一种酞菁铜聚合物纳米粒子及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种酞菁铜聚合物纳米粒子Cu‑PcCP NPs，它是酞菁聚合物和铜离子的配位复合物；所述酞菁聚合物是至少两个酞菁单元共用至少一个苯环连接形成的聚合物，所述酞菁聚合物的酞菁单元和铜离子的摩尔比为(1～2)：1；所述酞菁单元的结构如下所示。本发明Cu‑PcCP NPs作为一种新的过氧化酶模拟物，不仅具有优异的类酶催化活性，而且具有较强的底物选择性，稳定性好，能够抵抗多种恶劣条件，包括高温、低pH，应用于生物分子检测传感器可将相应的分析系统与氧气隔离，使这种高分子基酶模拟物可用于特异、敏感和稳定的生物传感器。基于Cu‑PcCP NPs对H2O2、L‑半胱氨酸和葡萄糖进行检测，线性范围宽，检出限低，展现出应用于生物分子检测的很好的适用性，应用前景广泛。

权利要求

1.一种酞菁铜聚合物纳米粒子，其特征在于，它是酞菁聚合物和铜离子的配位复合物；

所述酞菁聚合物是至少两个酞菁单元共用至少一个苯环连接形成的聚合物，所述酞菁聚合物的酞菁单元和铜离子的摩尔比为（1 2）：1；

~

所述酞菁单元的结构为：

；

所述纳米粒子的粒径为222.7±58.4 nm。

2.如权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，它是将1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐分散在醇中，在催化剂作用下，微波反应制得。

3.如权利要求2所述的纳米粒子，其特征在于，所述1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐的摩尔比为(4 5):(1 3)。

~ ~

4.如权利要求3所述的纳米粒子，其特征在于，所述1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐的摩尔比为5:2。

5.如权利要求2所述的纳米粒子，其特征在于，所述微波反应功率300 350W，时间为5~ ~

15min。

6.如权利要求5所述的纳米粒子，其特征在于，所述微波反应功率320W，时间10min。

7.权利要求1 6任一项所述纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：~

（1）将1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐分散在醇中，加入催化剂分散均匀；

（2）将步骤（1）得到的混合体系在微波作用下反应。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述铜盐为氯化铜、溴化铜，硫酸铜，乙酸铜，乙酰丙酮铜；

和/或，所述醇为乙二醇、正戊醇、正辛醇；

和/或，所述催化剂为DBU。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述铜盐为氯化铜。

10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐的摩尔比为(4 5):(1 3)。

~ ~

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐的摩尔比为5:2。

12.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述微波的条件为功率300 350W，时间~

5 15min。

~

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述微波的条件为功率320W，时间

10min。

14.权利要求1 6任一项所述的纳米粒子在生物分子检测试剂中的用途。

~

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述纳米粒子作为生物分子检测试剂中的过氧化物酶模拟物。

说明书

一种酞菁铜聚合物纳米粒子及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物分子检测领域，具体涉及一种酞菁铜聚合物纳米粒子及 其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 生物传感器介导的生物分子检测在许多领域，尤其是在疾病诊断和治疗 中已经成为一个越来越重要的应用。催化生物体内各种反应的天然酶具有较 高的底物选择性和催化效率，在疾病诊断和生物分析领域被证明是检测核酸、 蛋白质、细胞、葡萄糖、多巴胺、L‑半胱氨酸、谷胱甘肽等生物分子的优异生物传感器。但其成本高、非生理环境中不稳定、储存困难等因素限制了其 进一步应用。在此情况下，具有酶活性的纳米材料由于其高稳定性、低成本 和催化活性可调而成为天然酶的替代品。

[0003] 至今已有50多种纳米材料被发现具有类似于天然酶(如过氧化物酶 (POD)、氧化酶(OXD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、葡萄糖 氧化酶(GOx)等)的催化活性。其中，特别是贵金属纳米粒子(NPs)、金属氧 化物、金属有机骨架(MOFs)和掺杂金属/杂原子的碳纳米结构具有催化过氧化 氢分解为更多活性自由基的类POD酶活性，已被广泛应用于生物分析领域。 然而，金属氧化物和MOFs的使用稳定性较差、碳基材料的高吸附率干扰了 其准确性，以及贵金属NPs的高成本都阻碍了POD酶模拟物作为生物传感 器的应用。

[0004] 在设计新一代生物传感器时，聚合物材料已逐渐成为满足上述要求的候 选材料。然而，由于高分子材料的电子转移能力低，类酶活性不理想，且传 感稳定性差，与最先进的类酶纳米材料生物传感器相比，构建具有高灵敏度 的高分子材料生物传感器仍是一个挑战。近年来的研究表明，与传统聚合物 相比，酞菁基高分子材料具有独特的优势，如强π共轭体系、高π‑d离域效 应、良好的导电性、优异的金属螯合性能和高的化学稳定性。这可能最终导 致高酶样感知活动。Bai等人通过超分子自组装合成酞菁锰球形和线型纳米 晶体作为POD酶模拟物用于催化肿瘤治疗，显示出良好的体内外抗肿瘤效果 (Wang,J.；Gao,S.；
Wang,X.；Zhang,H.；Ren,X.；Liu,J.；Bai,F.Self‑Assembled Manganese Phthalocyanine Nanoparticles with Enhanced Peroxidase‑Like Activity for Anti‑Tumor Therapy.Nano Res.2021.)。然而，尺寸和形貌对于酶模拟物非常重要，因为这影响了其与底物的亲和性和催化活 性位点的分布。上述文献报道的酞菁锰是酞菁与锰离子配位形成的小分子物 质，且目前大多数商用的金属酞菁或其衍生物都是以小分子形式存在，容易 因强烈的疏水作用聚集形成微米级颗粒，比表面积减小，催化活性中心暴露 减少，难以与底物接触进行催化反应，大大降低催化效率，不利于后续作为 酶模拟物应用。

[0005] 为了满足日益增长的检测灵敏度和选择性的需求，进一步探索具有高催 化性能的新型POD酶模拟物，更好地进行生物分子检测，具有重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种稳定性好、催化效率高的酞菁铜聚合物纳米 粒子，作为一种新的POD酶模拟物。

[0007] 本发明提供了一种酞菁铜聚合物纳米粒子，其特征在于，它是酞菁聚合 物和铜离子的配位复合物；所述酞菁聚合物是至少两个酞菁单元共用至少一 个苯环连接形成的聚合物，所述酞菁聚合物的酞菁单元和铜离子的摩尔比为 (1～2)：1，优选为(1.25～2):1，更优选为1.25:1；

[0008] 所述酞菁单元的结构为：

[0009]

[0010] 进一步地，上述纳米粒子的粒径为222.7±58.4nm。

[0011] 更进一步地，上述纳米粒子是将1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐分散在醇中，在 催化剂作用下，微波反应制得。

[0012] 进一步地，上述1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐的摩尔比为(4～5):(1～3)，优选为 5:2。

[0013] 进一步地，上述微波反应功率300～350W，时间为5～15min；

[0014] 优选地，所述微波反应功率320W，时间10min。

[0015] 本发明还提供了上述纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

[0016] (1)将1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐分散在醇中，加入催化剂分散均匀；

[0017] (2)将步骤(1)得到的混合体系在微波作用下反应；

[0018] 进一步地，上述铜盐为氯化铜、溴化铜，硫酸铜，乙酸铜，乙酰丙酮铜； 优选为氯化铜；

[0019] 和/或，所述醇为乙二醇、正戊醇、正辛醇；

[0020] 和/或，所述催化剂为DBU。

[0021] 更精益办不到，上述1,2,4,5‑苯四甲腈和铜盐的摩尔比为(4～5):(1～3)，优 选为5:2。

[0022] 更进一步地，上述微波的条件为功率300～350W，时间5～15min；优选 为功率320W，时间10min。

[0023] 本发明还提供了上述的纳米粒子在生物分子检测试剂中的用途；优选地， 所述纳米粒子作为生物分子检测试剂中的过氧化物酶模拟物。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] 本发明提供了一种制备方法简单的酞菁铜聚合物纳米粒子Cu‑PcCP NPs，作为一种新的POD酶模拟物，不仅具有优异的类酶催化活性，而且具 有较强的底物选择性，稳定性好，能够抵抗多种恶劣条件，包括高温、低pH， 应用于生物分子检测传感器可将相应的分析系统与氧气隔离，使这种高分子基酶模拟物可用于特异、敏感和稳定的生物传感器。基于Cu‑PcCP NPs对 H2O2、L‑半胱氨酸和葡萄糖进行检测，线性范围宽，检出限低，展现出应用 于生物分子检测的很好的适用性，应用前景广泛。

[0026] 本发明的术语解释：

[0027] “DBU”是指1,8‑二氮杂双环[5.4.0]十一碳‑7‑烯，CAS号为6674‑22‑2。

[0028] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

[0029] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0030] 图1为Cu‑PcCP NPs的制备及其形态表征。(a)Cu‑PcCP NPs合成路线示 意图；(b)Cu‑PcCP NPs的SEM图像；(c)Cu‑PcCP NPs的TEM图像；(d) Cu‑PcCP NPs的暗场TEM图像；(e)Cu‑PcCP NPs的SAED模式；(f)C(蓝色)、 N(绿色)、Cu(粉色)对应的EDS元素面扫描图；(g)元素合并的STEM图像； (h)Cu‑PcCP NPs的典型的PXRD图谱；(i)Cu‑PcCP NPs相应的EDS谱图。 (j)Cu‑PcCP NPs(g)的线扫描图。

[0031] 图2为PcCP NPs的SEM图像显示出块状和堆积形态。

[0032] 图3为Cu‑PcCP NPs的结构表征。Cu‑PcCP NPs和商用CuPc的(a)拉曼 光谱；(b)FT‑IR光谱；(c)紫外可见光谱。Cu‑PcCP NPs的Cu 2p(d)，N 1s(e) 和C1s(f)的高分辨率XPS谱图。

[0033] 图4为Cu‑PcCP NPs的XPS测量谱。

[0034] 图5为Cu‑PcCP NPs的POD酶活性。(a)Cu‑PcCP NPs的类POD酶催化 机理示意图；(b)H2O2存在下反应体系的紫外‑可见吸收光谱；(c)不同浓度 Cu‑PcCP NPs反应体系的紫外‑可见吸收光谱；(d)oxTMB吸收强度随 Cu‑PcCP NPs浓度变化的时间依赖性变化；(e)和(f)分别描述了不同pH条件 和不同温度下Cu‑PcCP NPs的相对类POD酶活性。最高的定义为
100％的相 对活性。误差棒是通过三次测量得到的。

[0035] 图6为Cu‑PcCP NPs在室温下的相对POD酶活性。

[0036] 图7为Cu‑PcCP NPs的稳态动力学分析。(a)H2O2和(b)TMB的 Michaelis‑Menten曲线；误差棒是通过三次测量得到的。Cu‑PcCP NPs对(c) H2O2和(d)TMB的动力学常数的Lineweaver‑Burk图。(e)将所报道的非贵金 属POD酶模拟物的性能与这项工作进行比较。

[0037] 图8为比色法检测H2O2。(a)不同浓度H2O2反应体系的紫外‑可见吸收 光谱；(b)H2O2检测的浓度‑响应曲线。插图:H2O2的线性校准图。误差棒代 表三个测量值的标准差。

[0038] 图9为比色法检测L‑半胱氨酸。(a)基于Cu‑PcCP NPs抑制的L‑半胱氨 酸比色法的原理图。(b)不同浓度L‑半胱氨酸反应体系的紫外‑可见吸收光 谱。(c)L‑半胱氨酸检测浓度‑吸光度曲线。插图:L‑半胱氨酸的线性校准图。 (d)pH值对Cu‑PcCP NPs活性的影响。(e)通过监测L‑半胱氨酸及其类似物存 在时的吸光度变化进行L‑半胱氨酸检测的选择性分析。误差棒代表三个测量 值的标准差。

[0039] 图10为比色法检测葡萄糖。(a)Cu‑PcCP NPs级联催化检测葡萄糖示意 图；(b)不同浓度葡萄糖反应体系的紫外‑可见吸收光谱；(c)葡萄糖检测的浓 度‑吸光度曲线。插图:葡萄糖的线性校准图；(d)pH值对Cu‑PcCP NPs活性 的影响；(e)通过监测葡萄糖及其类似物存在时的吸光度变化进行葡萄糖检测 的选择性分析。插图:葡萄糖及其类似物的反应溶液的照片。误差棒代表三个 测量值的标准差。

具体实施方式

[0040] 本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

[0041] 实施例1、酞菁铜聚合物纳米粒子(Cu‑PcCP NPs)的制备

[0042] 首先将1,2,4,5‑苯四甲腈(89mg,0.5mmol)和CuCl2(26.8mg,0.2mmol)在 10ml乙二醇中充分分散。然后，在混合物中加入1,8‑二氮双环(5,4,0)十一烯 ‑7‑烯(DBU)作为催化剂。混合液超声分散10min后将整个系统放入微波炉中， 180℃(320W)反应10min。实验结束后，将产物趁热转移，用乙二醇、3％ 盐酸、去离子水和乙醇依次洗涤。沉淀在60℃真空干燥过夜，即得到Cu‑PcCP NPs。

[0043] 作为对比，还合成了无金属酞菁共轭聚合物纳米粒子(PcCP NPs)用于后 续表征，合成方法与Cu‑PcCP NPs的合成方法一致，但产物在过量的去离子 水中沉淀。

[0044] 实施例2、酞菁铜聚合物纳米粒子(Cu‑PcCP NPs)的制备

[0045] 原料用量为：1,2,4,5‑苯四甲腈(0.4mmol)和CuCl2(0.1mmol)，其余同实 施例1，按照实施例1的方法步骤合成。

[0046] 实施例3、酞菁铜聚合物纳米粒子(Cu‑PcCP NPs)的制备

[0047] 原料用量为：1,2,4,5‑苯四甲腈(0.4mmol)和CuCl2(0.3mmol)，其余同实 施例1，按照实施例1的方法步骤合成。

[0048] 以下通过实验例证明本发明Cu‑PcCP NPs的有益效果。

[0049] 实验例1、酞菁铜聚合物纳米粒子(Cu‑PcCP NPs)的表征

[0050] 本发明通过1,2,4,5‑苯四甲腈和CuCl2的微波辅助聚合反应制备了 Cu‑PcCP NPs，其中1,8‑二氮双环(5,4,0)十一烯‑7‑烯(DBU)通过环化反应保证 了共轭网络的形成(图1a)。对实施例1制得Cu‑PcCP NPs进行表征，通过扫 描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)可以清楚地看到，制备的产物直径约为222.7 ±58.4nm，形貌呈球形(图1b,c)。然而，无金属酞菁共轭聚合物纳米颗粒(PcCP NPs)呈现块状和堆叠形态(图2)，主要归因于分子层之间的强π‑π相互作用。 因此，Cu离子对球形形态的调节起着重要作用。高角度环形暗场扫描透射电 子显微镜(HAADF‑STEM)(图1d)也显示了Cu‑PcCP NPs的球形尺寸和大致的 表面结构。此外，高分辨率TEM和HAADF‑STEM均未观察到明显的晶体 结构，这证实了Cu‑PcCP NPs的主要构成为SAED图像所阐明的非晶态结构 (图1e)。此外，粉末X射线衍射(PXRD)(图h)只在Cu‑PcCP NPs的26°处出 现了一个典型的共轭聚合物峰，没有出现Cu或CuO的结晶峰，这与STEM 和SAED数据一致。为了解释Cu‑PcCP NPs的组成，进一步拍摄了 HAADF‑STEM图像，相应的元素映射图像和能谱图(EDS)(图1f,i)清晰地显 示出C、N和Cu元素的存在，且Cu均匀地分散在N掺杂的碳中。此外，在 面分布重叠区域进一步进行EDS线扫描元素分析(图1g)，如绿色箭头沿单个 纳米颗粒方向所示，这与元素面分布结果一致(图1j)。

[0051] 为了深入了解碳结构，图3a给出了Cu‑PcCP NPs的拉曼光谱。在677、 744、1456cm‑1处分别显示出A1g,B1g和B2g模式，这是酞菁分子平面振动的 结果。通过傅里叶红外光谱(FT‑IR)分析(图3b)可知，Cu‑PcCP NPs通过准酞 菁大环拓扑集成，并通过闭合共轭结构连接。‑1
值得注意的是，代表Cu‑PcCP NPs苯环上的外围C‑H面内弯曲振动的1118cm 处的峰显示出比商用铜 酞菁(CuPc)显著降低的信号，证明酞菁单元结构已整合到Cu‑PcCP NPs。在 可见‑紫外光谱(图3c)中，与CuPc分子相比，Cu‑PcCP NPs有明显的B带蓝 移和Q带红移,这表明其通过苯环连接发生了扩展的共轭。进一步利用X射 线光电子能谱(XPS)对其表面化学结构进行了分析。如图3所示，XPS测量 光谱证实了Cu‑PcCP NPs中存在C、N、Cu，并给出了元素的相对含量，C, N,Cu的原子占比为69.2％，11％，1.1％，即是说N原子与Cu原子的相对摩 尔比例为N:Cu＝10:1，而酞菁聚合物中每个酞菁单元(或者说每个重复单元) 含8个N原子，且每个酞菁单元可以与1个铜离子配位结合。因此，酞菁聚 合物的重复单元与铜离子的摩尔比例关系为1.25:1(图4)；同时对实施例2 和实施例3的Cu‑PcCP NPs进行XPS测试，按上述方法计算得到的酞菁聚合物重复单元和铜的比例分别为2:1和1.5:1。Cu 2p轨道的高分辨率XPS谱清 晰地证实了Cu(I)和Cu(II)的同时存在(图3d)，其中Cu(I)在无零价金属成分 的Cu‑PcCP NPs中占主导地位(相对原子占比63.75％)，即一价铜离子和二价 铜离子的摩尔比例为3.5:1。此外,N 1s Cu‑PcCP NPs(图3e)的光谱显示异吲哚 环的存在(‑Nβ＝～
399.8eV),结合能为400.3eV和401.2eV时的峰值分别与 中心Cu原子(‑N‑M)和质子化N(‑NH)附近的氮原子有关。如图3f所示，在C 1s XPS下，对应的高分辨率谱可解卷积为C＝C/C‑C、C‑N和π‑π*卫星峰。 相对于Cu‑PcCP NPs的相应峰，π‑π*的高反卷积强度可能是由于中心金属离 子与酞菁大环之间的的扩展共轭和强键合。

[0052] 上述结果证明，本发明制备的酞菁铜聚合物纳米粒子由酞菁铜聚合物构成 交联网络，形成粒径在222.7±58.4nm的球形结构，聚合物中酞菁和铜离子 的摩尔比例在(1～2):1范围，优选为1.25:1；铜离子包括一价铜离子和二价铜 离子，摩尔比例为3.5:1，且聚合物网络中存在大量的限域金属活性中心，具 有作为一种新型催化剂的应用潜力。

[0053] 实验例2、酞菁铜聚合物纳米粒子(Cu‑PcCP NPs)的过氧化物酶样活性和稳态 动力学

[0054] TMB作为一种发色底物，常用于POD酶模拟物的检测(图5a)。如图 5b所示，Cu‑PcCP NPs通过H2O2快速催化TMB氧化生成oxTMB(蓝色)，其 特征吸光度在652nm处，而PcCP NPs的活性可忽略不计，这主要是由于 Cu‑PcCP NPs的共轭结构，使一个氢原子从TMB的氨基转移‑1 ‑1到羟基吸附质 上的速度更快。此外，当Cu‑PcCP NPs浓度从10mg L 增加到50mg L 时， 吸收峰逐渐增大(图5c)。从图5d可以看出，不同浓度的Cu‑PcCP NPs在652 nm处的吸光度随时间的变化，呈现出浓度依赖性，即浓度越高，催化活性 越好。研究了工作pH和温度对Cu‑PcCP NPs类POD酶催化的影响。Cu‑PcCP NPs在不同的pH条件和温度下都表现出较高的催化活性(图5e,f)，优于天然 酶(如HRP(Gao,L.；Zhuang,J.；Nie,L.；Zhang,J.；Zhang,Y.；Gu,N.；Wang,T.； Feng,J.；Yang,D.；Perrett,S.；et al.Intrinsic Peroxidase‑Like Activity of Ferromagnetic Nanoparticles.Nat.Nanotechnol.2007,2,577‑583))。此外，在 室温下1个月后，Cu‑PcCP NPs的相对催化活性仍保持在95％以上(图6)，表 明其具有良好的稳定性和可用性。

[0055] 采用稳态动力学方法来表征酶模拟物的类POD酶活性。以H2O2和TMB 为底物，分别测定Cu‑PcCP NPs的酶动力学参数(Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km)。 获得了Cu‑PcCP NPs引发的两个催化反应的典型Michaelis‑Menten动力学曲线(图7a，c)，其Lineweaver‑Burk双倒数图反映出良好的线性关系(图7b，d)。 相比之下，Cu‑PcCP NPs的Km值较低，Vmax较高，表明它比已有报道的Cu 基POD酶模拟物具有更强的亲和力和更快的反应速度(表1)。

[0056] 表1.铜基POD酶模拟物的稳态动力学参数

[0057]

[0058]

[0059] (注：Km为米氏常数，Vmax为最大反应速度。随着底物浓度的变化，选 择该浓度可得到拟合良好的Michaelis‑Menten图。Kcat是催化常数，而Kcat值越高代表每个活性催化中心转化的底物越多。Kcat/Km表示催化效率。)

[0060] 在催化反应的重要指标(Vmax和Kcat)方面，Cu‑PcCP NPs相对于以往文 献中其他非贵金属基POD酶模拟物具有非常好的优势(图7e，表2(以H2O2为底物))。

[0061] 表2 Cu‑PcCP NPs与其他报道的过氧化物酶模拟物在POD酶动力学参数(底 物:H2O2)方面的比较

[0062]

[0063]

[0064] (注：Km为米氏常数，Vmax为最大反应速度。[E0]为金属活性位点的摩 尔浓度，随着底物浓度的变化，选择该浓度可得到拟合良好的 Michaelis‑Menten图。Kcat是催化常数，而Kcat值越高代表每个活性催化中心 转化的底物越多。)

[0065] 更进一步地，即使与现有报道的其他金属酞菁类化合物比较，Cu‑PcCP NPs的催化指标也具有显著优势(表3)。

[0066] 表3 铜基POD酶模拟物的稳态动力学参数

[0067]

[0068] (注：Km为米氏常数，Vmax为最大反应速度。[E0]为金属活性位点的摩 尔浓度，随着底物浓度的变化，选择该浓度可得到拟合良好的Michaelis‑Menten图。Kcat是催化常数，而Kcat值越高代表每个活性催化中心 转化的底物越多。Kcat/Km表示催化效率。)[0069] 上述结果证明了本发明Cu‑PcCP NPs不同寻常的过氧化物酶催化性能， 是一种是一种可抵抗温度与pH变化的，稳定性好的POD酶模拟物。

[0070] 实验例3、酞菁铜聚合物纳米粒子(Cu‑PcCP NPs)作为过氧化物酶模拟物应用 于生物分子检测

[0071] 1、比色法检测H2O2

[0072] 由于过氧化氢在过氧化物酶催化循环中对TMB的氧化起着至关重要的 作用，因此H2O2的定量检测对于扩展Cu‑PcCP NPs的生物传感应用具有重 要意义。如图8a所示，Cu‑PcCP NPs‑TMB体系在不同浓度的H2O2存在下 可以产生不同的蓝色溶液(oxTMB)。通过分析线性校准图(图8b)，确定5～100 μM范围内H2O2的检出限(LOD)为4.88μM，相关系数为0.99817。此外，检 测限(LOD)的相对标准偏差(RSD％)为1.1％(n＝3)。表4中显示该样品的 LOD较其他酶模拟物低，证明Cu‑PcCP NPs具有较高的H2O2检测潜力，检 测灵敏度高。

[0073] 表4 Cu‑PcCP NPs与其他报道的过氧化物酶模拟物检测H2O2的性能比较。

[0074]

[0075] 2、比色法检测L‑半胱氨酸

[0076] 近年来，过氧化物酶模拟物在生物传感领域的应用得到了迅速发展。L‑ 半胱氨酸是人体典型的半必需氨基酸，在蛋白质合成、代谢、解毒等细胞功 能的各个过程中发挥着重要作用。鉴于L‑半胱氨酸在各种疾病中的重要作 用，显然需要一种定性和定量的方法来在最短的时间内检测该氨基酸。有报 道称在L‑半胱氨酸存在的情况下，通过‑SH与金属原子的相互作用，可抑制 过氧化物酶的催化活性，从而实现L‑半胱氨酸的显色检测。因此，得益于 Cu‑PcCP NPs独特的过氧化物酶活性，我们研究了不同浓度L‑半胱氨酸存在 下TMB的催化氧化反应(图9a)。由图9b可以看出，随着L‑半胱氨酸的浓度 逐渐增加，oxTMB的吸收峰2
也逐渐降低，显示为浓度依赖型反应。线性校准 曲线范围为20～200μM(R＝0.99338)，LOD约为4.27μM(S/N＝3)(图9c)。 如表5所示，Cu‑PcCP NPs的LOD与其他纳米材料相当，而检测范围显著增 大，说明Cu‑PcCP NPs能够承受溶液中较高的L‑半胱氨酸浓度。

[0077] 同样，进一步探索了Cu‑PcCP NPs在不同环境中的检测性能，发现在较 宽的pH范围内，Cu‑PcCP NPs仍然展现了良好的L‑半胱氨酸检测能力(图 9d)。通过几种氨基酸和谷胱甘肽作为干扰物质验证了L‑半胱氨酸检测的选 择性(图9e)，结果表明该检测系统能够抵抗其他干扰，对L‑半胱氨酸具有良 好的选择性。为验证该方法的可靠性，在生物样品中进行L‑半胱氨酸检测。 采用标准加样法检测人血清。根据表6显示的结果，L‑半胱氨酸的回收率为 98.1～103.4％，RSD限为1.2～2.7％，这是有力的经验证据，证明了Cu‑PcCP NPs 在临床诊断试剂中的适用性。

[0078] 表5 Cu‑PcCP NPs与其他POD酶模拟物检测L‑半胱氨酸的性能比较

[0079]

[0080] 表6、Cu‑PcCP NPs测定人血清中L‑半胱氨酸的回收率试验(n＝5)

[0081]

[0082] 3、比色法检测葡萄糖

[0083] 体液中的葡萄糖含量是一个非常重要的生理参数，而血液中的葡萄糖过 量会导致许多内分泌代谢疾病，如糖尿病。结合GOx的催化葡萄糖分解为 H2O2和Cu‑PcCP NPs催化H2O2分解为ROS的特性，我们将葡萄糖氧化酶 (GOx)与Cu‑PcCP NPs整合，形成天然酶‑人工酶级联生物传感器(图10a)。 如图10b所示，652nm处的吸光强度随葡萄糖浓度的增加而增加，浓度‑吸 光度曲线(图10c)表明线性校准曲线范围为0～600μM。该级联生物传感器的 LOD最低可达21.1μM。值得注意的是，与表7中总结的其他葡萄糖传感器 相比，Cu‑PcCP NPs构建的葡萄糖传感器具有可比的检测限和更宽的线性范 围。然后我们考察了Cu‑PcCP NPs在不同环境下的检测性能，发现它在宽pH 条件下仍然保持了对葡萄糖的良好检测能力(图10d)。以葡萄糖类似物、离子 和谷胱甘肽为干扰物质验证了葡萄糖检测的选择性(图10e)，结果表明该检测 系统能够抵抗其他干扰，对葡萄糖具有良好的选择性。为了验证Cu‑PcCP NPs 在实际应用中的可行性，采用标准加入法测定血清中葡萄糖浓度，如表8所 示。葡萄糖回收率为97.9％～98.2％，RSD为1.4～2.6％。因此，以Cu‑PcCP NPs作为POD酶模拟物，构建级联生物传感器的策略在医学诊断和生物分析中对稀释人血清样本中葡萄糖的检测具有广阔的应用前景。

[0084] 表7 Cu‑PcCP NPs与其他POD酶模拟物检测葡萄糖的性能比较

[0085]

[0086] 表8 使用建议的分析方法对人血清葡萄糖分析的回收试验(n＝5)

[0087]

[0088]

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[0115] 综上，本发明提供了一种制备方法简单的酞菁铜聚合物纳米粒子 Cu‑PcCP NPs，作为一种新的POD酶模拟物，不仅具有优异的类酶催化活性， 而且具有较强的底物选择性，稳定性好，能够抵抗多种恶劣条件，包括高温、 低pH，应用于生物分子检测传感器可将相应的分析系统与氧气隔离，使这种高分子基酶模拟物可用于特异、敏感和稳定的生物传感器。基于Cu‑PcCP NPs 对H2O2、L‑半胱氨酸和葡萄糖进行检测，线性范围宽，检出限低，展现出应 用于生物分子检测的很好的适用性，应用前景广泛。