槽中，使纳米线主体被保护于凹槽中，可以降低流体冲刷与微流控管道键合过程的剪切力影响，使金属纳米线线体更牢固。
[0081] 另外，当采用矩形纳米线连接部和/或宽度逐级递减的电极连接线时，可以降低电流热效应对纳米线体的损害。
[0082] 本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
[0083] 附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
[0084] 图1为本申请实施例的金属纳米线生物传感器的结构示意图；
[0085] 图2为本申请实施例的金属纳米线生物传感器的俯视图及其局部放大图；
[0086] 图3为本申请实施例的金属纳米线生物传感器的剖面图；
[0087] 图4为本申请实施例的金属纳米线生物传感器检测miRNA得到的测试曲线。
[0088] 附图中的标记符号的含义为：
[0089] 10‑基底；20‑绝缘层；21‑凹槽；30‑金属纳米线；40‑信号采集电极；41‑电极垫；42‑电极连接线；43‑纳米线连接部；44‑第二金属连接层；45‑第二金属传感层；50‑绝缘保护层；
具体实施方式
[0090] 为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
[0091] 纳米线生物传感器的纳米电极材料可以为金属(例如，金)或非金属。金纳米线与目前纳米电极设计中常用的硅基纳米线相比，其加工工艺更简易快捷，且可以通过金‑硫键等连接方式方便地进行表面探针修饰，避免了复杂的表面官能团化处理步骤。金纳米线生物传感器的检测原理基于表面双电层电容变化，与硅基纳米线的场效应晶体管原理不同，但都具有高灵敏度的优势。
[0092] 目前的金纳米线制备工艺主要依靠电子束光刻法，在硅基底表面溅射纳米宽度的金线。本申请的发明人发现，采用电子束光刻法制成的金纳米线线体完全暴露于硅基底表面，易受流体剪切力与微流控管道键合过程的影响而出现断裂情况。而且，目前的纳米电极结构设计存在不足，纳米线与大尺寸信号采集电极的连接处由于电流热效应易产生熔断。以上问题影响了金纳米线生物传感器使用过程中的稳定性。
[0093] 本申请实施例提供了一种金属纳米线生物传感器，如图1所示，所述金属纳米线生物传感器包括基底10、绝缘层20、金属纳米线30、信号采集电极40和绝缘保护层50。
[0094] 所述绝缘层20设置在所述基底10一侧表面，所述绝缘层20上设置有凹槽21。
[0095] 所述金属纳米线30设置在所述凹槽21中，并且所述金属纳米线30的厚度大于或等于所述凹槽21的深度。
[0096] 所述信号采集电极40设置在所述绝缘层20远离所述基底10的一侧，如图2所示，所述信号采集电极40包括电极垫41、电极连接线42和纳米线连接部43，所述电极垫41和所述纳米线连接部43分别设置在所述电极连接线42的两端，所述纳米线连接部43与所述金属纳米线30连接，所述电极垫41与外部电路连接。
[0097] 所述绝缘保护层50设置在所述绝缘层20、所述金属纳米线30和所述信号采集电极40远离所述基底一侧的表面并且暴露出所述金属纳米线30的传感区和所述信号采集电极
40的电极垫41。(图1和图2中为了示意所述信号采集电极40的位置，电极垫41附近的区域也没有被绝缘保护层50覆盖，但实际上仅有所述金属纳米线30的传感区和所述信号采集电极
40的电极垫41是暴露的，其他区域均被绝缘保护层50覆盖)。
[0098] 本申请实施例对金属纳米线生物传感器的结构进行了改进，将金属纳米线设置在凹槽中，可以降低流体冲刷与微流控管道键合过程的剪切力影响，使金属纳米线线体更牢固。
[0099] 在本申请的实施例中，所述凹槽的深度可以为成40nm至150nm。
[0100] 在本申请的实施例中，所述纳米线连接部可以为矩形的。矩形的纳米线连接部可以避免电流热效应使温度过高而造成金属纳米线线体熔断，进而提高金属纳米线在通电状态下的稳定性。
[0101] 在本申请的实施例中，所述纳米线连接部的宽度可以为100μm至500μm。
[0102] 在本申请的实施例中，沿着从所述电极垫到所述纳米线连接部的方向，所述电极连接线的宽度逐级递减，这种设计可以减小线路由大尺度直接变为微小尺度带来的热效应影响，进而提高金属纳米线在通电状态下的稳定性。
[0103] 在本申请的实施例中，所述金属纳米线凸出所述凹槽的部分的厚度不超过所述金属纳米线的厚度的30％。例如，所述金属纳米线凸出所述凹槽的部分的厚度可以为所述金属纳米线的厚度的5％、10％、15％、20％、25％或30％。
[0104] 在本申请的实施例中，所述信号采集电极可以设置在所述绝缘层远离所述基底一侧的表面。
[0105] 在本申请的实施例中，所述金属纳米线可以包括第一金属连接层和第一金属传感层，所述第一金属连接层设置在所述凹槽底面上，所述第一金属传感层设置在所述第一金属连接层远离所述凹槽底面一侧的表面。
[0106] 在本申请的实施例中，所述第一金属连接层的材料可以选自铬和钛中的任意一种或多种，所述第一金属传感层的材料可以选自锌、银、镍、金和铂中的任意一种或多种。
[0107] 在本申请的实施例中，所述第一金属连接层的厚度可以为5nm至40nm，所述第一金属传感层的厚度可以为35nm至160nm。
[0108] 在本申请的实施例中，所述金属纳米线宽度可以为50nm至500nm，长度可以为50μm至400μm。
[0109] 在本申请的实施例中，如图3所示，所述信号采集电极40可以包括第二金属连接层44和第二金属传感层45，所述第二金属连接层44设置在所述第一绝缘层上20，所述第二金属传感层45设置在所述第二金属连接层44远离所述绝缘层20一侧的表面。
[0110] 在本申请的实施例中，所述第二金属连接层的材料可以选自铬和钛中的任意一种或多种，所述第二金属传感层的材料可以选自锌、银、镍、金和铂中的任意一种或多种。
[0111] 在本申请的实施例中，所述基底的材料可以为刚性材料或柔性材料，例如，所述基底的材料可以选自硅片、玻璃和有机聚合物中的任意一种或多种。
[0112] 在本申请的实施例中，所述绝缘层的材料可以选自二氧化硅和氮化硅中的任意一种或多种。
[0113] 在本申请的实施例中，所述绝缘层的厚度可以为0.1μm至2μm。
[0114] 在本申请的实施例中，绝缘保护层的材料可以选自二氧化硅、氮化硅和光刻胶中的任意一种或多种。
[0115] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层可以包括一层或多层；例如，所述绝缘保护层可以包括一层，可以为二氧化硅绝缘保护层、氮化硅绝缘保护层或光刻胶绝缘保护层；又例如，所述绝缘保护层可以包括两层，可以为氮化硅绝缘保护层与光刻胶绝缘保护层的复合绝缘保护层。
[0116] 本申请实施例还提供了如上所述的金属纳米线生物传感器的制备方法，包括：
[0117] S10：在基底一侧表面形成绝缘层；
[0118] S20：在所述绝缘层远离所述基底一侧设置凹槽；
[0119] S30：在所述凹槽中设置金属纳米线；
[0120] S40：在所述绝缘层远离所述基底一侧设置信号采集电极；
[0121] S50：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的表面设置绝缘保护层，并且使所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫暴露出。
[0122] 在本申请的实施例中，步骤S20可以包括：
[0123] S21：在所述绝缘层远离所述基底一侧的整个表面涂覆第一光刻胶层；
[0124] S22：将所述第一光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述绝缘层的金属纳米线区；
[0125] S23：在暴露出的所述绝缘层的金属纳米线区进行刻蚀，形成所述凹槽；
[0126] 步骤S30可以包括：
[0127] S31：在所述凹槽和所述第一光刻胶层剩余区域的表面磁控溅射第一金属层；
[0128] S32：将所述第一光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的第一金属层去除，保留所述凹槽表面的第一金属层，即为所述金属纳米线。
[0129] 在本申请的描述中，术语“金属纳米线区”定义为待形成金属纳米线的区域，“信号采集电极区”定义为待形成信号采集电极的区域。
[0130] 在本申请的实施例中，步骤S23中，刻蚀形成所述凹槽的方法可以为干法刻蚀或湿法刻蚀。
[0131] 在本申请的实施例中，所述干法刻蚀可以为深反应离子刻蚀(DRIE，例如深硅刻蚀)或等离子干法刻蚀(RIE)。
[0132] 在本申请的实施例中，所述湿法刻蚀可以采用HF等酸溶液对而二氧化硅、氮化硅进行刻蚀。
[0133] 在本申请的实施例中，所述第一光刻胶层的厚度可以为300nm至1000nm。
[0134] 在本申请的实施例中，所述第一光刻胶层采用的光刻胶可以为正性电子束光刻胶，例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、ZEP520、RE650等。
[0135] 在本申请的实施例中，步骤S40可以包括：
[0136] S41：在所述绝缘层和所述金属纳米线远离所述基底一侧的整个表面涂覆第二光刻胶层；
[0137] S42：将所述第二光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述绝缘层的信号采集电极区；
[0138] S43：在暴露的所述绝缘层的信号采集电极区和所述第二光刻胶层剩余区域的表面磁控溅射第二金属层；
[0139] S44：将所述第二光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的第二金属层去除，保留所述绝缘层的信号采集电极区表面的第二金属层，即为所述信号采集电极。
[0140] 在本申请的实施例中，所述第二光刻胶层的厚度可以为1.0μm至2.5μm。
[0141] 在本申请的实施例中，所述第二光刻胶层采用的光刻胶可以为负性电子束光刻胶，例如，AR‑N 4340、SU‑8等。
[0142] 在本申请的实施例中，光刻胶曝光、显影、去除可以采用LIFT OFF法。
[0143] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层可以包括二氧化硅绝缘保护层和氮化硅绝缘保护层中的任意一层或多层，此时所述步骤S50可以包括：
[0144] S51：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第三光刻胶层；
[0145] S52：将所述第三光刻胶层的部分区域曝光和显影，使所述第三光刻胶层的剩余区域仅覆盖所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
[0146] S53：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极的暴露的表面以及所述第三光刻胶层的剩余区域的表面磁控溅射一层或多层绝缘保护层；
[0147] S54：将所述第三光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的绝缘保护层去除，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫。
[0148] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层可以为光刻胶绝缘保护层，此时步骤S50可以包括：
[0149] S51’：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第四光刻胶层；
[0150] S52’：将所述第四光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的第四光刻胶层即为所述绝缘保护层。
[0151] 在本申请的实施例中，所述绝缘保护层可以包括第一绝缘保护层和第二绝缘保护层，所述第一绝缘保护层包括二氧化硅绝缘保护层和氮化硅绝缘保护层中的任意一层或多层，所述第二绝缘保护层为光刻胶绝缘保护层，此时步骤S50可以包括：
[0152] S51”：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极远离所述基底一侧的暴露的整个表面涂覆第五光刻胶层；
[0153] S52”：将所述第五光刻胶层的部分区域曝光和显影，使所述第五光刻胶层的剩余区域仅覆盖所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫；
[0154] S53”：在所述绝缘层、所述金属纳米线和所述信号采集电极的暴露的表面以及所述第五光刻胶层的剩余区域的表面磁控溅射二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层；
[0155] S54”：将所述第五光刻胶层剩余区域的光刻胶连同其表面的二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层去除，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的二氧化硅绝缘保护层和/或氮化硅绝缘保护层即为所述第一绝缘保护层；
[0156] S55”：在所述第一绝缘保护层、所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫的整个表面涂覆第六光刻胶层；
[0157] S56”：将所述第六光刻胶层的部分区域曝光和显影，暴露出所述金属纳米线的传感区和所述信号采集电极的电极垫，剩余的第六光刻胶层即为所述第二绝缘保护层。
[0158] 本申请实施例还提供了如上所述的金属纳米线生物传感器在生物标志物检测中的应用。
[0159] 在本申请的实施例中，所述应用可以包括：
[0160] S100：在所述金属纳米线生物传感器的暴露的金属纳米线表面引入连接物；
[0161] S200：所述连接物将生物探针分子与所述金属纳米线连接在一起；
[0162] S300：对连接有生物探针分子的所述金属纳米线进行封闭；
[0163] S400：采用步骤S300得到的连接有生物探针分子的金属纳米线生物传感器进行生物标志物检测。
[0164] 本申请实施例的应用方法通过在金属纳米线表面固定特定生物探针分子，可以实现对样本中特定生物标志物的特异性识别与捕获，从而产生可供检测的电学信号。
[0165] 在本申请的实施例中，步骤S200中的所述生物探针分子可以为修饰物修饰的生物探针分子。
[0166] 当生物探针分子为修饰物修饰的生物探针分子时，步骤S100可以包括采用修饰所述生物探针分子的修饰物充当连接物。
[0167] 在本申请的实施例中，步骤S100可以包括采用所述生物探针分子自身的基团充当连接物。
[0168] 在本申请的实施例中，步骤S200还可以包括：在所述连接物将生物探针分子与所述金属纳米线连接在一起之后，采用修饰物修饰所述生物探针分子。
[0169] 在本申请的实施例中，所述修饰物可以选自氨基、羧基、醛基、巯基、生物素、链霉亲和素、亚甲基蓝、二茂铁、金属纳米粒子和辣根过氧化物酶中的任意一种或多种。
[0170] 在本申请的实施例中，步骤S200中，连接生物探针分子的方式可以为氨基活化连接、羧基活化连接、醛基‑亚胺形成连接、生物素与链霉亲和素的特异性结合、巯基与金属金的自组装(共价修饰)。
[0171] 在本申请的实施例中，连接生物探针分子的反应时间可以为1h至4h，反应溶剂可以为磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液，反应温度可以为室温至37℃。
[0172] 在本申请的实施例中，所述生物探针分子可以包括抗体、互补链核酸探针、核酸适配体等。
[0173] 在本申请的实施例中，步骤S100中，所述连接物可以选自氨基、羧基、醛基、生物素、巯基和链霉亲和素中的任意一种或多种。
[0174] 在本申请的实施例中，所述连接物中的氨基、羧基可以为生物探针分子自身原有的氨基、羧基。
[0175] 在本申请的实施例中，所述连接物的引入方式可以为自组装法或物理吸附法。
[0176] 当金属纳米线为金纳米线时，自组装法可以利用金‑硫键自组装，将金纳米线于巯基试剂(11‑巯基十一烷酸等)的溶液中孵育，从而在金表面引入连接物。或是利用巯基修饰的生物探针分子，通过金‑硫键自组装直接固定于金纳米线表面。反应时间可以为1h至24h，反应溶剂可以是PBS缓冲液、Tris‑HCl缓冲液等。
[0177] 物理吸附法可以采用连接物修饰的BSA等大分子蛋白溶液处理金纳米线部分，利用物理吸附在金纳米线表面引入连接物。反应时间可以为1h至4h，反应温度可以为室温至37℃，反应溶剂可以是PBS缓冲液、Tris‑HCl缓冲液等。
[0178] 在本申请的实施例中，步骤S300对连接有生物探针分子的所述金属纳米线进行封闭可以减小表面非特异性吸附影响。封闭试剂选自牛血清蛋白(BSA)、6‑巯基‑1‑己醇(MCH)和甘氨酸中的任意一种或多种；溶剂可以为PBS缓冲液、Tris‑HCl缓冲液；封闭时间可以为10min至1h。
[0179] 在本申请的实施例中，步骤S400可以包括：将含有待检测生物标志物的样本与所述金属纳米线生物传感器的金属纳米线接触，静置孵育(例如0.5h至2h)，使用电化学方法通过信号采集电极采集电学数据，换算得到样本中待检测生物标志物的浓度。
[0180] 在本申请的实施例中，所述电化学方法可以包括循环伏安法、电化学阻抗法、时间‑电流曲线、差分脉冲伏安法、差分常规脉冲伏安法、方波伏安法、交流伏安法。
[0181] 在本申请的实施例中，所述待检测生物标志物可以包括大分子蛋白质、核酸与小分子激素、代谢物类生物标志物，例如，心肌肌钙蛋白cTnI、前列腺特异性抗原PSA、表面活性蛋白SPA、miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA、ssDNA、雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸、尿酸。等。
[0182] 以下为本申请的一个示例性实施例，为实现miRNA检测的金纳米线生物传感器。
[0183] 本实施例的金纳米线生物传感器包括：基底、第一绝缘层、金属纳米线、信号采集电极和光刻胶保护层；
[0184] 其中，所述基底为硅片；
[0185] 所述第一绝缘层设置在所述基底一侧表面，为二氧化硅绝缘层，厚度为1μm；所述第一绝缘层上设置有凹槽，凹槽的深度约为80nm；
[0186] 所述金属纳米线设置在所述凹槽中，由第一金属连接层和第一金属传感层组成，所述第一金属连接层设置在所述凹槽底面上，所述第一金属传感层设置在所述第一金属连接层远离所述凹槽底面一侧的表面；第一金属连接层为钛，厚度为10nm；第一金属传感层为金，厚度为90nm；所述金属纳米线的宽度为300nm，长度为100μm，厚度为100nm；
[0187] 所述信号采集电极的纳米线连接部的宽度为20μm。
[0188] 本实施例的金纳米线生物传感器的制备方法包括：
[0189] 在硅片基底上，通过氧化炉处理，在硅片基底表面生长1μm厚的二氧化硅绝缘层；在二氧化硅绝缘层表面旋涂正性电子束光刻胶(聚甲基丙烯酸甲酯)后，进行电子束曝光，显影后进行深硅刻蚀处理，在曝光处形成约80nm深的凹槽；然后进行磁控溅射，顺序溅射
10nm厚度的钛与90nm厚度的金，形成金纳米线。去除剩余的正性电子束光刻胶之后在远离硅片一侧表面旋涂负性光刻胶(AR‑N 4340)，借助印有信号采集电极式样的掩模铬板进行部分曝光，显影后使用磁控溅射的方式顺序溅射10nm厚度的铬或钛合金与90nm厚度的金，去除剩余的负性光刻胶后得到信号采集电极。然后在远离硅片一侧的表面旋涂负性光刻胶(NR9‑300PY)，通过光刻将金纳米线与信号采集电极的电极垫暴露出来，其余部分用光刻胶覆盖，作为光刻胶保护层。
[0190] 本实施例采用的生物探针分子为miRNA16完全互补序列，序列为5’‑SH‑C6‑TGGCACGCCAATATTTACGTGCTGCTATGCCG‑C6‑MB‑3‘，核酸序列长度为32nt，5’端经过巯基修饰，3‘端经过亚甲基蓝(MB)修饰。修饰完成时，此生物探针分子会形成环状结构，MB与金纳米线表面距离很近，测试时会有强烈的信号，当捕获到miRNA16后，环状结构打开，MB远离金纳米线表面，信号减弱，从而进行检测。
[0191] 本实施例采用金‑硫键自组装法进行纳米线表面的生物探针分子固定。巯基基团在使用前需要进行还原活化。将巯基修饰的核酸探针溶于浓度为0.1M的三(2一氯乙基)磷酸酯(TCEP)溶液，室温静置后加入1/10体积的3M醋酸钠溶液，3倍体积的无水乙醇，于‑80℃静置1h，然后于4℃，13000r/min转速下离心30min，去上清；所得沉淀溶于1X PBS缓冲液进行浓度定量。
[0192] 将纳米线置于浓度为1μM的巯基修饰生物探针分子溶液中孵育，之后用1X PBS缓冲液清洗，通过金‑硫键自组装将生物探针分子固定在金纳米线表面；之后用2mM的6‑巯基‑1‑己醇(MCH)进行封闭，并用Tris‑HCl清洗；经过上述步骤得到连接有生物探针分子的金纳米线生物传感器。
[0193] 本实施例通过所述的金纳米线生物传感器实现了对样本溶液中miRNA的检测。使用电化学工作站CHI660e，采用金纳米线生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极。将含有miRNA的PBS溶液(1pM)与金纳米线生物传感器室温孵育2小时，然后用去离子水冲洗干净后进行方波伏安法(SWV)测试。在测试过程中，将三电极体系插入电解质溶液(可以为PBS缓冲液、Tris‑HCl缓冲液、柠檬酸钠(Saline‑Sodium Citrate,SSC)缓冲液等溶液)中进行测试，只有金纳米线与电解质溶液直接接触。所得测试曲线如图4所示。
[0194] 可以看出，本实施例的金纳米线生物传感器可以实现对miRNA的检测。
[0195] 虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
