SRP14基因在治疗肾功能不全或肾损伤中的应用

摘要

本发明公开了SRP14基因在治疗肾功能不全或肾损伤中的应用，涉及基因治疗技术领域。本发明公开了抑制基因表达的抑制剂在制备用于治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物中的应用，本发明的研究首次发现，抑制SRP14基因的表达可以治疗肾功能不全或肾损伤疾病，本发明为治疗肾功能不全或肾损伤疾病提供了一种新的思路和策略。

权利要求

1.抑制基因表达的抑制剂在制备用于增加HK2人肾小管上皮细胞在缺氧复氧后的存活率的药物中的应用，其特征在于，所述基因选自SRP14基因；所述抑制剂是在RNA水平上抑制所述基因的表达；

所述抑制剂是在RNA水平上抑制所述基因的表达，所述抑制剂为siRNA；抑制SRP14基因的siRNA为AM16708 siRNA，参考序列：NM_001309434.1；靶标：5号外显子的第356号位点；其针对的外显子序列如下：gtga gctccaagga agtgaataag tttcagatg。

说明书

SRP14基因在治疗肾功能不全或肾损伤中的应用

[0001] 分案申请

[0002] 本分案申请是基于申请号为2020102376062，申请日为2020年3月30日，发明名称为“RPS7和SRP14基因在治疗肾功能不全或肾损伤中的应用”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

[0003] 本发明涉及基因治疗技术领域，具体而言，涉及SRP14基因在治疗肾功能不全或肾损伤中的应用。

背景技术

[0004] 肾功能不全或肾损伤(acute kidney injury，AKI)极易进展为慢性肾脏病(chronic kidney diseases，CKD)及终末期肾病(end stage renal diseases，ESRD)，肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，肾IRI)是导致AKI的重要原因，也是肾移植术后影响移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素之一。

[0005] 急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)极易进展到慢性肾脏病(chronic kidney diseases，CKD)，导致慢性肾功能不全及终末期肾病(end stage renal diseases，ESRD)，近年来该病的发病率和病死率不断提高，给家庭以及社会造成巨大伤害。尽管AKI病人的致病率和致死率较高，但AKI不是一种单一的疾病，其发病机制复杂且具体致病机理尚不清楚，缺乏早期诊断生物标记物和有效的干预靶点，这给该病的防治带来了困难。因此，研究AKI的发病新机制及寻找其可能的生物标记物和干预靶点具有重要的临床意义。目前，对于AKI发病机制的研究多聚焦于损伤后的效应阶段，而对启动机制研究尚少，因此，深入探讨AKI发病的始动机制，寻求新的早期生物标记物和治疗干预靶点是研究AKI亟待解决的问题，也是早期治疗AKI延缓CKD发生发展的前提和关键所在。

[0006] AKI发病机制复杂，其病理特征主要表现为肾小管上皮细胞损伤和死亡。肾小管上皮细胞极易发生凋亡，而该部位的损伤可导致肾脏衰竭。在AKI的早期，氧化应激、肾毒性物质诱导的肾小管上皮细胞损伤也主要以凋亡为主。因此，肾小管上皮细胞凋亡的病理生理机制一直是AKI的研究热点。在AKI发生的早期，肾小管上皮细胞凋亡与肾小管上皮细胞损伤、小鼠肾功能丧失和肾组织损害密切相关。AKI中受伤的肾脏分泌到循环中的因子还会进一步诱导心、肺、肝脏和大脑中细胞凋亡和炎症的发生，进一步导致了AKI的高发病率和死亡率，因此抑制肾小管上皮细胞凋亡是防治AKI的关键环节。尽管AKI中肾小管上皮细胞凋亡的研究取得了重大进展，针对多种细胞死亡途径的联合治疗可以提供治疗AKI的最大效益，但是目前尚未找到一种确实有效的特异性方法来防治肾小管上皮细胞凋亡。因此，不断探析凋亡通路在AKI早期的作用新机制是目前全世界肾脏病学研究者共同面临的一大难题，也是凋亡通路有关新型化合物临床使用的技术瓶颈之一。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供SRP14基因在治疗肾功能不全或肾损伤中的应用。

[0008] 本发明是这样实现的：

[0009] 第一方面，本发明实施例提供抑制基因表达的抑制剂在制备用于治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物中的应用，基因选自SRP14基因。

[0010] 本发明的研究首次发现，抑制SRP14基因的表达，可以提高肾脏缺血再灌注损伤模型细胞的存活率，说明抑制SRP14基因的表达可以治疗肾功能不全或肾损伤疾病，相应的，抑制SRP14基因表达的抑制剂可以制备成治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物，本发明为治疗肾功能不全或肾损伤疾病提供了一种新的思路和策略。

[0011] 在可选的实施方式中，所述抑制剂是在DNA水平、RNA水平上或蛋白水平上抑制所述基因的表达。

[0012] 在本发明公开的内容基础上，本领域技术人员容易想到通过多种方式抑制SRP14基因的表达，包括但不限于在RNA水平和蛋白水平上抑制表达，也可以是利用其他类似的技术手段抑制基因的表达，例如利用基因编辑技术直接改变SRP14基因的编码序列或其调控序列，使基因无法转录成RNA，即在DNA分子水平上抑制基因的表达。基于此，无论以何种方式抑制SRP14基因的表达，这对本领域技术人员来说是容易实现的，其均是属于本发明的保护范围。

[0013] 在可选的实施方式中，所述抑制剂是在RNA水平上抑制所述基因的表达。

[0014] 在可选的实施方式中，所述抑制剂为siRNA、shRNA或microRNA。

[0015] 在RNA水平上抑制基因表达的抑制剂类型包括但不限于siRNA、shRNA和microRNA，本领域技术人员容易想到使用其他类似的抑制剂在RNA水平上抑制SRP14基因的表达，基于此，采用其他类似的抑制剂在RNA水平上抑制SRP14基因的表达也是属于本发明的保护范围。

[0016] 在可选的实施方式中，siRNA、shRNA或microRNA均可以通过市场购买得到。例如针对的SRP14基因的siRNA购自Thermo fisher公司，例如：SRP14 siRNA(#AM16708，Assay ID#12804，RefSeq：NM_001309434.1，靶标：5号外显子的第356号位点，Thermo fisher，USA)；其针对的外显子序列如下：gtga gctccaagga agtgaataag tttcagatg；

[0017] 采用上述的siRNA抑制SRP14基因的表达具有较好的抑制表达的效果，但需要说明的是，本领域技术人员容易想到采用其他序列的siRNA以抑制SRP14基因的表达，无论以何种序列的siRNA抑制SRP14基因的表达，其均是属于本发明的保护范围。

[0018] 在可选的实施方式中，所述肾功能不全或肾损伤疾病是由肾脏缺血再灌注损伤所引起或导致。

[0019] 第二方面，本发明实施例提供一种治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物，其包括抑制基因表达的抑制剂，所述基因选自SRP14基因。

[0020] 本发明提供的治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物通过抑制SRP14基因的表达实现提高肾损坏细胞的存活率，进而起到治疗肾功能不全或肾损伤疾病的效果，本发明提供了一种新的治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物，目前市面上没有采用此种机理治疗肾功能不全或肾损伤疾病的相关药物，本发明是首次提出通过抑制SRP14基因的表达实现治疗肾功能不全或肾损伤疾病的药物。

[0021] 在可选的实施方式中，所述抑制剂是在DNA水平、RNA水平上或蛋白水平上抑制所述基因的表达。

[0022] 在可选的实施方式中，所述抑制剂为iRNA、shRNA或microRNA。

[0023] 在可选的实施方式中，所述肾功能不全或肾损伤疾病是由肾脏缺血再灌注损伤所引起或导致。

[0024] 在可选的实施方式中，所述肾功能不全或肾损伤疾病包括但不限于急性肾损伤(AKI)、慢性肾脏病(CKD)和终末期肾病(ESRD)，其他由肾脏缺血再灌注损伤所引起或导致的相关疾病也属于本发明的保护范围。

附图说明

[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0026] 图1为缺氧4小时后复氧24小时(I/R)增加肾小管上皮细胞中RPS7和SRP14的蛋白表达水平，而RPS7 siRNA和SRP14 siRNA分别敲减RPS7和SRP14的蛋白表达后显著降低了肾小管上皮细胞中RPS7和SRP14的蛋白表达水平；

[0027] 图2为在正常阴性对照siRNA(Negative siRNA)组中，细胞缺氧复氧后存活率明显降低，使用SRP14 siRNA或RPS7 siRNA敲减基因表达后均可显著性增加HK2人肾小管上皮细胞(图中IRI)在缺氧复氧后的存活率,Ctrl表示正常氧条件；IRI表示缺氧4h复氧24h；

[0028] 图3为流式细胞术检测PI/Annexin V染色结果表明，正常对照(Normal control)组中细胞损伤率是13.23％，单纯SRP14敲减(SKD)组细胞损伤率是11.94％，单纯RPS7敲减(RKD)组细胞损伤率是24.38％；缺氧4小时复氧24小时(IRI)后细胞损伤率显著增加到43.54％，而SRP14敲减(SKD)后IRI组细胞损伤率降低到35.97％，RPS7敲减(SKD)后IRI组细胞损伤率降低到33.06％，Ctrl表示正常氧条件；IRI表示缺氧4h复氧24h。

具体实施方式

[0029] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0030] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0031] 实施例1

[0032] 分别利用SRP14 siRNA、RPS7 siRNA敲减HK2人肾小管上皮细胞中SRP14或RPS7的表达。

[0033] 1转染SRP14 siRNA

[0034] SRP14 siRNA基因沉默按照说明书(购自Thermo fisher公司，#AM16708，Assay ID#12804，RefSeq：NM_001309434.1，)将其浓度稀释为5nmol/ml。

[0035] 1)将40pmol “SRP14 siRNA”溶于含100μl Opti‑DMEM‑F12无血清无双抗培养基的1.5ml EP管中，轻轻混匀。

[0036] 2)将7.5μl Lipo2000溶于含100μl Opti‑DMEM‑F12无血清无双抗培养基的1.5ml EP管中，混匀室温放置5分钟。

[0037] 3)将1)中溶液加入2)的溶液中，混匀放置15分钟。

[0038] 4)快到13分钟的时候，去除6孔板里的培养基，用Opti‑DMEM‑F12无血清无双抗培养基洗涤细胞一次，将上述混匀的混合物200μl加入6孔板对应的孔中，再向每孔加入Opti‑DMEM‑F12无双抗培养基各1800μl。

[0039] 5)5小时后将液体换成无双抗完全培养基。

[0040] 2转染RPS7 siRNA

[0041] RPS7 siRNA基因沉默按照说明书(购自Thermo fisher公司，#AM16708，Assay ID#142206，RefSeq：NM_001011.3，)将其浓度稀释为5nmol/ml。

[0042] 1)将75pmol“RPS7 siRNA”溶于含100μl Opti‑DMEM‑F12无血清无双抗培养基的1.5ml EP管中，轻轻混匀。

[0043] 2)将7.5μl Lipo2000溶于含100μl Opti‑DMEM‑F12无血清无双抗培养基的1.5ml EP管中，混匀室温放置5分钟。

[0044] 3)将1)中溶液加入2)的溶液中，混匀放置15分钟。

[0045] 4)快到13分钟的时候，去除6孔板里的培养基，用Opti‑DMEM‑F12无血清无双抗培养基洗涤细胞一次，将上述混匀的混合物200μl加入6孔板对应的孔中，再向每孔加入Opti‑DMEM‑F12无双抗培养基各1800μl。

[0046] 5)5小时后将液体换成无双抗完全培养基。

[0047] 2.利用美国比卢普斯罗森堡(Bilupus)公司的MIC‑101缺氧模块化孵化室系统在体外建立HK2人肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤(IRI)模型(I4h/R24h)。

[0048] 3.蛋白样品的制备

[0049] ①用液氮将研钵中预冷，将‑80℃冰箱的冻存的组织取出至研钵，一边研磨一边加液氮，保持低温。磨好的组织粉末放至1.5mlEP管。按照每1mg组织加入40μl蛋白裂解液(RIPA，碧云天生物，P0013)，磷酸酶抑制剂PMSF(碧云天生物，P1048)(RIPA:PMSF＝100:1,现配现用)。

[0050] 取出培养箱中的6孔板去除培养基后，用PBS清洗3次。每孔加入200μl RIPA裂解液(RIPA:PMSF＝100:1,现配现用)。然后用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5ml EP管中。

[0051] ②细胞超声破碎仪冰上超声10‑15次，置于冰上裂解30min。

[0052] ③4℃，13000rmp离心10min。

[0053] ④取上清液于新的1.5ml EP管中，用BCA法测蛋白浓度(BCA试剂盒，碧云天，P0009)：

[0054] 蛋白标准液稀释：取10μl蛋白标准品加入90μl PBS(磷酸盐缓冲液)稀释，得到0.5mg/ml 的蛋白标准品；

[0055] 将0.5mg/ml 的蛋白标准品按照0，1，2，4，8，12，16，20μl 加入96孔板中。每孔用PBS补足体积至20μl并混匀；样品孔每孔先加入19μl PBS，再加入1μl蛋白样品并混匀；

[0056] 所有孔加入200μl BCA工作液；

[0057] 用酶标仪于595nm波长处检测标准品和样品的吸光度；根据标准品的吸光度绘制标准曲线，进而计算样品的蛋白浓度；

[0058] 根据BCA测得的蛋白浓度，加入对应体积的RIPA使每组样品的浓度相同。

[0059] ⑤按照蛋白液：loading buffer＝4：1加入5x的loading buffer(碧云天，P0015)。

[0060] ⑥金属浴95℃5min使蛋白变性。于80℃保存

[0061] 5Western blot

[0062] ①PAGE胶的配制：

[0063] 按照SDS‑PAGE制备10％和12.5％试剂盒说明书制备分离胶和浓缩胶(SDS‑PAGE试剂盒，碧云天，P0052A)。产品内容包括分离胶缓冲液(2×)250ml，分离胶溶液(2×)250ml，彩色浓缩胶缓冲液(2×)，80ml浓缩胶溶液(2×)80ml，改良型过硫酸铵溶液(APS)8ml，实验中都采用制备的1.5mm的胶，制胶前应先将制胶玻璃板清洗干净，并自然风干。

[0064] 制备分离胶(下层胶)时，先取分离胶缓冲液和分离胶溶液各4.0ml，并加入80μl的APS，将其充分混匀；将溶液注至安置好的1.5mm制胶玻璃板中，再加入无水乙醇覆盖于分离胶上；待分离胶凝固后，弃去上层无水乙醇，并用单通道移液器吸去多余的无水乙醇。

[0065] 制备浓缩胶(上层胶)时，先取浓缩胶缓冲液和浓缩胶溶液各1.0ml，再加入20μl的APS，将其充分混匀。将溶液注入制胶玻璃板中，并插入1.5mm的带有10孔或15孔的梳齿，插入梳齿时应避免产生气泡。等待浓缩胶凝固后，可以立即使用上样电泳或者将胶置于4℃冰箱保存。

[0066] ②电泳：取出配好的胶安装于电泳架上，注意正负极。将电泳架放置于电泳槽内，倒入电泳液，其高度应超过铝线。垂直向上拔出梳子，100V预跑10min，检查有无渗漏，然后加入maker与蛋白样品。浓缩胶用80V电压，分离胶用120V，溴酚蓝在玻璃板底部上方1cm处停止电泳。

[0067] ③转膜：转膜前半小时将转膜用的夹子、滤纸、海绵浸泡于转移液中。电泳完成后取出玻璃板，轻轻拨开玻板，切去浓缩胶、溴酚蓝，根据上样数裁取相应大小的分离胶。将剩余的胶轻轻拨到滤纸上。裁剪稍大于胶的PVDF膜，用甲醇活化后轻轻盖到胶上，排出滤纸和胶之间的气泡，在转膜夹中按负极、海绵、3层滤纸、胶、膜、3层滤纸、海绵、正极的顺序组装，将夹子安装于转膜槽中，转膜槽装有预冷的1×电转液，注意正负极。100V电压转膜。目的蛋白＜100KD转60min，目的蛋白＞100kD按照分子量1KD/1min确定转膜时间。

[0068] ④封闭：转膜后，取出PVDF膜。标记正反与日期后，放入5％的实验用脱脂牛奶中室温封闭2h。

[0069] ⑤一抗孵育：封闭完成后，将膜从脱脂牛奶中取出，用1×的TBST洗膜3次5分钟，再用采用1×的TBST按照稀释比例β‑actin(1：1000,ZENBIO，#340042)、RPS7(1:1000，Abcam，#ab230862)、SRP14(1:1000，Abcam，#ab66896)配制抗体，抗体孵育盒中先加一抗再放膜，置于4℃冰箱的摇床上过夜孵育。

[0070] ⑥二抗孵育：第二天，将膜从抗体孵育盒中取出，用1×的TBST洗膜3次，每次5min。用1×的TBST按照稀释比例配制HRP标记二抗(ZENBIO，抗兔1：5000，#511203；抗鼠1：
10000，#701051)室温孵育2h。

[0071] ⑦显色曝光：二抗孵育后将膜从抗体孵育盒中取出，用1×的TBST洗膜3次，每次5min。按1:1配制电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)试剂(Millipore)，将曝光液滴加至膜表面，使用Image Quant LAS 4000mini系统自动曝光成像。

[0072] 结果见图1：缺氧4小时后复氧24小时(I/R)增加肾小管上皮细胞中RPS7和SRP14的蛋白表达水平，而RPS7 siRNA和SRP14 siRNA分别敲减RPS7和SRP14的蛋白表达后显著降低了肾小管上皮细胞中RPS7和SRP14的蛋白表达水平。

[0073] 实施例2：

[0074] 前期建模的细胞处理条件同实施例1。利用日本东仁Cell Counting Kit‑8(CCK8，货号CK04)试剂盒测细胞存活率，CCK8中的主要成分 能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。

[0075] 结果见图2：在正常阴性对照siRNA组(SilencerTM Negative Control No.1siRNA(#AM4611，与小鼠、大鼠或人类基因序列没有显著相似性即无干扰作用，Thermo fisher，USA)中，细胞缺氧复氧后存活率明显降低(图中ctrl)，使用SRP14 siRNA或RPS7 siRNA敲减基因表达后均可显著性增加HK2人肾小管上皮细胞(图中IRI)在缺氧复氧后的存活率。

[0076] 实施例3

[0077] 前期建模的细胞处理条件同实施例1。

[0078] 利用流式细胞术检测PI/Annexin V染色

[0079] 1)细胞收集：贴壁HK2细胞用胰酶消化后直接收集到5ml的离心管中，每样本细胞6
数为(1～5)×10/mL，2500r/min离心5min，弃去培养液。

[0080] 2)用预冷的PBS洗涤2次，2500r/min离心5min。

[0081] 3)用100ul的Binding Buffer重悬细胞，设置空白对照，PI单染，AnnexinV单染，实验组双染，室温下避光孵育10～15min。

[0082] 4)流式细胞仪分析结果

[0083] 5)结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图中左下象限显示活细胞，为FITC‑/PI‑；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为FITC+/PI+；而右下象限为凋亡细胞，为FITC+/PI‑。细胞损伤率结果为右上象限和右下象限之和(SKD：SRP14siRNA转染；RKD：RPS7 siRNA转染)[0084] 图3的结果显示，正常对照(Normal control)组中细胞损伤率是13.23％，单纯SRP14敲减(SKD)组细胞损伤率是11.94％，单纯RPS7敲减(RKD)组细胞损伤率是24.38％；缺氧4小时复氧24小时(IRI)后细胞损伤率显著增加到43.54％，而SRP14敲减(SKD)后IRI组细胞损伤率降低到35.97％，RPS7敲减(RKD)后IRI组细胞损伤率降低到33.06％。该结果充分说明以RPS7和/或SRP14基因为靶点，抑制其表达，可以治疗由肾脏缺血再灌注损伤所引起或导致的肾功能不全或肾损伤疾病，例如急性肾损伤(AKI)，慢性肾脏病(CKD)或终末期肾病(ESRD)等。本发明为治疗由肾脏缺血再灌注损伤所引起或导致的肾功能不全或肾损伤疾病提供了一种新的思路。

[0085] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。