一种辣椒外源ABA诱导型启动子、表达载体及其应用

摘要

本发明中公开了一种辣椒外源ABA诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示，所述启动子的核苷酸序列来源于辣椒CaRH33基因的上游启动子区。本发明同时公开了一种含有上述辣椒外源ABA诱导型启动子的表达载体。本发明还公开了上述ABA诱导型启动子和表达载体在转基因植物上的应用。本发明利用诱导型启动子CaRH33代替组成型启动子，连接目的基因，再接入到表达载体中，从而获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物的基因组中，可以实现对双元表达载体中目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株，并显著提高植物在诱导条件下对外源基因的表达能力和表达稳定性。

权利要求

1.一种辣椒外源ABA诱导型启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述启动子的核苷酸序列来源于辣椒CaRH33基因的上游启动子区。

2.根据权利要求1所述的辣椒外源ABA诱导型启动子，其特征在于，扩增所述启动子的核苷酸序列的引物序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。

3.一种含有辣椒外源ABA诱导型启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的辣椒外源ABA诱导型启动子。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含报告基因GUS；所述辣椒外源ABA诱导型启动子通过双酶切接入含有报告基因GUS的双元表达载体中，获得含有辣椒外源ABA诱导型启动子和报告基因GUS的表达载体；所述含有报告基因GUS的双元表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为双元表达载体。

6.如权利要求1或2所述的辣椒外源ABA诱导型启动子在转基因拟南芥上的应用。

7.如权利要求3至5任一项所述的表达载体在转基因拟南芥上的应用。

说明书

一种辣椒外源ABA诱导型启动子、表达载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种辣椒外源ABA诱导型启动子、表达载体及其应用。

背景技术

[0002] 启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列,在基因表达调控中起着重要作用。诱导型启动子，是一类受到诱导条件刺激下能大幅度快速调控转录活性的启动子。

[0003] 植物的生长发育离不开环境，当光、温度、水分等环境因素发生变化时，植物通过一系列信号传递,环境响应启动子中相应的诱导顺式作用元件与转录因子结合后，诱导特定基因的转录表达，最后通过基因产物的作用对这些信号产生响应，具备了一定的环境适应能力，以维持正常的生命活动。

[0004] 用胁迫诱导型启动子与特定基因融合，使植物在诱导条件下表达相应外源蛋白，可以显著提高作物在诱导条件下外源基因的表达能力，但是目前这种诱导型启动子的研究相对较少，其表达外源基因的效率也不高。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于解决现有技术中存在的在植物中表达外源基因的诱导型启动子的表达能力较低的问题，提供一种辣椒外源ABA诱导型启动子、表达载体及其应用，可以显著提高植物在诱导条件下外源基因的表达能力。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种辣椒外源ABA诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述启动子的核苷酸序列来源于辣椒CaRH33基因的上游启动子区。

[0007] 优选地，扩增所述启动子的核苷酸序列的引物序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。

[0008] 本发明同时提供了含有上述辣椒外源ABA诱导型启动子的表达载体。

[0009] 优选地，所述表达载体还包含报告基因GUS；所述辣椒外源ABA诱导型启动子通过双酶切接入含有报告基因GUS的双元表达载体中，获得含有辣椒外源ABA诱导型启动子和报告基因GUS的表达载体；所述含有报告基因GUS的双元表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。

[0010] 进一步优选，所述表达载体为双元表达载体。

[0011] 本发明还提供了上述辣椒外源ABA诱导型启动子在转基因拟南芥上的应用。

[0012] 本发明还提供了上述表达载体在转基因拟南芥上的应用。

[0013] 本发明克隆到了辣椒中与拟南芥AtRH33同源的基因CaRH33的启动子，并对其进行了序列分析及功能的验证，证实CaRH33启动子序列可由ATG上游约1.5kb的序列组成，该启动子不仅能够启动外源基因GUS在拟南芥中表达，并且在ABA处理后，可以使转基因植株颜色加深，证明CaRH33启动子是一种响应外源ABA诱导的启动子。本发明利用诱导型启动子CaRH33代替组成型启动子，连接目的基因，再接入到表达载体中，从而获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物拟南芥的基因组中，可以实现对双元表达载体中目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株。因此，作为一个可异源表达的诱导型启动子，CaRH33启动子区域和上游调控序列，在基因工程以及实际应用方面有着非常重要的价值。

[0014] 本发明所具有的有益效果：本发明利用诱导型启动子CaRH33代替组成型启动子，连接目的基因，再接入到表达载体中，从而获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物的基因组中，可以实现对双元表达载体中目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株，并显著提高植物在诱导条件下对外源基因的表达能力和表达稳定性。

附图说明

[0015] 图1为CaRH33启动子片段电泳图；

[0016] 图2为实施例5中CaRH33‑GUS转基因拟南芥ABA处理后GUS染色分析图，其中CK组为对照组；ABA组为实验组。

具体实施方式

[0017] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0018] T‑vector购自TaKaRa；含有报告基因GUS的双元表达载体、农杆菌和野生型拟南芥(Col‑0)由西南大学植物分子实验室提供；LEAGENE GUS染色试剂盒购自LEAGENE。

[0019] 实施例1CaRH33启动子克隆及序列分析

[0020] 1.CaRH33启动子克隆

[0021] 从PepperHub(http://pepperhub.hzau.edu.cn/)数据库中下载辣椒CaRH33基因DNA序列，选择ATG上游约1.5kb长度作为CaRH33启动子区域，以序列SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3为引物，通过PCR获得CaRH33启动子片段，连入T‑vector，通过测序获得正确无突变的CaRH33启动子片段，CaRH33启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；CaRH33启动子片段电泳图如附图1所示，片段长度为1477bp；本实施例中PCR扩增所用引物详见表1；CaRH33启动子的PCR扩增体系详见表2：

[0022] 表1 CaRH33启动子扩增所用的引物序列

[0023]

[0024]

[0025] 表2 CaRH33启动子的PCR扩增体系

[0026]

[0027] 2.CaRH33启动子序列分析

[0028] 利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行启动子调控元件分析，结果见表3：

[0029] 表3 GSM2启动子所含有的启动子必需元件及响应环境胁迫的元件汇总表[0030]

[0031]

[0032] 实施例2构建含有CaRH33启动子和报告基因GUS的双元表达载体

[0033] 在实施例1的基础上，将实施例1获得的CaRH33启动子片段，通过双酶切的方法接入含有报告基因GUS的双元表达载体中，含有报告基因GUS的双元表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，酶切位点分别选择KpnⅠ,SalⅠ；获得含有CaRH33启动子和报告基因GUS的双元表达载体，即CaRH33‑GUS双元表达载体。

[0034] 实施例3 GUS染色方法

[0035] 将待染色植物，加入适量GUS染色液(LEAGENE GUS染色试剂盒)，使GUS染色液完全浸没组织，37℃孵育过夜，随着孵育时间的延长，蓝色渐渐出现，当表达量较高时，GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，用70％乙醇脱去样本的叶绿素，可用50℃水浴加速叶绿素脱色至阴性对照呈白色，用肉眼或光学显微镜观察。

[0036] 实施例4构建转基因拟南芥植株

[0037] 在实施例2的基础上，将实施例2中构建成功的CaRH33‑GUS双元表达载体转入农杆菌中，再通过花絮浸染法转入野生型拟南芥(Col‑0)，收取T0代种子，通过潮霉素筛选，得到CaRH33‑GUS转基因拟南芥植株。转基因拟南芥植株表型上与野生型拟南芥无明显差异，采用实施例3中的GUS染色法对CaRH33‑GUS转基因拟南芥植株进行染色，可以看到蓝色叶片，说明检测到GUS基因的表达，证明CaRH33启动子序列是具有启动子功能的，并能启动外源基因的表达。

[0038] 实施例5 ABA诱导实验

[0039] 以实施例4中获得的CaRH33‑GUS转基因拟南芥植株为ABA诱导实验对象，设置对照组标记为CK，实验组标记为ABA。实验组将在1/2MS中培养7天的转基因拟南芥幼苗移至100μΜABA培养基中处理3h；而对照组将在1/2MS中培养7天的转基因拟南芥幼苗继续在1/2MS中培养3h，再对实验组和对照组进行GUS染色，结果如图2所示。附图2显示，相对于对照组CK的幼苗，经过ABA处理后的幼苗染色后颜色加深，证明CaRH33启动子能够增强外源基因GUS的表达，是一种响应外源ABA诱导表达的诱导型启动子。

[0040] 综上，如实施例1、实施例2和实施例4所述，本发明构建了含有诱导型启动子CaRH33和外源基因(如GUS报告基因)的双元表达载体，并且转入拟南芥，获得CaRH33‑GUS转基因拟南芥植株。实施例4的GUS染色实验证明本发明构建的CaRH33启动子序列是具有启动子功能的，能高效启动外源基因(GUS报告基因)在拟南芥植株中的表达。同时，通过实施例5的ABA诱导实验证明本发明构建的CaRH33启动子还能增强外源基因GUS的表达，是一种响应外源ABA诱导表达的诱导型启动子，其在基因工程以及植物育种的应用方面有着非常重要的价值。

[0041] 本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。