本发明公开了特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用。所述体外特异性探针的结构式如下所示当R1为时，所述体外特异性探针的结构式为记为CL‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑A特异性结合；R1为时，所述体外特异性探针的结构式为记为PA‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑B特异性结合。特异性探针的反式环辛烯结构通过与带有1,2,4,5‑四嗪衍生物结构的染料发生生物正交反应，产物会产生强的荧光，再通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性。该探针以全化学合成的方法制备，原料廉价易得，制备过程简单容易合成，能够特异性识别蛋白、检测速度快，用于体外半定量分型检测单胺氧化酶。
1.特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针，其特征在于，所述体外特异性探针的结构式如下所示 其中R1为 时，所述体外特异性探针的结构式为
时，记为CL‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑A特异性结合；或R1为
PA‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑B特异性结合。
2.基于权利要求1所述的特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针的制备方法，其特征在于，当R1为 时，所述体外特异性探针的结构式为
记为CL‑TCO，具体的制备方法如下：第一步：将2‑氯‑4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚1eq.和叔丁基二甲基氯硅烷1.5eq.溶于二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护下加入滴加三乙醇胺，反应4‑10h，反应结束后加水用二氯甲烷萃取，有机相用1M稀盐酸洗涤，加入无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到叔丁基(2‑氯‑4‑甲基苯氧基)二甲基硅烷；第二步：将叔丁基(2‑氯‑4‑甲基苯氧基)二甲基硅烷1eq.溶于四氯化碳中，在冰浴条件下加入N‑溴代丁二酰亚胺1eq.，加热回流3h，加水萃取，无水硫酸钠干燥，得到(4‑(溴甲基)‑2‑氯苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷；第三步：将反式环辛烯醇1.5eq.溶于N,N‑二甲基甲酰胺，在冰浴条件下缓慢加入氢化钠2eq.，室温下搅拌30min后加入4‑羟基反式环辛烯1eq.，反应5‑
10h；反应结束后，加入水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑叔丁基(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷；第四步：将(E)‑叔丁基(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷1eq.溶于四氢呋喃中，在冰浴条件下，滴加四丁基氟化铵1.2eq.，室温下搅拌2‑10h，反应结束后加入水淬灭，用二氯甲烷萃取；用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑
2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑丙氧基)甲基)苯酚；第五步：将(E)‑2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑丙氧基)甲基)苯酚1eq.、1,3‑二溴丙烷2eq.溶于乙腈中，加入碳酸钾1eq.在氮气保护下回流3h，冷却至室温后加入N‑甲基丙‑2‑胺3eq.和碳酸钾3eq.40℃搅拌22‑48h；旋干溶剂，用水和乙酸乙酯萃取；无水硫酸钠干燥；通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终化合物CL‑TCO；当R1为 时，所述体外特异性探针的结构式为 记为PA‑TCO，具体的制备方法如下：在冰浴条件下，将4‑羟基反式环辛烯和吡啶1.2eq.溶于二氯甲烷,缓慢滴加4‑硝基苯基碳酰氯1.2eq.室温下搅拌10‑20h，反应完全后加水和二氯甲烷萃取，有机相用1M碳酸钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(4‑硝基苯基)碳酸酯；第二步：将2‑溴乙‑1‑胺6eq.溶于二氯甲烷中，在氮气保护下，缓慢滴加(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(4‑硝基苯基)碳酸酯1eq.室温下搅拌14‑
22h，反应完全后加入萃取；有机相用碳酸氢钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑溴乙基)氨基甲酸酯；第三步：将4‑羟基苯甲醛1eq.溶于四氢呋喃中，在氮气保护下，加入4‑羟基苯甲醛‑1 1.2eq.反应混合物在室温下搅拌30min后，加入醋酸钠1.4eq.反应4‑10h，饱和碳酸氢钠淬灭反应混合物，用乙酸乙酯
4x20 mL萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚；第四步：将4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚1eq.、(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑溴乙基)氨基甲酸酯1.2eq.、碳酸钾2eq.溶于乙腈溶液中，氮气保护下加热回流10‑20h，反应完全后，旋干溶剂，加入1M稀盐酸调pH至7.0，加入二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终产物PA‑TCO。
3.基于权利要求1或2中所述的活性小分子探针在检测单胺氧化酶A/B的应用，其特征在于，特异性探针的反式环辛烯结构通过与带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料发生生物正交反应，产物会产生强的荧光，再通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性，将特异性结合的蛋白‑探针溶液与带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液等体积反应，其中被特异性探针修饰的蛋白溶液浓度为1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液浓度的5‑50倍，反应时间为
5‑30min，反应温度为20‑37℃，测定单位时间内反应的荧光值作为单胺氧化酶A/B活性的评价指标。
特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与
应用
技术领域
[0001] 本发明属于有机/生物化学领域，具体涉及特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 蛋白质对所有生物体都是必不可少的物质，可以用作健康状况和疾病状态的重要生物标记，快速检测蛋白质对疾病的诊断和治疗至关重要。如今常用于检测蛋白质水平表达的方法是蛋白质免疫印迹法，这是一种用特异性抗体检测某特定抗原的蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。该检测方法存在很多弊端，如抗体孵育时间长，抗体成本高，操作过程繁杂。现有其他检测蛋白的方法有免疫荧光法，液相色谱与质谱，酶联免疫吸附测定等，这些方法仍然摆脱不了抗体，需要价格昂贵的仪器和专业的技术人员，并且难以实现定量检测等。因此，亟需开发低成本、高通量、高特异性、少用甚至无需抗体的蛋白质检测方法，用以分析复杂样本中的蛋白质。
[0003] 单胺氧化酶(MAOs)是一种表达在线粒体外膜上的蛋白，根据其对天然底物或探针结合的特异性和细胞分布等不同，MAOs分为两种亚型——MAO‑A和MAO‑B，异常表达的MAO‑A或MAO‑B均会引起神经退行性疾病和紊乱，如人体内MAO‑A的过度表达与精神分裂症和抑郁症有着重要联系，MAO‑B在帕金森病和阿兹海默症患者大脑中大量表达。然而，MAO‑A和MAO‑B高度同源，基因相似程度高达90％，活性氨基酸序列相似率高达70％，二者难以区分。因此，亟待开发特异性的区分方法，从基因层面实现对神经退行性疾病的分型与早期预诊。
发明内容
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用。探针以全化学合成的制备方法颠覆性取缔了传统检测中的抗体的孵育和应用，原料易得，制备过程简单，后续的检测过程无需繁琐的操作，能够特异性识别单胺氧化酶。
[0005] 为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
[0006] 特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针，其结构式如下所示 其中R1为
[0007] 作为改进的是，当R1为 时，所述体外特异性探针的结构式为，记为CL‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑A特异性结合；R1为
时，所述体外特异性探针的结构式为 记
为PA‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑B特异性结合。
[0008] 上述体外特异性探针的制备方法，当R1为 时，所述体外特异性探针的结构式为 记为CL‑TCO，具体的制备方法如下：
[0009] 第一步：2‑氯‑4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚的合成过程所需反应时间为4‑10h；第二步：叔丁基(2‑氯‑4‑甲基苯氧基)二甲基硅烷的合成过程加热回流时间为2‑8h；第三步：(4‑(溴甲基)‑2‑氯苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷的合成过程的反应时间为5‑
10h；第四步：(E)‑叔丁基(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷的合成过程的反应时间为2‑10h；第五步：(E)‑N‑(3‑(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑氧基)甲基)苯氧基)丙基)‑N‑甲基丙‑2‑炔‑1‑胺的合成过程将(E)‑2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑丙氧基)甲基)苯酚、1,3‑二溴丙烷溶于乙腈，加入碳酸钾，在氮气保护下回流2‑4h，冷却至室温后加入N‑甲基丙‑2‑胺，和碳酸钾在40±10℃条件下搅拌22‑48h；
[0010] 当 R 2为 时 ，所述 体 外 特 异性 探 针的 结 构 式 为记为PA‑TCO，具体的制备方法如下：
[0011] 第一步：(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(4‑硝基苯基)碳酸酯的反应过程在室温下反应10‑20h；第二步：(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑溴乙基)氨基甲酸酯的反应过程在室温下反应14‑
22h；第三步：4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚反应过程在室温下搅拌30‑90min后，加入乙酸钠反应4‑10h；第四步：(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑(4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯氧基)乙基)氨基甲酸酯反应过程中将4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚、(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑溴乙基)氨基甲酸酯、碳酸钾溶于乙腈溶液中，氮气保护下加热回流10‑20h。
[0012] 预先准备200μL的单胺氧化酶反应体系，包括pH＝6‑8的PBS缓冲液，单胺氧化酶A/B(20‑80μg/mL)，CL‑TCO/PA‑TCO(20‑50μM)，于37℃条件下震荡预孵0.5‑2h。用分离柱分离出探针‑蛋白的缀合物的过程如下：取下柱子的底部封口，松开盖子(不要取下盖子)。将柱子放在1.5‑2.0mL的收集管中，离心1‑30min，去除储存液。
[0013] 样品装载：将柱子放在新的0.5‑5.0mL的离心管里，缓慢将30‑130μL的MAO‑A/MAO‑B溶液和CL‑TCO/PA‑TCO溶液滴加在柱子压实的树脂床的中心，离心2‑30min，收集被特异性探针识别的MAO‑A/B样品。
[0014] 上述体外特异性探针在体外分型检测单胺氧化酶A/B的应用，特异性探针的反式环辛烯结构可以通过与带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料发生生物正交反应，特异性探针本身不具有荧光，带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料分子本身荧光很弱，产物会产生更强的荧光，可以通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性。将特异性结合的蛋白‑探针溶液与带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液等体积反应，其中被特异性探针修饰的蛋白溶液浓度为1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液浓度的5‑50倍，反应时间为5‑30min，反应温度为20‑37℃，反应后进行荧光扫描检测(Ex＝430nm)，荧光值增大，证明探针已成功特异性识别单胺氧化酶。
[0015] 有益效果：
[0016] 与现有技术的相比，本发明一种体外特异性探针及其制备方法与应用，具有如下优势：
[0017] 1、高特异性：所合成的特异性探针可与目标蛋白通过共价结合，特异性识别蛋白；
[0018] 2、廉价快捷：MAO‑A/MAO‑B的特异性探针CL‑TCO/PA‑TCO均可经化学合成获得，合成原料廉价易得，合成工艺简单易行；
[0019] 3、检测步骤无需复杂的抗体孵育与清洗过程，检测过程快速。
附图说明
[0020] 图1为MAO‑A的特异性探针CL‑TCO的分子结构；
[0021] 图2为MAO‑B的特异性探针PA‑TCO的分子结构；
[0022] 图3(a)为MAO‑A的特异性探针CL‑TCO的合成路线；
[0023] 图3(b)为化合物B2的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0024] 图3(c)为化合物B3的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0025] 图3(d)为化合物B5的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0026] 图3(e)为化合物B6的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0027] 图3(f)为化合物CL‑TCO的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0028] 图4(a)为MAO‑B的特异性探针PA‑TCO的合成路线；
[0029] 图4(b)为化合物C3的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0030] 图4(c)为化合物C4的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0031] 图4(d)为化合物C6的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0032] 图4(e)为化合物PA‑TCO的核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱图；
[0033] 图5为通过分子对接技术模拟特异性探针识别作用机制图；
[0034] 图6为MAO‑A‑CL‑TCO与1,2,4,5‑四嗪结构染料的生物正交反应荧光光谱图；
[0035] 图7为MAO‑B‑PA‑TCO与1,2,4,5‑四嗪结构染料的生物正交反应荧光光谱图。
具体实施方式
[0036] 实施例1MAO‑A特异性探针CL‑TCO的化学合成方法
[0037] CL‑TCO结构式如图1所示，合成过程如图3(a)所示。
[0038] 第一步：将2‑氯‑4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚(1eq.)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.5eq.)溶于二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护下加入滴加三乙醇胺，反应6h，反应结束后加水用二氯甲烷萃取。有机相用1M稀盐酸洗涤。加入无水硫酸钠干燥。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到叔丁基(2‑氯‑4‑甲基苯氧基)二甲基硅烷。谱图分析如图3(b)所示，其中，i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0039] 第二步：将叔丁基(2‑氯‑4‑甲基苯氧基)二甲基硅烷(1eq.)溶于四氯化碳中，在冰浴条件下加入N‑溴代丁二酰亚胺(1eq.)，加热回流3h。加水萃取。无水硫酸钠干燥，得到(4‑(溴甲基)‑2‑氯苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷。谱图分析如图3(c)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0040] 第三步：将反式环辛烯醇(1.5eq.)溶于N,N‑二甲基甲酰胺，在冰浴条件下缓慢加入氢化钠(2eq.)，室温下搅拌30min后加入4‑羟基反式环辛烯(1eq.)，反应5h。反应结束后，加入水淬灭反应，用二氯甲烷萃取。用无水硫酸钠干燥。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑叔丁基(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷。谱图分析如图3(d)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0041] 第四步：将(E)‑叔丁基(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷(1eq.)溶于四氢呋喃中，在冰浴条件下，滴加四丁基氟化铵(1.2eq.)。室温下搅拌2h。反应结束后加入水淬灭。用二氯甲烷萃取。用无水硫酸钠干燥。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑丙氧基)甲基)苯酚。谱图分析如图3(e)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0042] 第五步：将(E)‑2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑丙氧基)甲基)苯酚(1eq.)、1,3‑二溴丙烷(2eq.)溶于乙腈中，加入碳酸钾(1eq.)在氮气保护下回流3h。冷却至室温后加入N‑甲基丙‑2‑胺(3eq.)和碳酸钾(3eq.)40℃搅拌24h。旋干溶剂，用水和乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终化合物CL‑TCO。谱图分析如图3(f)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0043] 实施例2MAO‑B特异性探针PA‑TCO的化学合成方法
[0044] PA‑TCO结构式如图2所示，合成过程如图4(a)所示。
[0045] 第一步：在冰浴条件下，将4‑羟基反式环辛烯和吡啶(1.2eq.)溶于二氯甲烷,缓慢滴加4‑硝基苯基碳酰氯(1.2eq.)室温下搅拌12h。反应完全后加水和二氯甲烷萃取，有机相用1M碳酸钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(4‑硝基苯基)碳酸酯。谱图分析如图4(b)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0046] 第二步：将2‑溴乙‑1‑胺(6eq.)溶于二氯甲烷中，在氮气保护下，缓慢滴加(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(4‑硝基苯基)碳酸酯(1eq.)室温下搅拌16h。反应完全后加入萃取。有机相用碳酸氢钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑溴乙基)氨基甲酸酯。谱图分析如图4(c)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0047] 第三步：将4‑羟基苯甲醛(1eq.)溶于四氢呋喃中，在氮气保护下，加入4‑羟基苯甲醛‑1(1.2eq.)反应混合物在室温下搅拌30min后，加入醋酸钠(1.4eq.)反应5h。饱和碳酸氢钠淬灭反应混合物。用乙酸乙酯(4x20mL)萃取。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚。谱图分析如图4(d)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0048] 第四步：将4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯酚(1eq.)、(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑溴乙基)氨基甲酸酯(1.2eq.)、碳酸钾(2eq.)溶于乙腈溶液中，氮气保护下加热回流12h。反应完全后，旋干溶剂。加入1M稀盐酸调pH至7.0。加入二氯甲烷萃取。无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终产物PA‑TCO。谱图分析如图4(e)所示，(i)为核磁共振氢谱，(ii)为核磁共振碳谱，(iii)为高分辨质谱。
[0049] 实施例3通过分子对接技术模拟特异性探针识别作用(特异性探针对MAO‑A/MAO‑B的识别作用机制相同)
[0050] 如图5所示，预先准备200μL的单胺氧化酶反应体系，包括pH＝7.4的PBS缓冲液，单胺氧化酶A/B(50μg/mL)，CL‑TCO/PA‑TCO(20μM)，于37℃条件下震荡预孵1h。
[0051] 实施例4通过分离柱提纯特异性结合的蛋白‑探针缀合物
[0052] 分离柱的放置：取下柱子的底部封口(盖子松开即可)，并置于2.0mL的收集管中，以1500×g离心1min，去除储存液。将柱子上压实的树脂向上倾斜的一侧做上标记，并在后续的所有离心操作步骤中，保持标记朝外。
[0053] 样品装载：取0.5mL新的离心管中，并放入柱子，取下盖子，慢慢地将上述的200μL反应液放到压实的树脂床的中心，并以1500×g离心2min，收集特异性结合的蛋白‑探针缀合物。
[0054] 实施例5生物正交反应荧光测试
[0055] (1)用pH＝7.4的PBS缓冲液配置1μM1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液(所述1,2,4,5‑四嗪结构如下 Tz‑TER)，将100μL 10μM特异性结合的MAO‑A‑CL‑TCO缀合物溶液与100μL 1μM1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液混匀，于37℃条件下震荡20min。反应20min后进行荧光扫描检测(Ex＝505nm)，结果如图6所示。
[0056] (2)用pH＝7.4的PBS缓冲液配置1μM1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液，将100μL 10μM特异性结合的MAO‑B‑PA‑TCO缀合物溶液与100μL 1μM1,2,4,5‑四嗪结构的染料溶液混匀，于37℃条件下震荡20min。反应20min后进行荧光扫描检测(Ex＝505nm)，结果如图7所示。
[0057] 如果探针没有特异性结合蛋白，从分离柱中分离出的将是不含探针的蛋白样品，将无法与1,2,4,5‑四嗪结构的染料发生生物正交反应，无法产生荧光增强效果。如果探针特异性结合蛋白，从分离柱中分离出的将是特异性结合的蛋白‑探针缀合物样品，将与1,2,4,5‑四嗪结构的染料发生生物正交反应，从而荧光增强。从图6和图7可以看出，反应后的荧光强度增强，证明从旋转离心柱中分离出的样品中的蛋白都已经被探针特异性结合。本发明提供的活性小分子探针能够特异性分检单胺氧化酶。
[0058] 综上所述，本发明设计了MAO‑A的特异性探针(E)‑N‑(3‑(2‑氯‑4‑((环辛‑4‑烯‑1‑氧基)甲基)苯氧基)丙基)‑N‑甲基丙‑2‑炔‑1‑胺，以下用CL‑TCO表示(CL‑TCO分子结构如附图1所示)，该探针的特征结构——炔丙胺基取代的氯苯酚可以作为靶向部分，特异性定量共价结合MAO‑A；还设计了MAO‑B的特异性探针(E)‑环辛‑4‑烯‑1‑基(2‑(4‑((甲基(丙‑2‑炔‑1‑基)氨基)甲基)苯氧基)乙基)氨基甲酸酯，以下用PA‑TCO表示(PA‑TCO分子结构如附图2所示)，该探针的特征结构——炔丙胺基取代的苯酚可以作为靶向部分，特异性定量共价结合MAO‑B(特异性探针识别蛋白的机制如附图5所示)。同时，这两种探针分子的结构中还包含反式环辛烯结构，可与带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料分子发生生物正交反应，反应后产物荧光增强，可以通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性。
[0059] 鉴于1,2,4,5‑四嗪结构在化学反应中快速的反应速率和高荧光特性，待MAO‑A/MAO‑B与对应的探针特异性定量共价结合后，带有1,2,4,5‑四嗪结构的染料分子与修饰在MAO‑A/MAO‑B上的特异性探针CL‑TCO/PA‑TCO的反式环辛烯结构会发生生物正交化学反应，产物荧光增强。可以通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性。
