一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202210193993.3
文献号 : CN114558172B
文献日 : 2022-09-09
发明人 : 杨强 , 刘文广 , 孙雅格 , 高梓唯 , 窦一鸣 , 刘潞兴 , 刘洋 , 狄鸣远
申请人 : 天津市天津医院
摘要 :
本发明公开了一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用。双层仿生人工骨膜包括仿生生发层和仿生纤维层，仿生生发层以甲基丙烯酰化明胶与纳米羟基磷灰石制备的GelMA‑H‑nHA水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。仿生纤维层以甲基丙烯酰化明胶与N‑丙烯酰基2‑甘氨酸制备的P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。本发明骨膜具有双层生物活性仿生、慢速降解、高强度等特点，可保护缺损区，防止纤维组织渗入损伤骨从而阻碍修复疗效，而且其还具有促进成骨、成血管与免疫调节
权利要求 :
1.一种双层仿生人工骨膜，其特征在于：包括仿生生发层和仿生纤维层，所述仿生生发
2+
层选用GelMA‑H‑nHA材料，仿生纤维层选用P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 材料；所述双层仿生人工骨膜的制备方法包括以下步骤：S1.将GelMA‑H和nHA在去离子水中均匀分散，然后加入光引发剂，混合均匀；
2+
S2.将ACG和GelMA‑L溶于含有Mg 的去离子水中，然后加入光引发剂，混合均匀；
S3.3D打印双层骨膜支架：以步骤S1制备的混合物作为生物墨水进行生发层骨膜支架打印；生发层打印完后，以步骤S2制备的混合物作为生物墨水进行纤维层骨膜支架打印，最后在紫外光下进行光引发聚合20‑40 min，得到双层骨膜支架；
所述GelMA‑H为甲基丙烯酸甲酯化程度为65.98％的GelMA；GelMA‑L为甲基丙烯酸甲酯化程度为25.12%的GelMA，甲基丙烯酸甲酯化程度计算公式为：甲基丙烯酸甲酯化程度(%) = (1‑ )
其中，A(明胶的赖氨酸亚甲基)和A(GelMA的赖氨酸亚甲基)分别表示明胶和GelMA光谱中赖氨酸亚甲基在2.8 2.95 ppm的积分面积。
~
2.根据权利要求1所述的一种双层仿生人工骨膜，其特征在于：所述仿生生发层以GelMA‑H‑nHA水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
3.根据权利要求2所述的一种双层仿生人工骨膜，其特征在于：所述GelMA‑H‑nHA水凝胶中，每毫升去离子水中含GelMA‑H 0.1‑0.2g、nHA 0.03‑0.13g。
4.根据权利要求1所述的一种双层仿生人工骨膜，其特征在于：所述仿生纤维层以P
2+
(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
5.根据权利要求4所述的一种双层仿生人工骨膜，其特征在于：所述P(ACG‑GelMA‑L)‑
2+
Mg 水凝胶中，每毫升去离子水含GelMA‑L 0.05‑0.1g、ACG 0.2‑0.35g，Mg离子浓度为5‑
20mM。
6.一种权利要求1‑5任一所述双层仿生人工骨膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.将GelMA‑H和nHA在去离子水中均匀分散，然后加入光引发剂，混合均匀；
2+
S2.将ACG和GelMA‑L溶于含有Mg 的去离子水中，然后加入光引发剂，混合均匀；
S3.3D打印双层骨膜支架：以步骤S1制备的混合物作为生物墨水进行生发层骨膜支架打印；生发层打印完后，以步骤S2制备的混合物作为生物墨水进行纤维层骨膜支架打印，最后在紫外光下进行光引发聚合20‑40 min，得到双层骨膜支架。
7.根据权利要求6所述的一种双层仿生人工骨膜的制备方法，其特征在于：步骤S1中，每毫升去离子水中加入GelMA‑H 0.1‑0.2g、nHA 0.03‑0.13g。
8.根据权利要求6所述的一种双层仿生人工骨膜的制备方法，其特征在于：步骤S2中，每毫升去离子水中加入GelMA‑L 0.05‑0.1g、ACG 0.2‑0.35g，Mg离子浓度为5‑20mM。
9.根据权利要求6所述的一种双层仿生人工骨膜的制备方法，其特征在于：步骤S1和S2中，所述光引发剂的加入量为单体固含量的1.5‑2.5%。
10.一种权利要求1‑5任一所述双层仿生人工骨膜在制备治疗骨缺损产品中的应用。
说明书 :
一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物材料及生物医学工程技术领域，特别涉及一种双层仿生人工骨 膜及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 外伤、肿瘤和遗传病等其他骨病导致的骨缺损、骨折延迟愈合甚至不愈合是骨 科面临的一大挑战。目前，大量治疗集中于研究和开发种植骨，包括异体和自体植 骨，以及各种组织工程植骨材料。然而，人们过多关注骨缺损本身，却忽视了骨膜 及损伤在骨科疾病发展中发挥的重要作用。
[0003] 骨膜作为正常骨组织的重要组成部分，是包裹在骨组织周围的薄而韧的结缔组 织膜，对骨组织的发育和修复起着决定性作用，可分为内层和外层。外层又称纤维 层，细胞成分较少，主要含有胶原和弹力纤维以及丰富的血管网。外层为骨膜和骨 提供结构支撑、保护作用和血液供应。临床研究发现，骨膜损伤会导致纤维组织渗 入损伤骨，从而阻碍修复疗效。内层称为形成层，紧贴骨表面，富含成骨细胞和具 有多潜能分化潜能的间充质干细胞，形成成骨细胞或软骨母细胞。作为前体细胞库， 一旦损伤发生，可通过分化作用参与骨修复。
[0004] 目前，多项研究已经集中于构建人工骨膜促进骨缺损修复。但迄今为止构建的 人工骨膜均为单层，未能模拟天然骨膜的双层微体系结构。因此，如何构建双层结 构的多功能仿生骨膜，使其发挥生物活性及组织学作用，是一个需要解决的关键问 题。此外，天然高分子可降解材料通常面临体内降解较快的问题，这会导致负载药 物过快的释放与清除及难以维持组织形态，而材料降解缓慢会影响组织长入，所以 如何使人工骨膜的降解与新骨生长速率相匹配，同样是一个亟待解决的难题。
发明内容
[0005] 本发明为了解决上述技术问题，提供了一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和 应用。
[0006] 本发明是通过以下技术方案得以实现的。
[0007] 一种双层仿生人工骨膜，包括仿生生发层和仿生纤维层，所述仿生生发层选用 2+
GelMA‑H‑nHA材料，仿生纤维层选用P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 材料。
GelMA‑H‑nHA材料，仿生纤维层选用P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 材料。
[0008] 作为双层仿生人工骨膜的优选实施方式，所述仿生生发层以GelMA‑H‑nHA水 凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
[0009] 进一步的，所述GelMA‑H‑nHA水凝胶中，每毫升去离子水中含GelMA‑H 0.1‑0.2g、nHA0.03‑0.13g。
[0010] 作为双层仿生人工骨膜的优选实施方式，所述仿生纤维层以 P(ACG‑GelMA‑L)‑2+
Mg 水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
Mg 水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
[0011] 进一步的，所述P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶中，每毫升去离子水含GelMA‑L 0.05‑0.1g、ACG 0.2‑0.35g，Mg离子浓度为5‑20mM。
[0012] 一种双层仿生人工骨膜的制备方法，包括以下步骤：
[0013] S1.将GelMA‑H和nHA在去离子水中均匀分散，然后加入光引发剂，混合均匀；
[0014] S2.将ACG和GelMA‑L溶于含有Mg2+的去离子水中，然后加入光引发剂，混 合均匀；
[0015] S3.3D打印双层骨膜支架：以步骤S1制备的混合物作为生物墨水进行生发层骨 膜支架打印；生发层打印完后，以步骤S2制备的混合物作为生物墨水进行纤维层骨 膜支架打印，最后在紫外光下进行光引发聚合20‑40min，得到双层骨膜支架。
[0016] 通过采用上述技术方案，本申请采用3D打印技术设计并制备了由生发层和纤 维层组成的双层骨膜。甲基丙烯酰化明胶(GelMA)被选择作为主要生物墨水，因 其具有丰富的生物活性位点和较好的加工性能，同时能起到增稠的作用，从而可做 到挤出式打印。将纳米羟基磷灰石(nHA)作为共同墨水加入GelMA中，打印出仿 生生发层。nHA作为人和动物2+
骨骼的主要无机成分，可通过化学键与骨组织结合， 释放的钙离子(Ca )参与体内代谢，刺激或诱导骨的再生。此外，nHA可与GelMA 的聚合物链结合，起到可逆交联作用，从而增强韧性和黏聚强度。为使纤维层具备 较高的机械强度，起到保护缺损区免受外界组织损伤的作用，将GelMA与刺激响应 型氢键单体N‑丙烯酰基2‑甘氨酸(ACG)结合形成混合油墨，通过3D打印技术制 成特异性纤维层。其中ACG因后聚合作用产生多重氢键增强了GelMA水凝胶的力 学特性。GelMA与ACG共聚反应可以稳定PACG网络，使其在体内在适当的时间 内降解。为进一步增强骨缺损的修复效果，将镁离子负载到纤维层中，镁离子可以 促进骨矿化和血管生成，并调节免疫系统。
骨骼的主要无机成分，可通过化学键与骨组织结合， 释放的钙离子(Ca )参与体内代谢，刺激或诱导骨的再生。此外，nHA可与GelMA 的聚合物链结合，起到可逆交联作用，从而增强韧性和黏聚强度。为使纤维层具备 较高的机械强度，起到保护缺损区免受外界组织损伤的作用，将GelMA与刺激响应 型氢键单体N‑丙烯酰基2‑甘氨酸(ACG)结合形成混合油墨，通过3D打印技术制 成特异性纤维层。其中ACG因后聚合作用产生多重氢键增强了GelMA水凝胶的力 学特性。GelMA与ACG共聚反应可以稳定PACG网络，使其在体内在适当的时间 内降解。为进一步增强骨缺损的修复效果，将镁离子负载到纤维层中，镁离子可以 促进骨矿化和血管生成，并调节免疫系统。
[0017] 作为双层仿生人工骨膜制备方法的优选实施方式，步骤S1中，每毫升去离子水 中加入GelMA‑H 0.1‑0.2g、nHA 0.03‑0.13g。
[0018] 作为双层仿生人工骨膜制备方法的优选实施方式，步骤S2中，每毫升去离子水 中加入GelMA‑L 0.05‑0.1g、ACG 0.2‑0.35g，Mg离子浓度为5‑20mM。
[0019] 作为双层仿生人工骨膜制备方法的优选实施方式，步骤S1和S2中，所述光引 发剂的加入量为单体固含量的1.5‑2.5％，即每1g GelMA单体加入15‑25μl光引发 剂。
[0020] 一种双层仿生人工骨膜在制备治疗骨缺损产品中的应用。
[0021] 本申请具有以下有益效果。
[0022] 1.本发明仿生双层骨膜结构可以保护缺损区，防止纤维组织渗入损伤骨从而阻碍 修复疗效。仿生双层骨膜结构中，生发层中的nHA可与GelMA的聚合物链结合， 起到可逆交联作用，从而增强韧性和黏聚强度。纤维层中的GelMA与刺激响应型氢 键单体N‑丙烯酰基2‑甘氨酸(ACG)结合形成了高机械强度的混合油墨。ACG因后 聚合作用产生多重氢键增强了GelMA水凝胶的力学特性，弥补了单纯GelMA力学 强度不足的缺点。此外，单纯GelMA体内降解较快，难以维持组织形态，且会导致 负载的药物被快速释放与清除，本发明中的GelMA与ACG共聚反应可以稳定PACG 网络，延长降解时间。
[0023] 2.本发明仿生双层骨膜具有促进成骨、成血管与免疫调节功能，可促进缺损区域 2+
新骨形成。生发层负载的nHA可通过化学键与骨组织结合，释放的钙离子(Ca )参 与体内代谢，刺激或诱导骨的再生。同时，纤维层中负载的镁离子可以促进骨矿化 和血管生成，并调节免疫系统。
新骨形成。生发层负载的nHA可通过化学键与骨组织结合，释放的钙离子(Ca )参 与体内代谢，刺激或诱导骨的再生。同时，纤维层中负载的镁离子可以促进骨矿化 和血管生成，并调节免疫系统。
[0024] 3.制作方法上，本发明采用3D打印技术，可以实现对不规则骨缺损区域形状特 异性、个性化的骨膜打印。有望结合临床影像数字资料，利用软件模拟缺损形态针 对性地打印支架，符合数字化、精细化、个体化的临床治疗模式。
附图说明
[0025] 图1是本发明GelMA‑H‑nHA水凝胶和P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶的理化 性质图(其中，a.PACG和P(ACG‑GelMA‑L)的膨胀行为结果图；b.GelMA‑H‑nHA 水凝胶的平衡含水量2+
结果图；c.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的平衡含水量结果图； d.GelMA‑H‑nHA水凝胶的体
2+ 2+ 2+
外降解结果图；e.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的体 外降解结果图；f.Ca 和Mg 的动态释放结果图)；
结果图；c.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的平衡含水量结果图； d.GelMA‑H‑nHA水凝胶的体
2+ 2+ 2+
外降解结果图；e.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的体 外降解结果图；f.Ca 和Mg 的动态释放结果图)；
[0026] 图2是本发明水凝胶的力学性能结果图(其中，a.GelMA‑H‑nHA水凝胶的拉伸 应力2+
结果图；b.GelMA‑H‑nHA水凝胶的压缩应力结果图；c.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的拉伸应
2+
力结果图；d.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的压缩应力结果图)；
结果图；b.GelMA‑H‑nHA水凝胶的压缩应力结果图；c.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的拉伸应
2+
力结果图；d.P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶的压缩应力结果图)；
[0027] 图3是本发明两种生物墨水的流变性检测结果图(其中，a.ACG‑GelMA‑L生物 墨水的温度扫描图；b.ACG‑GelMA‑L生物墨水的剪切稀化性能结果图；c. ACG‑GelMA‑L生物墨水的剪切速率(1、10、100、1000 1/s)的循环扫描图；d. GelMA‑H‑nHA生物墨水的温度扫描图；e.GelMA‑H‑nHA生物墨水的剪切稀化性能 结果图；f.GelMA‑H‑nHA生物墨水的剪切速率(1、
10、100、1000 1/s)的循环扫描图)；
10、100、1000 1/s)的循环扫描图)；
[0028] 图4是本发明模拟的3D打印过程和打印结构图像(其中，a.模拟GelMA‑H‑nHA 油墨在3D打印过程中，黏度随温度和剪切速率变化而变化的挤出过程图； b.GelMA‑H‑nHA厚度2+
为2毫米的3D打印网格支架照片；c.ACG‑GelMA‑L‑Mg 厚 度为2毫米的3D打印网格支架照片；d.图C局部放大高清照片；e.直径为6mm，厚 度为1mm的双层骨膜支架照片)；
为2毫米的3D打印网格支架照片；c.ACG‑GelMA‑L‑Mg 厚 度为2毫米的3D打印网格支架照片；d.图C局部放大高清照片；e.直径为6mm，厚 度为1mm的双层骨膜支架照片)；
[0029] 图5是本发明3D打印双层骨膜支架促进体外成骨的评估结果图(其中，a.rMSCs ALP和ARS染色评估成骨分化结果图；b.Runx2成骨标志基因相对表达水平结果图； c.ALP成骨标志基因相对表达水平结果图；d.COL‑1成骨标志基因相对表达水平结 果图)；
[0030] 图6是本发明3D打印双层骨膜支架调节免疫和促进血管生成的结果图(其中， a.促炎细胞因子TNF‑α的相对表达水平图；b.促炎细胞因子iNOS的相对表达水平 图；c.促炎细胞因子IL‑6的相对表达水平图；d.促炎细胞因子IL‑1β的相对表达水 平图；e.HUVECs在3h和6h形成的毛细血管样网络图；f.毛细管网络中形成的网 格数分析图；g.毛细血管网形成的连接数分析图；h.VEGF表达水平图；i.HIF‑1α 表达水平图)；
[0031] 图7是本发明3D打印双层骨膜支架促进体内骨再生的评估结果图(其中，a. 支架植入后8周和12周骨缺损区的micro‑CT图；b.定量分析8周和12周的新骨组 织BV/TV的结果图；c.定量分析8周和12周的新骨组织BMD的结果图；d.定量 分析8周和12周的新骨组织Tb·Th的结果图；e.植入后8周和12周颅骨缺损区HE 染色图(4x))。
具体实施方式
[0032] 以下结合附图和实施例对本专利申请进行进一步的说明。
[0033] 一、水凝胶的制备和表征
[0034] 1、鉴定不同甲基丙烯酸甲酯(DM)化的GelMA
[0035] 为了确定所得GelMA的甲基丙烯酸甲酯化程度，将明胶和GelMA分别溶于D2O 中。通过1H NMR谱图的积分计算其甲基丙烯酰化(DM)程度。根据公式(1)计算 GelMA的DM程度。
[0036]
[0037] 其中，A(明胶的赖氨酸亚甲基)和A(GelMA的赖氨酸亚甲基)分别表示明胶和 GelMA光谱中赖氨酸亚甲基在2.8～2.95ppm的积分面积。将得到的高DM(65.98％) 和低DM(25.12％)的GelMA分别命名为GelMA‑H和GelMA‑L。
[0038] 2、制备GelMA水凝胶：
[0039] 将0.3g GelMA‑H于40℃下溶于2ml去离子水中，随后加入6μl(占单体固含 量2％，即每1g GelMA‑H单体加入20μl)的光引发剂IRGACURE 1173，在365nm 紫外光下，在交联烘箱(XL‑1000紫外交联剂，美国NY Spectronics公司)中聚合 40min，得到GelMA‑H15水凝胶。同样的，分别将0.1、0.14、0.2g GelMA‑L溶于 2ml去离子水中，分别加入2μl、2.8μl、4μl光引发剂紫外光照射下交联，得到 GelMA‑L5、GelMA‑L7和GelMA‑L10水凝胶(GelMA‑Hx或GelMA‑Lx中，x代表 GelMA质量含量，即每100毫升去离子水中加入的GelMA单体克数)。
[0040] 3、制备GelMA‑H‑nHA水凝胶：
[0041] 以2ml去离子水为溶剂，分别溶解0.3g的GelMA‑H及一定质量的nHA(分别 为0.09g、0.15g和0.2g)。溶质均匀分散后，加入6μl光引发剂，经365nm紫外 光照射交联
40min，得到GelMA‑H15‑nHA30、GelMA‑H15‑nHA50、 GelMA‑H15‑nHA67水凝胶(GelMA‑H‑nHAx中，x表示nHA相对于GelMA的质量 百分含量)。
40min，得到GelMA‑H15‑nHA30、GelMA‑H15‑nHA50、 GelMA‑H15‑nHA67水凝胶(GelMA‑H‑nHAx中，x表示nHA相对于GelMA的质量 百分含量)。
[0042] 4、制备P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶：
[0043] 用2ml含有20mMMgCl2的去离子水溶解0.5g ACG与一定质量的GelMA‑L(分 别为0.1、0.14、0.2g)。然后加入光引发剂IRGACURE 1173(占单体固含量2％， 即每1g GelMA单
2+
体加入20μl光引发剂)，经365nm紫外光照射交联40min，得 到P(ACG25‑GelMA‑L5)‑Mg 、P
2+ 2+ 2+
(ACG25‑GelMA‑L7)‑Mg 和 P(ACG25‑GelMA‑L10)‑Mg 水凝胶(P(ACGx‑GelMA‑Ly)‑Mg 中，x和y分别表示 ACG和GelMA‑L的质量含量，即每100毫升去离子水中加入的单体克数)。
2+
体加入20μl光引发剂)，经365nm紫外光照射交联40min，得 到P(ACG25‑GelMA‑L5)‑Mg 、P
2+ 2+ 2+
(ACG25‑GelMA‑L7)‑Mg 和 P(ACG25‑GelMA‑L10)‑Mg 水凝胶(P(ACGx‑GelMA‑Ly)‑Mg 中，x和y分别表示 ACG和GelMA‑L的质量含量，即每100毫升去离子水中加入的单体克数)。
[0044] 5、测量水凝胶动态溶胀行为
[0045] 1)利用电子天平称量水凝胶初始湿重计为W0，随后在PBS溶液中浸泡t小时 后测量溶胀水凝胶的湿重计为Wt，实验均重复三次
[0046] 2)利用公式(2)测量溶胀比(SW)，评估水凝胶的动态溶胀行为
[0047]
[0048] 图1a显示原始PACG水凝胶在48h内迅速溶胀，最后溶于PBS中，而P (ACG‑GelMA‑2+
L)‑Mg 水凝胶在7d内能保持其完整性并达到稳定的溶胀平衡。这种 稳定的溶胀既源于ACG
2+
与GelMA‑L之间的化学交联，也源于PACG中Mg 与羧 基之间的离子交联。
L)‑Mg 水凝胶在7d内能保持其完整性并达到稳定的溶胀平衡。这种 稳定的溶胀既源于ACG
2+
与GelMA‑L之间的化学交联，也源于PACG中Mg 与羧 基之间的离子交联。
[0049] 6、测量水凝胶平衡含水量(EWCs)
[0050] 1)将水凝胶模压成圆柱形，在去离子水中浸泡至少一周达到平衡，测得湿重为 W1，随后将水凝胶完全干燥，记录其干重为W0，实验均重复三次。
[0051] 2)利用公式(3)测量平衡含水量(EWCs)
[0052]
[0053] 图1b和图1c所示的平衡含水量(EWCs)结果与溶胀率结果一致。包封nHA几乎 不影2+
响GelMA‑H‑nHA水凝胶的EWCs，约为85％。虽然P(ACG‑GelMAL)‑Mg 水凝胶表现出较低的EWCs，但可以吸收约61～78％的水。
响GelMA‑H‑nHA水凝胶的EWCs，约为85％。虽然P(ACG‑GelMAL)‑Mg 水凝胶表现出较低的EWCs，但可以吸收约61～78％的水。
[0054] 7、测量水凝胶的体外降解情况
[0055] 1)在37℃条件下，将150mg水凝胶置于含有1mL 5μg/mLⅡ型胶原酶溶液 的离心管中，每隔两天更换一次胶原酶溶液。
[0056] 2)在指定的时间点，将液体从离心管中吸出。将剩余的水凝胶冻干72h，然后 记录各时间点的干重为Wt，初始水凝胶的干重记为W0，实验均重复三次
[0057] 3)根据公式(4)计算水凝胶的残余百分数质量：
[0058]
[0059] 图1d和图1e显示，GelMA中加入nHA可以在一定程度上减缓降解速率，但 是仍然降解很快，难与新骨生长速度相匹配。相比之下，ACG与GelMA共聚可显 著抑制降解速率，延长降解时间至60d以上，有利于骨再生。
[0060] 8、测量水凝胶的离子释放情况
[0061] 1)在37℃条件下，将200mg GelMA‑H‑nHA和200mg P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶分别浸入5mL PBS溶液中。
[0062] 2)在某一时间点，取出水凝胶，收集剩余液体，用电感耦合等离子体发射光谱 仪(ICP‑MS)测定离子的释放量。
[0063] 图1f显示在降解过程中，GelMA‑H‑nHA水凝胶和P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝 胶分别2+ 2+
在28d内持续释放Ca 和Mg 。
在28d内持续释放Ca 和Mg 。
[0064] 9、测量水凝胶的力学特性
[0065] 1)水凝胶浸泡在去离子水中直到达到平衡，在英斯特朗2344型微型试验机上 进行室温下拉伸和压缩力学性能测试。
[0066] 2)将充分溶胀的水凝胶打孔成厚度为0.5mm的哑铃形试样进行拉伸强度测试， 拉伸试验十字头速度设定分别为10mm/min。
[0067] 3)将充分溶胀的水凝胶模压成直径为4.2mm的圆柱形试样进行压缩强度测试， 压缩试验十字头速度设定分别为50mm/min。
[0068] 4)按照公式(5)计算水凝胶样品的应力：其中F表示载荷，A表示初始截面 积。
[0069]
[0070] 图2a和图2b显示，在GelMA‑H凝胶中引入nHA，机械强度显著提高，当nHA 含量提高到67％时，拉伸应力和拉伸模量分别提高到116.28kPa和236.18kPa，是 GelMA‑H凝胶的2+
2.33倍和2.4倍。图2c和2d显示，P(ACG25‑GelMA‑L7)‑Mg 水 凝胶能够承受0.472MPa的拉应力和2.164MPa的压应力，高于图2a和2b中所示 GelMA水凝胶基骨膜支架。
2.33倍和2.4倍。图2c和2d显示，P(ACG25‑GelMA‑L7)‑Mg 水 凝胶能够承受0.472MPa的拉应力和2.164MPa的压应力，高于图2a和2b中所示 GelMA水凝胶基骨膜支架。
[0071] 二、3D打印双层骨膜支架的制备和表征
[0072] 1.3D打印双层支架的制备
[0073] 1.1 3D打印生发层骨膜支架：
[0074] 采用挤出式3D生物打印机(中国杭州雷根诺沃)对双层骨膜支架进行打印。生发 层每层高0.2mm，共4层。具体方法为：将GelMA、nHA和引发剂的混合物预热 至37℃，机筒温度设定为27℃，在印刷过程中，挤压速度固定为8mm/min，压力 为0.2MPa，平台温度设定为10℃。
[0075] 1.2 3D打印纤维层骨膜支架：
[0076] 打印完生发层后，对纤维层进行打印，纤维层每层高0.2mm，共4层。具体方 法为：先将含有MgCl2、ACG、GelMA‑L和光引发剂的混合物在4℃预冷至少20min， 然后将混合物转移到18℃的桶中。印刷过程中，挤压速度设定为10mm/min，压力 为50k Pa，平台温度控制在‑10℃。最后，在紫外光下进行光引发聚合30min，确保 化学交联完成。
[0077] 2.两种生物墨水的流变性检测
[0078] 2.1生物墨水凝胶‑溶胶转变点检测：
[0079] 采用直径25mm、间距1mm平行板Anton Paar MCR302(奥地利)测试GelMA‑H、 2+
GelMA‑H‑nHA、GelMA‑L和ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水的流变特性。将墨水置于平 台上，初始温度设定为4℃，直至胶凝。在4～40℃温度范围内进行温度扫描试验， 加热速度固定为2℃/min，频率和形变率分别设置为1Hz和0.5％。在此过程中，分 别记录储能模量G′、损耗模量G″和黏度，以确定凝胶‑溶胶转变点，分析黏度 变化趋势。
GelMA‑H‑nHA、GelMA‑L和ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水的流变特性。将墨水置于平 台上，初始温度设定为4℃，直至胶凝。在4～40℃温度范围内进行温度扫描试验， 加热速度固定为2℃/min，频率和形变率分别设置为1Hz和0.5％。在此过程中，分 别记录储能模量G′、损耗模量G″和黏度，以确定凝胶‑溶胶转变点，分析黏度 变化趋势。
[0080] 温度扫描结果如图3a和3d所示，ACG单体的加入可能会扰乱GelMA‑L的三螺 旋结构，表现为凝胶‑溶胶转变温度降低到20℃左右，而在GelMA‑H水溶液中加入 nHA并没有引起凝胶‑溶胶转变温度的明显变化。
[0081] 2.2生物墨水剪切稀化性能的验证：
[0082] 设定剪切速率在一定温度下从0.1到1000s‑1变化的程序，根据各自最适的打印 条2+
件设定温度，分别设置GelMA‑H和GelMA‑H‑nHA墨水为27℃，GelMA‑L和 ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水为18℃。分别在18和27℃下从0.005Hz到10Hz进行频 率扫描试验，并设置剪切速率随时间变化的程序，记录黏度，时间间隔定为一步60 秒。
件设定温度，分别设置GelMA‑H和GelMA‑H‑nHA墨水为27℃，GelMA‑L和 ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水为18℃。分别在18和27℃下从0.005Hz到10Hz进行频 率扫描试验，并设置剪切速率随时间变化的程序，记录黏度，时间间隔定为一步60 秒。
[0083] 图3b和e显示了墨水的剪切稀化曲线，值得注意的是，ACG‑GelMA‑L‑Mg2+和 GelMA‑H‑nHA墨水均具有适合3D打印的初始黏度。随着剪切速率的增加，油墨的 黏度不断降低，呈2+
现出典型的剪切稀化特征。上述流变测试结果表明GelMA‑H‑nHA 和ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水适合挤出式3D打印。
现出典型的剪切稀化特征。上述流变测试结果表明GelMA‑H‑nHA 和ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水适合挤出式3D打印。
[0084] 2.3交替剪应变试验检查生物墨水的自恢复特性：
[0085] 考察GelMA‑H‑nHA和ACG‑GelMA‑L‑Mg2+水凝胶墨水在时间间隔为60s的交 替剪应变试验(1％,100％,200％,300％)中的自恢复特性，并记录储能模量G′和 损耗模量G″。
[0086] 图3c和f结果表明，生物墨水在较宽的频率范围内保持了稳定的模量。另外， 交替剪应变扫描曲线显示了模量的快速恢复。在低剪应变(1％)下，G′和G″几 乎保持恒定，G′相比于G″占优势，提示由于氢键相互作用形成凝胶状态。当 剪应变增大到100％、200％和300％时，G'和G'逐渐接近，最终在高剪应变(300％) 下发生凝胶‑溶胶转变。一旦剪应变回到1％，G′和G″在不到30s内就能恢复 到初始状态，验证了氢键的快速重构。上述流变测试
2+
结果表明GelMA‑H‑nHA和 ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水适合挤出式3D打印。
2+
结果表明GelMA‑H‑nHA和 ACG‑GelMA‑L‑Mg 墨水适合挤出式3D打印。
[0087] 3.3D打印双层支架样本展示
[0088] 3.1以GelMA‑H‑nHA墨水为例，设置程序模拟印刷过程中黏度的变化趋势[0089] 图4a模拟演示了GelMA‑H15‑nHA67印刷过程中墨水粘度随温度和剪切速率变 化的变化情况。具体而言，将油墨预冷至4℃，使其在凝胶状态下保持相对较高黏 度。当生物墨水转移到打印桶中，温度升高到27℃时，在低剪切速率下油墨黏度略 有下降。此后，在27℃挤压打印过程中，黏度随剪切速率的增加而明显下降。最终， 油墨在低温平台上挤出后恢复到初始状态，并能保持稳定状态，直至光引发聚合进 行。
[0090] 3.2 3D打印支架样本展示：
[0091] 图4b和4c分别展示了GelMA‑H15‑nHA67和ACG25‑GelMA‑L7‑Mg2+墨水打印 的多层网格结构。由于墨水的自承受能力，挤出后丝状物保持稳定，结构几乎没有 坍塌。在图4d中可以观察到丝状物形成的清晰的网格化结构，验证了印刷构图保持 了较高的保真度。图4e为与体内骨缺损模型尺寸相匹配，打印直径6mm、厚度1mm 的骨膜支架。
[0092] 三、3D打印双层骨膜支架可以促进成骨，调节免疫和促进血管生成
[0093] 1.3D打印双层骨膜支架促进成骨
[0094] 1.1碱性磷酸酶(ALP)染色评估rMSC早期成骨分化：
[0095] 将rMSCs以1×105/孔的密度接种于24孔板中培养，然后加入GelMA‑H、 GelMA‑H‑nHA或双层支架，培养3d和7d后，进行ALP染色。
[0096] 如图5a所示，双层支架组在第7天染色显色面积显著大于其他组。实验结果表 明，nHA和镁离子的联合添加，导致ALP表达水平升高。
[0097] 1.2茜素红S(ARS)染色测定基质矿化情况：
[0098] 将rMSCs以1×105/孔的密度接种于24孔板中培养，然后加入GelMA‑H、 GelMA‑H‑nHA或双层支架，培养14d和28d后，进行ARS染色。
[0099] 如图5a所示，与其他三组相比，双层支架组表现出更强的基质矿化水平，实验 结果表明，其更高的促进骨再生潜能。
[0100] 1.3利用逆转录‑聚合酶链反应(RT‑PCR)分析成骨相关基因表达情况：
[0101] 将rMSCs以2×105/孔的密度接种于6孔板中，分别加入GelMA‑H、 GelMA‑H‑nHA或双层支架。用TRIzol(Invitrogen)提取细胞总RNA，Nanodrop检测 所提RNA浓度及纯度。按照试剂盒说明加入反转录酶，进行反转录及合成cDNA， ‑20℃保存。按照Green Master的试剂盒说明配制反应体系，并上 机检测。反应体系为：qPCR SYBR Green Master Mix 10ul，上下游引物(参见表1， 10uM)各0.4ul，cDNA 2ul，ddH2O 7.2ul。反应条件为：预变性95℃5min；变性 95℃10s，退火56℃20s，延伸72℃20s，共50个循环；熔解曲线
95℃15s,60℃ 1min,95℃1s。每组均进行3个重复，以GADPH为内参基因，使用2‑△△Ct法 测定相对mRNA表达水平。
95℃15s,60℃ 1min,95℃1s。每组均进行3个重复，以GADPH为内参基因，使用2‑△△Ct法 测定相对mRNA表达水平。
[0102] 表1 qRT‑PCR引物序列信息
[0103]
[0104]
[0105] 通过RT‑PCR结果(图5b‑d，NC：阴性对照。*P<0.05，**P<0.01，***P< 0.001)可以看出，其与ALP和ARS染色结果一致，在双层支架刺激下，Runx2、ALP、 COL‑1等成骨标志基因的相对表达水平这些基因的表达水平显著上调。
[0106] 2.3D打印双层骨膜支架调节免疫
[0107] 将Raw246.7细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中培养24h，随后加入LPS 处理2+
24h后，分别加入P(ACG‑GelMA‑L)水凝胶、P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶或 双层支架。培养
24h后，利用RT‑PCR技术检测促炎细胞因子(TNF‑α、iNOS、IL‑6、 IL‑1β)的基因表达。图6a‑d(NC：阴性对照。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001) 显示，与没有镁离子的组相比，P(ACG‑
2+
GelMA‑L)‑Mg 水凝胶和双层支架中促炎细 胞因子的表达均显著降低。
24h后，分别加入P(ACG‑GelMA‑L)水凝胶、P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶或 双层支架。培养
24h后，利用RT‑PCR技术检测促炎细胞因子(TNF‑α、iNOS、IL‑6、 IL‑1β)的基因表达。图6a‑d(NC：阴性对照。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001) 显示，与没有镁离子的组相比，P(ACG‑
2+
GelMA‑L)‑Mg 水凝胶和双层支架中促炎细 胞因子的表达均显著降低。
[0108] 3.3D打印双层骨膜支架促进血管生成
[0109] 3.1成血管实验测量血管生成情况：
[0110] 首先将Matrigel胶涂在96孔板的底部，在96孔板上培养人脐静脉内皮细胞 4 2+
(HUVECs)，密度为3×10/孔。随后，将P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶或双层支架 置入板中。
在特定时间点(3h和6h)，在倒置荧光显微镜(EVOS M5000,Invitrogen 公司)下观察形成的毛细管样结构，并利用Image J分析了网格和节点数目。
(HUVECs)，密度为3×10/孔。随后，将P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶或双层支架 置入板中。
在特定时间点(3h和6h)，在倒置荧光显微镜(EVOS M5000,Invitrogen 公司)下观察形成的毛细管样结构，并利用Image J分析了网格和节点数目。
[0111] 图6e显示HUVECs在不同水凝胶刺激下形成的毛细血管样网络图像，图6f‑g 分析2+
结果表明，与阴性对照组(NC)相比，P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶和双层支架 均显著增加了网格和结的数量，提示其具有较强的促血管生成能力。
结果表明，与阴性对照组(NC)相比，P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg 水凝胶和双层支架 均显著增加了网格和结的数量，提示其具有较强的促血管生成能力。
[0112] 3.2 RT‑PCR检测成血管相关基因表达：
[0113] 将HUVECs细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，分别加入 P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶或双层支架培养6h。利用RT‑PCR技术检测VEGF和 HIF‑1α的基因表达。
[0114] 图6h‑i(NC：阴性对照。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)结果显示， 与NC组相比，加入含镁离子水凝胶后VEGF和HIF‑1α的表达水平明显升高，与 成管实验结果一致。
[0115] 四、3D打印双层骨膜支架促进颅骨修复
[0116] 1.大鼠颅骨缺损造模与支架植入
[0117] 将39只雄性Sprague‑Dawley大鼠(200‑250mg)随机分为三组：(1)阴性对照组 (NC,未经处理)，n＝13；(2)GelMA‑H‑nHA支架组，n＝13；(3)双层支架组n＝13。 按照标准实验方法建立大鼠颅骨临界大小缺损模型，即全身麻醉后，将大鼠颅部备 皮并消毒。然后，在生理盐水溶液持续冲洗的条件下，采用慢速电动环钻钻孔，构 建双侧6mm对称全层颅骨缺损。缺损处用支架填充或不填支架作为空白对照，用间 断缝合闭合上层组织。术后8周和12周处死大鼠，取颅骨，取得的样品用4％多聚 甲醛固定。
[0118] 2.Micro‑CT定量成骨分析
[0119] 为了定量评价骨缺损内的骨形成情况，采用Scanco Medical μCT 50系统 (ScancoMedical AG,Bruttisellen,Switzerland)对标本进行扫描，分辨率为15μm(1毫 米铝过滤器，100千伏，100毫安)。利用CTVox软件(Skyscan公司)重建三维图像， 并通过感兴趣区(ROI)骨密度(BMD)、骨体积与组织体积比(BV/TV)、骨小梁厚度 (Tb·Th)的值来量化分析新骨形成情况。
[0120] 如图7a所示，3组骨组织在8周时均已出现钙化，当观察时间延长至12周时 新形成的骨组织增加更多，成骨密度和体积则表现出显著差异。由于仿生生发层与 纤维层的协同作用，双层支架的修复效果最好。Micor‑CT结果进一步印证，双层支 架骨组织体积/总组织体积(BV/TV)、骨密度和骨小梁厚度(Tb·Th)均显著优于其 他组(图7b‑d，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
[0121] 3.HE染色观察组织成骨情况
[0122] 固定后，标本在脱水前用EDTA(pH 7.2)脱钙4周，随后石蜡包埋。将石蜡样 本切成7μm厚的组织切片，进行苏木精‑伊红(H&E)染色，并用荧光显微镜拍照。
[0123] 图7e(NB、F和RS分别代表新生骨组织、纤维组织和残留支架)HE染色也 验证了支架的成骨功能，其中填充双层支架的样本成骨最多，而NC组和 GelMA‑H‑nHA支架组的样本仍有很多区域为纤维组织。HE染色结果与Micro‑CT 结果一致，表明在镁离子和nHA纳米颗粒的协同作用下，3D打印双层支架有助于 对临界尺寸骨缺损的修复。
[0124] 本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保 护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明 的保护范围之内。