一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法

摘要

本发明涉及一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法。其特征是在pH为2～6的条件下，采用亲水色谱柱对其进行分离。本方法是根据氨基葡萄糖数目的多少进行壳寡糖的分离，因此能够分离不同乙酰化程度的壳寡糖，同时对高聚合度的样品仍具备分离能力，这对单一乙酰化程度壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究具有十分重要的意义。

权利要求

1.一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法，其特征在于：在pH为3.2的条件下，采用亲水色谱柱对不同乙酰化程度的壳寡糖进行分离；

所述壳寡糖是具有相同聚合度不同乙酰化程度的壳寡糖；壳寡糖，AnDm的结构式如下：，

其中聚合度DP=n+m，在2 30之间；乙酰化程度DA=n/DP×100%，同一DP的壳寡糖，A或D的~数目可以直接用于量化DA；

所述亲水色谱柱为键合有极性基团的硅胶色谱柱；极性键合基团为酰胺；所述亲水色谱柱柱内径为2.1 4.6 mm；亲水色谱柱柱长为50 250 mm；填料粒径为1.7μm；填料孔径为60~ ~2

300 Å；填料比表面积为180 350 m/g；硅胶基质色谱柱上极性基团的键合量为7.5 μmol/~ ~2

m；

柱温：30 ℃；

流动相：A, 20% ACN水溶液，其中含10 mM pH=3.2的NH4FA；B, 80% ACN 水溶液，其中含

10 mM pH=3.2的NH4FA；

流速：0.3 mL/min；

洗脱条件：0 7 min, 80% 60% B, 线性；7 25 min, 60% 25% B, 线性；25 30 min, 0% ~ ~ ~ ~ ~B；

检测器：电喷雾检测器。

说明书

一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法。技术背景

[0002] 壳寡糖(AnDm)是由N‑乙酰氨基葡萄糖(A)和/或氨基葡萄糖(D)通过β‑1,4糖苷键连接而成的线性寡糖。作为甲壳素和壳聚糖的降解产物，壳寡糖的聚合度一般在2～20左右。壳寡糖因分子量低，水溶性好，吸收率高，而表现出多种多样的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压、稳定DNA、促进伤口愈合、促进骨组织形成和增强骨骼强度等。

[0003] 壳寡糖的生物活性与其聚合度、乙酰化程度和乙酰化位点密切相关。然而其生物活性的报道多是基于壳寡糖的混合物，因而难以阐明其生物活性与物质基础的关系。此外，由于壳寡糖样品制备的不重复性，壳寡糖混合物的聚合度和乙酰化程度存在着差异，这还会使得其生物活性的研究报道产生争议。

[0004] 因此，为深刻理解壳寡糖的活性机制，需要使用充分表征的、高纯度的单一壳寡糖进行活性研究。目前，单一聚合度壳寡糖的分离已有报道。然而，单一乙酰化程度壳寡糖的分离仅限于低聚合度的简单壳寡糖，如DP＝3的A1D2和A2D1，DP＝4的A1D3,A2D2和A3D1以及DP＝6的各不同乙酰化程度的壳寡糖，但尚未见高聚合度的单一乙酰化程度壳寡糖分离的相关研究。本发明则提供了一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法，尤其研究了高聚合度壳寡糖的分离，以期为单一乙酰化程度壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究提供科学依据。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种不同乙酰化程度壳寡糖的色谱分离方法。

[0006] 为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：在pH为2～6的条件下，采用亲水色谱柱对不同乙酰化程度的壳寡糖进行分离。

[0007] 所述壳寡糖具有相同的聚合度不同的乙酰化程度。壳寡糖(AnDm)的结构式如下：

[0008]

[0009] 其中，聚合度DP＝n+m，在2～30之间；乙酰化程度DA＝n/DP×100％，同一DP的壳寡糖，A或D的数目可以直接用于量化DA。

[0010] 所述pH为3～5，通过在流动相中添加酸性添加剂中的一种或二种以上进行调节。

[0011] 所述流动相为有机相和水相，或有机相水溶液；有机相为乙腈、乙醇、甲醇等中的一种或多种组合。

[0012] 所述酸性添加剂的添加方式为在有机相和水相，或有机相水溶液中分别添加或在任意一相中添加。

[0013] 所述酸性添加剂的种类、浓度及其pH为如下二类中的一种或二种以上：

[0014] 第一类，甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸中的一种或二种以上，体积分数均为0.01～10％；

[0015] 第二类，甲酸铵缓冲盐、甲酸三乙胺缓冲盐、乙酸铵缓冲盐、乙酸三乙胺缓冲盐、磷酸铵缓冲盐、磷酸三乙胺缓冲盐、磷酸钾缓冲盐或磷酸钠缓冲盐中的一种或二种以上，浓度均为1～200mM，pH均为2～6。

[0016] 所述亲水色谱柱为硅胶色谱柱或键合有极性基团的硅胶色谱柱中的一种或二种以上；极性键合基团为酰胺、氨基酸、氨基、氰基、二醇、羧基、糖基和两性离子等中的一种或多种组合；

[0017] 所述亲水色谱柱柱内径为2.1～200mm；亲水色谱柱柱长为50～250mm；填料粒径为2
1.7～30μm；填料孔径为 填料比表面积为180～350m/g。

[0018] 所述硅胶基质色谱柱上极性基团的键合量为0.1～20μmol/m2。

[0019] 本方法是根据氨基葡萄糖数目的多少进行壳寡糖的分离，因此能够分离不同乙酰化程度的壳寡糖，同时对高聚合度的样品仍具备分离能力，这对单一乙酰化程度壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究具有十分重要的意义。

[0020] 本发明具有如下优点：

[0021] 1.能够分离高聚合度的不同乙酰化程度的壳寡糖。不同乙酰化程度壳寡糖分离的报道很少，尤其是高聚合度的壳寡糖。本发明在pH为2～6的条件下，采用亲水色谱柱能够实现高聚合度的不同乙酰化程度壳寡糖的分离。

[0022] 2.能够将壳寡糖根据氨基葡萄糖数目的多少聚类分离。在pH为2～6的条件下，采用亲水色谱柱进行壳寡糖的分离，其保留规律是根据氨基葡萄糖的数目由少到多依次出峰，因此能将壳寡糖聚类分离。

附图说明

[0023] 图1为本发明实施例2所述的聚合度为12～14的不同乙酰化程度壳寡糖b分离的色谱图。

[0024] 图2为本发明实施例3所述的聚合度为21～24的不同乙酰化程度壳寡糖c分离的色谱图。

具体实施方式

[0025] 下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

[0026] 实施例1

[0027] 聚合度为6的不同乙酰化程度壳寡糖a的分离，采用如下色谱条件：

[0028] 色谱柱：BEH Amide(Waters,2.1×150mm,1.7μm,键合量7.5μmol/m2)；

[0029] 柱温：30℃；

[0030] 流动相：A,20％ ACN(含10mM pH＝3.2的NH4FA)水溶液(v/v)；B,80％ACN(含10mM pH＝3.2的NH4FA)水溶液；

[0031] 流速：0.3mL/min；

[0032] 洗脱条件：0～7min,80％～60％ B(v/v),线性；7～25min,60％～25％ B,线性；25～30min,0％ B；

[0033] 样品：a(5mg/mL,溶剂:ACN/H2O(含10mM pH＝3.2的NH4FA)＝1/1(v/v))；

[0034] 进样量：2μL；

[0035] 检测器：电喷雾检测器；

[0036] 对聚合度为6的不同乙酰化程度壳寡糖a进行了分离，通过LC‑MS分析对其进行了鉴定(表1)。A3D3和A2D4(1和2号峰)被有效的分离且成功收集得到相应的馏分，这表明在低pH下，采用亲水色谱柱能够分离聚合度为6的不同乙酰化程度的壳寡糖。此外，1和2号峰的氨基葡萄糖(D)的数目分别为3和4，这同时表明本发明能够将壳寡糖按D的数目由少到多聚类分离。

[0037] 实施例2

[0038] 聚合度为12～14的不同乙酰化程度壳寡糖b的分离，过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于采用如下色谱条件：

[0039] 样品：b(5mg/mL,溶剂:ACN/H2O(含10mM pH＝3.2的NH4FA)＝1/1(v/v))；

[0040] 进样量：0.5μL；

[0041] 如图1和表2可知，聚合度为12的A4D8和A3D9(3和4号峰)，聚合度为13的A7D6,A6D7,A5D8和A4D9(1～4号峰)，聚合度为14的A8D6和A7D7(1和2号峰)，三组壳寡糖都得到了有效的分离且成功收集得到相应的馏分，这表明本发明能够分离高聚合度(12～14)的不同乙酰化程度的壳寡糖。此外，1～4号峰的D的数目分别为6～9，这同时也表明本发明能够将壳寡糖按D的数目由少到多聚类分离。

[0042] 实施例3

[0043] 聚合度为21～24的不同乙酰化程度壳寡糖c的分离，过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于采用如下色谱条件：

[0044] 样品：c(5mg/mL,溶剂:ACN/H2O(含10mM pH＝3.2的NH4FA)＝1/1(v/v))；

[0045] 进样量：0.5μL；

[0046] 如图2和表3可知，聚合度为21的A14D7和A13D8(1和2号峰)，聚合度为22的A15D7,A14D8,A13D9,A12D10,A11D11,A10D12,A9D13和A8D14(1～8号峰)，聚合度为23的A16D7,A15D8,A14D9,A13D10,A12D11,A11D12,A10D13和A9D14(1～8号峰)，聚合度为24的A15D9,A14D10,A13D11,A12D12,A11D13和A10D14(3～8号峰)，四组壳寡糖都得到了分离且成功收集得到相应的馏分，这再次证明本发明能够分离高聚合度(21～24)的不同乙酰化程度的壳寡糖。此外，同实施例1和2，本实施例也再次证明了本发明能够将壳寡糖按D的数目由少到多聚类分离。

[0047] 实施例4

[0048] 聚合度为12～14的不同乙酰化程度壳寡糖b的分离，过程和条件同实施例2，与实施例2不同之处在于采用如下色谱条件：

[0049] 色谱柱：Luna CN(Phenomenex,4.6×150mm,5μm,键合量3.8μmol/m2)；

[0050] 流速：1mL/min；

[0051] 洗脱条件：0～10min,80％～60％ B,线性；10～30min,60％～32％ B,线性；

[0052] 31～35min,0％ B；

[0053] 同实施例2，聚合度为12、13和14的三组壳寡糖都得到了有效的分离且成功收集得到相应的馏分，这表明本发明能够分离高聚合度(12～14)的不同乙酰化程度的壳寡糖。此外，本发明也是根据D的多少进行壳寡糖的分离，因此能够将壳寡糖按D的数目由少到多聚类分离。

[0054] 实施例5

[0055] 聚合度为12～14的不同乙酰化程度壳寡糖b的分离，过程和条件同实施例4，与实施例4不同之处在于采用如下色谱条件：

[0056] 色谱柱：Luna NH2(Phenomenex,4.6×150mm,5μm,键合量5.8μmol/m2)；

[0057] 流动相：A,10％甲醇(含15mM pH＝4的CH3COONH4)；B,90％甲醇(含15mM pH＝4的CH3COONH4)；

[0058] 洗脱条件：0～10min,75％～60％ B,线性；10～20min,60％～30％ B,线性；

[0059] 21～25min,0％ B；

[0060] 同实施例4，本发明能够分离高聚合度(12～14)的不同乙酰化程度的壳寡糖，也能将壳寡糖按D的数目由少到多聚类分离。

[0061] 表1

[0062]

[0063] 表2

[0064]

[0065] 表3

[0066]