对普通大蓟马高致病能力的航天育种球孢白僵菌菌株SCAUHT30及其应用转让专利
申请号 : CN202210132957.6
文献号 : CN114540200B
文献日 : 2023-01-06
发明人 : 吴建辉 , 张友丹 , 肖卡特·阿里 , 曾巧云 , 王兴民 , 邱宝利 , 胡鑫
申请人 : 华南农业大学
摘要 :
本发明涉及生物防治领域，尤其涉及对普通大蓟马具有致病的优良航天菌株，其是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株SCAUHT30保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为GDMCC NO:62186。本发明通过对比原始菌株与航天诱变菌株的毒力，结合菌株筛选的指标和合理的实验方案等综合考虑。筛选到对普通大蓟马具有优异的致病力的菌株，其致病力相比其他供试菌株要更加稳定的菌株，具有较大潜力用于普通大蓟马的生物防治。
权利要求 :
1.一种对普通大蓟马具有致病能力的航天育种菌株，其是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株SCAUHT30，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为GDMCC NO:
62186。
2.如权利要求1所述的菌株在防治普通大蓟马中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述菌株培养后制成以孢子液、孢子粉形式存在的菌剂。
6
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，应用时所述球孢白僵菌的终浓度为1×109
1×10分生孢子/mL。
~ 7
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，应用时所述球孢白僵菌的终浓度为1×10 1~8
×10分生孢子/mL。
8
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，施用时菌株的孢子浓度为1×10孢子/mL。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在预测普通大蓟马将要发生时或发生初期施用所述菌剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，每隔5‑7天重复施所述菌剂。
9.一种用于防治普通大蓟马的菌剂，其活性成分是如权利要求1所述的菌株。
10.如权利要求9所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂以孢子液、孢子粉形式存在。
说明书 :
对普通大蓟马高致病能力的航天育种球孢白僵菌菌株
SCAUHT30及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物保护领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及普通大蓟马的生物防治中。
背景技术
[0002] 伴随着可持续性发展，生态环境的保护显得格外重要。在农业技术的发展过程中，农药的应用不合理很容易导致各种生态环境污染问题的形成。在生产中通常采用化学防治，不但效果不理想，反而导致害虫产生抗药性、天敌昆虫大量死亡、生物多样性丧失、农药残留超标、生态环境污染等一系列问题（杨广军.农药的危害性及绿色植保技术探讨[J].农业开发与装备,2021(04):132‑133.）。随着近些年农业经济的持续性发展，农药的使用量不断提高，每年全球为了防治农作物病虫害而使用的农药量约为600万t，农药的有效利用率仅为30%，其中剩余的70%均属于流失量（何云峰.农药的危害性及绿色植保技术研究[J].农业技术与装备,2021(01):94‑95.）。环境当中农药的残留会通过雨、风等气象条件而不断的扩散，从而导致全球空气、海洋、土壤以及生物等形成大量的农药残留。我国属于农业大国，农业生产产量相当庞大，这也促使我国农药用量占据全球榜首。正是因为农药使用量的不断扩大，导致农药污染问题越发严重，甚至还频率出现农药中毒案例（刘广.农药环境危害问题及对策研究[J].绿色科技,2020(12):158‑160.）。
[0003] 此时需要有意识的强化绿色植物的保护技术方式，尽可能减少农药污染问题的防控工作。因此，要改变使用化学农药为主的传统防治方式，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，坚持农业防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义（杨运华, 杜开书, 石明旺. 虫生真菌的生物防治研究进展[J]. 河南科技学院学报, 2011, 39(1):34‑37）。
[0004] 虫生真菌是一类寄生真菌，通过侵染进入昆虫体内，并吸收昆虫营养最终导致寄主死亡。其与化学杀虫剂的作用方式不同，对环境和人体安全，常用于害虫的生物防治。虫生真菌侵染昆虫的途径主要有两种：外部途径，与昆虫接触，从体壁、气门及伤口等侵入；内部途径，在昆虫取食、呼吸时，通过消化道、呼吸道侵入。外部侵染以体表侵入为例，首先虫生真菌以分生孢子附着于寄主体表，之后分生孢子萌发长出芽管，芽管穿透寄主体壁进入寄主的血腔内部，在内部先以菌丝体的形式或通过小的独立繁殖体快速扩繁，在血淋巴内吸取虫体养分并不断产生和释放毒性物质，最终导致寄主昆虫的死亡（李月, 姜春杰, 赵宇鹰, 等. 虫生真菌在林业害虫生物防治中的应用[J]. 植物保护, 2016, 10(20): 10‑24）。内部侵入是以虫生真菌通过昆虫消化道、呼吸道等途径侵入，然后在寄主体内萌发生长直至把虫体中的营养消耗殆尽。目前，我国已报道的虫生真菌种类超过400种，其中绿僵菌Metarhiziumspp. 和白僵菌Beauveria spp. 商业化推广和应用最为广泛。白僵菌Beauveria寄主范围广泛，包括重要的农业和森林害虫、病媒介昆虫和蜱螨类，易培养，且对温血动物和植物无害，另外，不仅对成虫治病力强，还能侵染幼虫、蛹、成虫等虫态，对下一代有持续作用并在农林害虫的管理方面发挥了重要作用。虫生真菌以种类多、安全有效、应用期长、不伤害天敌、不易产生抗性及能快速大量生产等优点著称，在生物防治中有着无可比拟的反复侵染性和生产便利性（王清海, 万平平, 黄玉杰, 等. 虫生真菌在害虫生物防治中的应用研究[J]. 山东科学, 2005, 18(4): 37‑40.）。
[0005] 航天育种是利用返回式卫星等所能到达的空间环境对植物(种子)的诱变作用产生有益的变异，在地面选育植物新种质、新材料，培育新品种的高新技术育种途径和方法，称为航天诱变育种或空间诱变育种也称太空育种（马成,马伟超,安建平,李师翁.我国微生物航天诱变育种的应用及研究进展[J].湖南农业大学,2012(19):5‑8.）。太空环境的特有条件有可能引起生物体发生遗传性变异，这些特有条件包括超高真空、超洁净、微重力、强辐射，并且与地面条件有很大差异，另外，还有强烈的紫外线照射等。太空环境是太空科学研究的一个特殊的重要领域。突变频率高、突变谱广、变异幅度大是空间变异最大的特点，并且突变后的变异性状稳定，从而使育种周期缩短、生物安全性提高（Lionheart G, Vandenbrink J P, Hoeksema J D, et al. The impact of simulated microgravity on the growth of different genotypes of the model legume plant Medicago truncatula[J]. Microgravity Science and Technology, 2018, 30(4): 491‑502.）。微生物的航天诱变为微生物的诱变选育提供了新的途径，航天诱变可以明显地改变微生物的生长性状，表现在生长速度、生长形态、生长特性等方面。航天诱变为生物防治优良菌株遗传改良提供了新途径，虫生真菌通过航天搭载，在太空环境作用下，可能会提高菌株毒力、加强菌株对环境的抗逆性，从而获得高效工程菌。这些性状的改变，使微生物产生代谢产物的能力发生改变。与同等情况下传统诱变育种相比，航天诱变育种的效果明显，且性状的遗传稳定性较好，具有很大的应用潜力，能带来巨大的经济效益（蒋培霞,张瑞萍,王海胜,肖溯,杨程,邢新会.紫色杆菌素合成工程菌太空诱变效应及其高产菌株的筛选[J].化工学报,2010,61(02):455‑461.）。
[0006] 普通大蓟马Megalurothripsusitatus（Bagrall）又称豆大蓟马、豆花蓟马，是缨翅目Thysanoptera蓟马亚族Thripina（Stephens）Priesner大蓟马属Megalurothrips昆虫，该虫广泛分布于中国、马来西亚、印度、澳大利亚等世界泛热带地区（韩运发. 中国经济昆虫志第五十五册：缨翅目[M]. 北京：科学出版社, 1997:39‑59.）。目前，蓟马的防治还主要依赖化学防治手段。该虫属杂食性害虫，据不完全统计，寄主植物有9科28种，其中16种为豆科植物（Miyazaki M, Kudo I, Iqbal A. Notes on the thrips (Thysanoptera) occurring on the soybean in Java[J]. library wur, 1984, 52(4): 482‑486.）。普通大蓟马在寄主植物的整个生育期进行为害，其危害主要以锉吸寄主植物的生长点、花器等幼嫩组织和器官的汁液，造成叶片皱缩、变小、弯曲或畸形，严重时植株生长缓慢或停止，偏好取食花器和果实。但是，由于蓟马个体小，善隐藏，繁殖力强，适生范围广等生活习性，导致近年来蓟马的抗药性不断增强，化学防治手段很难达到良好的控制效果（唐国文, 龚信文, 孟国玲. 武汉地区蔬菜蓟马种类研究[J]. 华中农业大学学报, 2002, 21(1): 5‑9.）。由于化学农药的长期使用，一些害虫产生很强的抗药性，还有许多害虫的天敌在防治过程中被误杀。依赖化学防治导致农田生态平衡破坏、环境污染、食品安全问题，且近年来普通大蓟马对多种常用杀虫剂产生不同程度的抗药性。
[0007] 昆虫病原真菌不但具备显著的流行潜力、对人畜和环境安全、害虫不易产生抗性而且有着生产的便利性，应用其防治普通大蓟马有巨大潜力。球孢白僵菌是一种比较常见的寄生型真菌，球孢白僵菌在寄生的时候，寄主的涉及范围比较广，同时球孢白僵菌的致病性和适应性都非常强烈。球孢白僵菌在实际应用过程中，其主要是通过昆虫的体壁逐渐侵入到球孢白僵菌的寄主身上，同时也可以通过消化道等各种不同的途径，逐渐进入到虫体当中。根据相关研究结果可以得出，其实这种球孢白僵菌对人体或者是对一些动植物而言，并没有太大的伤害。同时，球孢白僵菌对环境也不会造成污染影响，但是对害虫的致病力却非常高。
发明内容
[0008] 本发明将筛选出航天诱变高毒力球孢白僵菌应用到普通大蓟马的生物防治技术手段当中。因此，本发明的目的在于对比原始菌株与航天诱变菌株的致病力而研发，提供一株对普通大蓟马高毒力的航天返回球孢白僵菌菌株。该菌株对普通大蓟马有较优良的杀虫效果，为了获得普通大蓟马生物防治效果的优良菌株，对原始菌株白僵菌通过航天育种中，分离筛选出30株单孢菌株，本发明人采用浸虫法测定了其对普通大蓟马雌虫的毒力，由此进一步获得数株普通大蓟马雌虫致病的优良菌株。菌株的产孢量、菌落生长速率及孢子活力等是筛选优良菌株的重要指标，本发明人同时研究了高毒力菌株与原始菌株的生物学特征。
[0009] 具体地，从初筛的100株航天菌株中，进一步分离出航天单孢菌株30株，其与原始菌株对普通大蓟马的致病力都可能存在差异，因而有着不同程度的致病效果。根据本发明的实验结果，结合优良菌株筛选的指标综合考虑（其中致病力是衡量真菌菌株生物防治潜7
力的重要指标），最终确定最佳的航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30，其在10 孢子/mL下对普通大蓟马雌虫有较高的致病力，其致病力相比原始菌株和其他供试菌株要更加稳定。
力的重要指标），最终确定最佳的航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30，其在10 孢子/mL下对普通大蓟马雌虫有较高的致病力，其致病力相比原始菌株和其他供试菌株要更加稳定。
[0010] 因此，本发明提供航天菌株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株SCAUHT21，于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC，地址中国广东省广州市先烈中路
100号大院59号楼5楼 广东省科学院微生物研究所），保藏号为GDMCC NO: 62186。而航天菌株SCAUHT12和SCAUHT30将通过另外提出专利申请。
100号大院59号楼5楼 广东省科学院微生物研究所），保藏号为GDMCC NO: 62186。而航天菌株SCAUHT12和SCAUHT30将通过另外提出专利申请。
[0011] 本发明还提供航天菌株SCAUHT30在普通大蓟马的生物防治中的应用。
[0012] 在具体实施时，可将所述菌株培养后制成孢子液、或含孢子的菌剂。优选地，在施6 9 7 8
用时菌株的孢子浓度为10 孢子/mL至10孢子/mL，最优选为10 孢子/mL至10孢子/mL。
用时菌株的孢子浓度为10 孢子/mL至10孢子/mL，最优选为10 孢子/mL至10孢子/mL。
[0013] 在具体实施方式中，每隔5‑7天生重复施所述菌剂。
[0014] 本发明还提供一种用于防治普通大蓟马的菌剂，其活性成分是如上述的菌株。优选地，其是以孢子液、孢子粉的形式存在。
[0015] 本发明人在筛选原始菌株与航天菌株中发现此前对普通大蓟马一定效果的原始菌株球孢白僵菌菌株HNSB110，在航天诱变返回后对普通大蓟马的效果特别突出。经过的生7
物学实验表明，本发明的航天诱变对普通大蓟马控制效果达到90%(以10 孢子/mL 进行实
7
验)，而同等条件下通常的原始菌株效果下仅为60%；在1×10 孢子/ml 浓度液条件下，SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30在不同处理时间对蓟马的致死率都显著高于其他菌株，第5天的校正死亡率达90%，88.33%，88.33%，远高于其他菌株（见具体实施例的实验结果和表格）。因此，本发明的球孢白僵菌菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30可有效抑制普通大蓟马种群，且对人、畜、植物和环境安全，可部分替代蓟马化防农药，在生物防治上具有很大的应用潜力。
物学实验表明，本发明的航天诱变对普通大蓟马控制效果达到90%(以10 孢子/mL 进行实
7
验)，而同等条件下通常的原始菌株效果下仅为60%；在1×10 孢子/ml 浓度液条件下，SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30在不同处理时间对蓟马的致死率都显著高于其他菌株，第5天的校正死亡率达90%，88.33%，88.33%，远高于其他菌株（见具体实施例的实验结果和表格）。因此，本发明的球孢白僵菌菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30可有效抑制普通大蓟马种群，且对人、畜、植物和环境安全，可部分替代蓟马化防农药，在生物防治上具有很大的应用潜力。
附图说明
[0016] 图1 本发明航空育种步骤示意图。
[0017] 图2 菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30及野生型菌株的菌落直径比较。
[0018] 图3菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30的孢子萌发率及原始菌株和其他航天菌株的比较示意图。
具体实施方式
[0019] 下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行介绍，但不构成对本发明的限制。
[0020] 实施例一：航天育种
[0021] 1.供试菌株
[0022] HNSB110：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）该菌株于2007年9月在云南省昆明市森林土壤分离而来，保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心。
[0023] 由于前期实验发现该菌株生长速度比较快，且对普通大蓟马有一定防治效果，因此选择该菌株进行航天育种。
[0024] 2.实验方法
[0025] 将原始菌株HNSB110接种到4个PE管中，用保鲜膜封口，将样品汇总后实验箱装仓。进行飞船发射在太空中进行在轨试验，返回舱收回，返回舱开舱，试验箱开箱后，最后进行样品分发（具体操作步骤如图1）。
[0026] 3.实验条件
[0027] （1）载具：长征五号B运载火箭
[0028] （2）时间：2020.5.5‑2020.5.8（即5月5日发射，5月8日返回，在轨飞行约67小时）[0029] （3）发射场地：海南文昌航天基地
[0030] （4）在轨高度：300 8000公里~
[0031] （5）所处环境：多次穿越范艾伦辐射带（高能粒子辐射带）
[0032] 4.实验结果
[0033] 共获得诱变菌株4个PE管，菌株搭载返回后保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心，放至4℃中保存，用于后续试验。
[0034] 实施例二：菌株的生物测定
[0035] 1、供试昆虫:普通大蓟马种群采自广州市朱村豇豆田，在实验室饲养多代，饲养条件为温度26℃，相对湿度 65% ，光周期 L∶D = 12∶12。
[0036] 2、供试菌株：（1）HNSB110：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心；（2）采用实施例一获得的航空诱变菌株，挑取100个单菌落孢子，对其进行普通大蓟马初步毒力实验，然后针对毒力较高前30株菌株进行普通大蓟马毒力生测实验。
[0037] 3、实验方法
[0038] （1）孢子悬浮液的配制
[0039] 在 PDA 平板上 26±1 ℃培养 7 d 后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用 0.05%吐温‑80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床 180 rpm 25 ℃振荡培养 25 7
min 后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成 1×10 孢子/mL 的孢子悬浮液。
min 后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成 1×10 孢子/mL 的孢子悬浮液。
[0040] （2）虫生真菌对普通大蓟马的毒力测定
[0041] 将配制好的孢子悬浮液和发酵液置于平底指型管（15mm×75mm）中，浸泡 2h 后倒出孢子悬浮液，指型管自然风干后备用；豇豆切段（1cm，两端无孔），浸入孢子悬浮液，30s 取出，自然风干后对应放入处理好的指型管中，同时接入普通大蓟马雌成虫 50 头，棉花封口，置于人工气候箱中，以 0.05%吐温‑80 无菌水为空白对照，每个处理重复 4 次。连续 7d 记录其死亡率。
[0042] (3)数据处理
[0043] 利用 SPSS 19.0 软件进行试验处理分析，采用单因素方差分析对各结果进行分析，并运用 Tukey 检验差异显著性。
[0044] 4、实验结果
[0045] 实验结果数据显示，不同菌株孢子悬浮液对普通大蓟马的致病力差异显著，菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30显著高于原始菌株和其他菌株(表1)。不同菌株，同一浓度、不同处理时间致病力存在差异，普通大蓟马雌成虫的死亡率随着浓度和处理时间的增加而7
上升, 当浓度为 1×10孢子/mL 时（表1），SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30在第5d的累计死
7
亡率为90%，88.33%，88.33%显著高于浓度1×10孢子/mL 的其他均值。
上升, 当浓度为 1×10孢子/mL 时（表1），SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30在第5d的累计死
7
亡率为90%，88.33%，88.33%显著高于浓度1×10孢子/mL 的其他均值。
[0046] 根据结果，基于综合每天的死亡率来看这三株菌株对普通大蓟马的毒力最好的是菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30对普通大蓟马均有较好致死效果，属于潜在优良生防菌。其中，从第一天到第五天这三株的毒力都比其他菌株高，而且第5至7天的毒力也是非常好。另外，SCAUHT35，SCAUHT54，SCAUHT96的效果也是比较好，也作为后续研究的对象。
[0047] 表1不同菌株对普通大蓟马的校正死亡率（%）。
[0048]
[0049] 注: 经 Tukey 检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著（P＜0.05）。
[0050] 实施例三：菌株的生物学特性
[0051] 1.供试菌株
[0052] HNSB110：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心。
[0053] 航天诱变菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30，SCAUHT35，SCAUHT54，SCAUHT96。
[0054] 2.试验方法
[0055] （1）孢子悬浮液的配制
[0056] 在 PDA 平板上 26±1 ℃培养 7 d 后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用 0.05%吐温‑80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床 180 rpm 25 ℃振荡培养 25 min 后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成 1×107 孢子/mL 的孢子悬浮液。
[0057] （2）菌落直径、产孢量、萌发率
[0058] 取200μL 悬浮液滴加到PDA 平板中央，26℃培养10d，每天测量记录其菌落直径，待最后一天测量完成后，用100 mL 0.05% 的Tween‑80 洗脱，制成分生孢子悬浮液，用血球计数板计算分生孢子产量。
[0059] 取2mL悬浮液加入到的18mL SDA培养基中，轻摇混匀，置于160 rpm 25℃振荡摇床中培养，分别在24h、48h、72h 镜检各处理的孢子萌发情况。
[0060] 3.实验结果
[0061] （1）菌落直径、产孢量
[0062] 实验结果显示，航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30对比原始菌株菌落直径在生长10d后，其航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30的菌落直径和产孢量显著高于原始菌株和其他菌株。在生长第10d时航天菌株SCAUHT12（图2中B），SCAUHT21（图2中C），SCAUHT30（图2中D）的菌落直径分别为71mm、70mm、65mm，SCAUHT35（图2中E），SCAUHT54（图2中F），SCAUHT96（图2中G）的菌落直径分别为63mm、63mm、60mm而原始菌株HNSB110（图2中A）7
的菌落直径为47mm。原始菌株产孢量在第10d时为6.3×10 ，而航天菌株SCAUHT12，
7 7 7
SCAUHT21，SCAUHT30在第10d产孢量分别为：8.3×10 、7.8×10 、8.16×10 ，SCAUHT35，
7 7 7
SCAUHT54，SCAUHT96在第10d产孢量分别为：7.65×10、7.72×10、7.46×10。
的菌落直径为47mm。原始菌株产孢量在第10d时为6.3×10 ，而航天菌株SCAUHT12，
7 7 7
SCAUHT21，SCAUHT30在第10d产孢量分别为：8.3×10 、7.8×10 、8.16×10 ，SCAUHT35，
7 7 7
SCAUHT54，SCAUHT96在第10d产孢量分别为：7.65×10、7.72×10、7.46×10。
[0063] 结果表明：航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30在菌落直径和产孢量均大于原始菌株和其他航天菌株，有较好的孢子活力，属于潜在优良生防菌。因此，对其进行了专利程序的生物材料保藏，其中航天菌株SCAUHT12的保藏编号为GDMCC NO: 62184；SCAUHT21的保藏编号为GDMCC NO: 62185；SCAUHT30的保藏编号为GDMCC NO: 62186。
[0064] （2）萌发率
[0065] 实验结果显示，航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30对比原始菌株孢子萌发率在24h、48h、72h差异较为显著，其中航天菌株SCAUHT12 SCAUHT21，SCAUHT30菌株在24h、48h、72h的孢子萌发率均高于原始菌株和其他航天菌株。航天菌株SCAUHT12在72h时孢子萌发率均达到100%。
[0066] 结果表明，航天菌株SCAUHT12，SCAUHT21，SCAUHT30在孢子萌发率均大于原始菌株和其他航天菌株，属于潜在优良生防菌。