一种信号放大技术在PGP9.5检测试剂盒中的应用

摘要

本发明提供了一种信号放大技术在PGP9.5检测试剂盒中的应用，涉及生物技术领域，该试剂盒包括检测试剂条；其中，检测试剂条包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A的原料包括PGP9.5抗体1；所述试剂B的原料包括PGP9.5抗体2；所述试剂C包括抗FITC抗体。本发明在原有发明基础上进行了改进，增加了“FITC‑抗FITC抗体”信号放大体系，增加了试剂盒的灵敏度，降低了主要原料使用量，降低了材料成本。

权利要求

1.一种PGP9.5检测试剂盒，其特征在于：包括检测试剂条；所述检测试剂条包括试剂A、试剂B和试剂C；

所述试剂A的原料包括PGP9.5抗体1和碱性磷酸酶；所述试剂B的原料包括PGP9.5抗体2和FITC；所述试剂C包括抗FITC抗体；

所述PGP9.5抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列；所述PGP9.5抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列。

2.根据权利要求1所述的PGP9.5检测试剂盒，其特征在于：所述PGP9.5抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述PGP9.5抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的PGP9.5检测试剂盒，其特征在于：还包括校准品和质控品。

4.根据权利要求3所述的PGP9.5检测试剂盒，其特征在于：所述校准品和质控品的原料均包括PGP9.5重组蛋白。

5.根据权利要求1所述的PGP9.5检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂条还包括清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套和吸头。

6.如权利要求1‑5任一项所述的PGP9.5检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）溶剂A的生产：将碱性磷酸酶与PGP9.5抗体1偶联后与缓冲液混匀，得到试剂A；

（2）溶剂B的生产：将FITC与PGP9.5抗体2偶联后与缓冲液混匀，得到试剂B；

（3）溶剂C的生产：将抗FITC抗体连接磁微粒，与缓冲液混合后，得到试剂C。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述PGP9.5抗体1与碱性磷酸酶的重量比为1:1‑2，所述FITC与PGP9.5抗体2的重量比为3‑15:100。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述抗FITC抗体与磁微粒的重量比为

100:3‑20。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、甘油和甘氨酸。

说明书

一种信号放大技术在PGP9.5检测试剂盒中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种信号放大技术在PGP9.5检测试剂盒中的应用。

背景技术

[0002] 创伤性脑损伤(TBI)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。在所有类型TBI中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)(《英国神经外科杂志》，2018)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。TBI是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。

[0003] 疑似TBI的医疗护理流程分为三步，首先是使用15分格拉斯哥昏迷量表(GCS)(美国外科医师学会创伤委员会，1997)对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部CT扫描来可视化骨折和颅内病变。最后根据CT结果制定治疗方案、留院观察或出院。

[0004] 目前，CT扫描是广泛用于帮助临床医师评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而，CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度TBI(有时被称为“脑震荡”)的CT扫描结果呈阴性(Toth，2015)。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预(Papa L，2012)。鉴于这些患者的CT扫描阳性百分比非常低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。

[0005] 脑特异性蛋白产物9.5(PGP9.5)是一种去泛素化酶，也是一种神经系统特异性蛋白。人的PGP9.5由223个氨基酸组成，主要分布于成熟神经元，特别是黑质中，在未分化的中枢神经和周围神经均有分布。PGP9.5作为脑中含量最丰富的蛋白质之一，其含量可占脑可溶蛋白的2％。PGP9.5经由泛素相关途径行使对细胞增生、分化和凋亡的调节功能。在TBI中，PGP9.5在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清PGP9.5显著升高。对TBI的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。专利CN201780080585.4公开了一种针对泛素C末端水解酶L1(UCH‑L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的抗体及相关方法，主要针对已知或疑似患有脑损伤或损害例如轻度创伤性脑损伤等神经损害的个体，提供了相应的方法、系统和试剂盒。但该发明重点保护的是蛋白，相关方法检测时间长、灵敏度低且线性较窄。

[0006] 针对现有技术中存在的问题，提供一种快速、简便能为创伤性脑损伤提供辅助诊断的体外诊断试剂盒十分必要。

发明内容

[0007] 本发明针对现有技术存在的问题，为了能够快速、简便地检测人外周血中脑特异性蛋白产物的含量，提供了一种操作简便、能为创伤性脑损伤提供辅助诊断的体外诊断试剂盒及其制备方法和使用。本发明中的试剂盒是一种采用磁微粒化学发光法定量分析人外周血脑特异性蛋白产物的水平，用于创伤性脑损伤等神经系统疾病的辅助诊断。本发明在原有发明基础上进行了改进，增加了“FITC‑抗FITC抗体”信号放大体系，增加了试剂盒的灵敏度，降低了主要原料使用量，降低了材料成本。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0009] 本发明提供了一种PGP9.5检测试剂盒，包括检测试剂条；所述检测试剂条包括试剂A、试剂B和试剂C；

[0010] 所述试剂A的原料包括PGP9.5抗体1；所述试剂B的原料包括PGP9.5抗体2；所述试剂C包括抗FITC抗体；

[0011] 所述PGP9.5抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列；所述PGP9.5抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列。

[0012] 进一步地，所述PGP9.5抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述PGP9.5抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

[0013] 进一步地，所述试剂A的原料还包括碱性磷酸酶，所述试剂B的原料还包括FITC，所述试剂C的原料还包括抗FITC抗体。

[0014] 进一步地，还包括校准品和质控品。

[0015] 进一步地，所述校准品和质控品的原料均包括PGP9.5重组蛋白。

[0016] 进一步地，其特征在于：所述检测试剂条还包括清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套和吸头。

[0017] 本发明还提供了上述的PGP9.5检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

[0018] (1)溶剂A的生产：将碱性磷酸酶与PGP9.5抗体1偶联后与缓冲液混匀，得到试剂A；

[0019] (2)溶剂B的生产：将FITC与PGP9.5抗体2偶联后与缓冲液混匀，得到试剂B；

[0020] (3)溶剂C的生产：将抗FITC抗体连接磁微粒，与缓冲液混合后，得到试剂C。

[0021] 进一步地，所述PGP9.5抗体1与碱性磷酸酶的重量比为1:1‑2，所述FITC与PGP9.5抗体2的重量比为3‑15:100。

[0022] 进一步地，所述抗FITC抗体与磁微粒的重量比为100:3‑20。

[0023] 进一步地，本发明涉及到缓冲液的组方及配制方法：

[0024] 缓冲液1

[0025] 称取14.8‑15.1g的乙醇胺、5.8‑6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.3～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0026] 表1 缓冲液1配方

[0027]原料名称 称取量
乙醇胺 14.8‑15.1g
氯化钠 5.8‑6.0g
pH值 7.3‑7.6
纯化水 定容至1000mL

[0028] 缓冲液2

[0029] 称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0030] 表2 缓冲液2配方

[0031]原料名称 称取量
甘氨酸 75g
纯化水 定容至1000mL

[0032] 缓冲液3

[0033] 称取12.0‑15.0g的Tris、20.0‑60g的牛血清白蛋白、2.0‑10.0gNaCl、10.0‑100g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～10.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0034] 表3缓冲液3配方

[0035] 原料名称 称取量三羟甲基氨基甲烷 12.0‑15.0g
牛血清白蛋白 20.0‑60g
氯化钠 2.0‑10.0g
蔗糖 10.0‑100g
pH值 7.5‑10.0
纯化水 定容至1000mL

[0036] 缓冲液4

[0037] 称取12.0‑15.0g的Tris、9.0g的NaCl、1.0‑50g的牛血清白蛋白、5.0‑20.0g甘油、5.0‑40g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0038] 表4缓冲液4配方

[0039] 原料名称 称取量三羟甲基氨基甲烷 12.0‑15.0g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 1.0‑50g
甘油 5.0‑20.0g
甘氨酸 5.0‑40g
pH值 7.5‑9.5
纯化水 定容至1000mL

[0040] 缓冲液5

[0041] 称取5.6‑5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.55‑0.60g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、1.0‑50g的牛血清白蛋白、80.0‑140g蔗糖、0.1‑5.0g黄原胶、0.1‑5g海藻酸钠、1.0‑15g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在6.2～8.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0042] 表5缓冲液5配方

[0043] 原料名称 称取量十二水合磷酸氢二钠 5.6‑5.9g
磷酸二氢钠 0.55‑0.60g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 1.0‑50g
蔗糖 80.0‑140g
黄原胶 0.1‑5.0g
海藻酸钠 0.1‑5g
明胶 1.0‑15g
pH值 6.2‑8.0
纯化水 定容至1000mL

[0044] 缓冲液6

[0045] 称取5.6‑5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.55‑0.60g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、0.1‑5.0g的KCl加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0046] 表6缓冲液6配方

[0047] 原料名称 称取量十二水合磷酸氢二钠 5.6‑5.9g
磷酸二氢钠 0.55‑0.60g
氯化钠 9.0g
氯化钾 0.1‑5.0g

[0048] 缓冲液7

[0049] 称取12‑30g的MES(2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸)加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0050] 表7缓冲液7配方

[0051]

[0052]

[0053] 缓冲液8

[0054] 称取2.5‑5.0g的Tris、9.0g的NaCl、5.0‑20.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0055] 表8缓冲液8配方

[0056] 原料名称 称取量三羟甲基氨基甲烷 2.5‑5.0g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 5.0‑20.0g
PH值 7.0‑7.6
纯化水 定容至1000mL

[0057] 缓冲液9

[0058] 称取2.5‑5.0g的Tris、9.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取0.2‑2mL吐温20加入上述容器中，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0059] 表9缓冲液9配方

[0060]原料名称 称取量
三羟甲基氨基甲烷 2.5‑5.0g
氯化钠 9.0g
吐温20 0.2‑2mL
pH值 7.0‑7.6
纯化水 定容至1000mL

[0061] 缓冲液10

[0062] 称取8.5‑15.0g的Tris、9.0g的NaCl、20‑150g牛血清白蛋白、15‑100g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取1‑20mL ProClin300加入上述容器中，调试pH值在7.5～9.2之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0063] 表10缓冲液9配方

[0064]

[0065]

[0066] 缓冲液11

[0067] 称取12‑18g的Tris加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在8.0～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0068] 表11缓冲液9配方

[0069]原料名称 称取量
三羟甲基氨基甲烷 12‑18g
pH值 8.0‑9.5
纯化水 定容至1000mL

[0070] 本发明所取得的技术效果是：

[0071] 1.本专利使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测，与影像学检测手段(主要为CT)相比，本专利更能客观的反映样本的真实情况，减少了因主观判断造成的误判和漏判。

[0072] 2.本专利使用的磁微粒化学发光法可以使检测灵敏度达到皮克级别(10‑12g/mL)，而CT依赖像素达到更高的分辨率。由于本发明是对脑损伤特异性标志物进行检测，检测窗口比CT提前很多。在CT阴性的情况下，即可对正常人和轻度TBI患者进行有效区分，。

[0073] 3.本发明使用全自动仪器进行检测，只需加入血清样本，30分钟即可得到准确结果。而CT检测时间较长，一般需要等待4小时才可能取得检测结果。

[0074] 4.本发明使用浓度数值进行判断，取得结果即可得知患者是否患病，客观性较强。而CT检测需要医师进行阅片，依医师的业务水平，主观判断性较强，容易造成漏判、误判。

[0075] 5.本发明改进了脑特异性蛋白产物9.5(PGP9.5)检测试剂盒的反应体系，提高了灵敏度、增加了信号值、降低了材料成本。

附图说明

[0076] 图1为PGP9.5检测试剂条示意图；

[0077] 图2为本发明的反应流程图；

[0078] 图3为本发明的工艺流程图；

[0079] 图4为FITC‑抗FITC抗体信号放大体系示意图。

具体实施方式

[0080] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0081] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

[0082] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

[0083] 值得说明的是，本发明中使用的磁微粒具体为Sigma RSTREP‑RO；FITC具体为sigma F7250；抗FITC抗体购自Abcam，货号：ab19224；

[0084] 抗体1和抗体2均为自制单克隆抗体；上述单抗制备方法包括以下步骤：

[0085] 1.免疫动物

[0086] 选择BALB/c小鼠作为宿主动物进行免疫，将1‑5mg/mL的抗原溶液(所述的抗原为PGP9.5蛋白，所述的PGP9.5蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示)与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合后进行腹腔注射。在第14天、第35天将1‑5mg/mL的抗原溶液与弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合后进行第二次、第三次免疫，在第56天左右将1‑5mg/mL抗原溶于PBS进行第四次免疫。第61天左右即可进行细胞融合。期间，在第21天、42天分别进行两次滴度测试，观察免疫效果。

[0087] 弗氏完全佐剂：sigma，F5881(货号)

[0088] 弗氏不完全佐剂：sigma，F5506(货号)

[0089] 2.细胞融合及培养

[0090] 将提取的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按计数比1:3混合。混合后加入RPMI 1640培养基定容至40mL，1500rpm离心5分钟后去上清。在37℃水浴融合，期间加入1mL等温的融合剂，静置1分钟后，加入缓慢加入2mL等温的RPMI 1640培养基。混匀后，1500rpm离心5分钟后去上清。将融合的细胞液放入有饲养细胞的培养盘中，在5％浓度的CO2培养箱中37℃培养。

[0091] RPMI 1640培养基：sigma R8758(货号)

[0092] 融合剂：sigma，11363735001(货号)

[0093] 3.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

[0094] 培养7天后，用HAT培养基置换培养液，继续进行培养，14天后进行第二次筛选。第二次筛选采用有限稀释法对细胞进行3‑4次稀释，选择阳性值最高的细胞进行克隆化，以得到合适的细胞株。

[0095] HAT培养基：sigma H0262(货号)

[0096] 4.单克隆抗体制备

[0097] 选择BALB/c小鼠作为宿主，每只小鼠进行0.5‑1mL降植烷腹腔注射。在每只小鼠腹腔内接种2mL细胞浓度在200‑300细胞/mL以内的对数期杂交瘤细胞。在14天后开始抽取小鼠腹水，每次抽取腹水应间隔3天，直至无腹水产生或小鼠转状态不良。使用盐析法及亲合法将小鼠腹水纯化为单克隆抗体。

[0098] 本发明制备得到的PGP9.5抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述的PGP9.5抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。其中，PGP9.5抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列，所述的PGP9.5抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列，所述的重链可变区和轻链可变区通过SEQ ID NO:6所示的柔性连接肽连接。

[0099] 其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

[0100] 5.抗体亲和力检测

[0101] 使用ForteBio Octet QKe生物分子相互作用分析仪，通过生物层干涉测量法检测上述抗体与抗原(所述的抗原为PGP9.5蛋白，所述的PGP9.5蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示)的亲和力(步骤详见说明书或参照Tobias等人，Biomolecular Binding Kinetic Assays in the Octet Platform,Application Note 14,ForteBio,Div.of Pall Life Sciences,2013)。通过检测可知，本申请所述的抗体1的KD(M)值为0.97E‑12，所述的抗体2的KD(M)值为1.14E‑12。

[0102] 1.检测原理

[0103] 本试剂盒采用双抗体夹心法测定PGP9.5的含量。样本中PGP9.5和试剂A中的抗体1及试剂B中的PGP9.5抗体2结合，形成“三明治”夹心结构。加入过量的试剂C，试剂C中的抗FITC抗体与试剂B中的FITC反应，生成“碱性磷酸酶‑抗体1‑PGP9.5‑抗体2‑FITC‑抗FITC抗体‑磁微粒”复合物。经洗涤，发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子。产生的光子数与样本中PGP9.5的浓度成正相关。本发明的反应流程图如图2所示，本发明的工艺流程如图3所示，FITC‑抗FITC抗体信号放大体系示意图如图4所示。

[0104] 2.组分

[0105] 2.1试剂盒组分

[0106] PGP9.5试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成。其中检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本。校准品由含有两个浓度的PGP9.5抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由含有两个浓度的PGP9.5抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。

[0107] 表12 试剂盒主要组分

[0108] 试剂盒主要组分 装量检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个

[0109] 1.2试剂条组分

[0110] 检测试剂条由试剂A、试剂B、试剂C、清洗液(1.3‑2.2g三羟甲基氨基甲烷、8.5‑13.2g NaCl、0.7‑1mL吐温20，定容至1000mL发光底物：Sigma 69086)、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的PGP9.5抗体1溶液；试剂B为含一定浓度FICT标记的PGP9.5抗体2溶液；试剂C为含一定浓度抗FITC抗体标记的磁微粒；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为ALP催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值。试剂条位置及组分如图1所示。

[0111] 表13 试剂条主要组分

[0112]

[0113]

[0114] 3.生产工艺

[0115] 3.1校准品、质控品的生产

[0116] 将PGP9.5重组蛋白(序列如SEQ ID NO:1所示)作为校准品的原料，以缓冲液3将其溶解，充分混合后配制成2个校准品，浓度分别为160pg/mL、1280pg/mL。

[0117] 将PGP9.5重组蛋白作为质控品的原料，以缓冲液3将其溶解，充分混合配制成质控品，浓度为320pg/mL。

[0118] 3.2缓冲液配制以及试剂A、B和C的生产

[0119] 实施例1

[0120] (1)缓冲液的配制

[0121] 缓冲液1：称取14.8g的乙醇胺、5.8g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.3～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0122] 缓冲液2：称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0123] 缓冲液3：称取12.0g的Tris、20.0g的牛血清白蛋白、2.0gNaCl、10.0g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～10.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0124] 缓冲液4：称取12.0g的Tris、9.0g的NaCl、1.0g的牛血清白蛋白、5.0g甘油、5.0g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0125] 缓冲液5：称取5.6g的Na2HPO4·12H2O、0.55g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、1.0g的牛血清白蛋白、80.0g蔗糖、0.1g黄原胶、0.1g海藻酸钠、1.0g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在6.2～8.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0126] 缓冲液6：称取5.6g的Na2HPO4·12H2O、0.55g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、0.1g的KCl加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0127] 缓冲液7：称取12g的MES(2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸)加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0128] 缓冲液8：称取2.5g的Tris、9.0g的NaCl、5.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0129] 缓冲液9：称取2.5g的Tris、9.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取0.2mL吐温20加入上述容器中，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0130] 缓冲液10：称取8.5g的Tris、9.0g的NaCl、20g牛血清白蛋白、15g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取1mL ProClin300加入上述容器中，调试pH值在7.5～9.2之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0131] 缓冲液11：称取12g的Tris加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在8.0～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0132] (2)试剂A的生产

[0133] 将酶标记PGP9.5抗体1偶联物作为试剂A的原料，以缓冲液4将其充分混匀配制成试剂A。

[0134] 具体包括：

[0135] 步骤A1：抗体1的活化：抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2‑亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2‑IT与抗体1摩尔比15:1的比例(即：1mg抗体1加入15μl 2IT溶液)将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入5μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。

[0136] 步骤A2：碱性磷酸酶(ALP)的活化：ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入10μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。

[0137] 步骤A3：抗体1和ALP的连接：抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体1与ALP质量比1:2的比例在抗体1溶液中加入ALP溶液(即：1.0mg抗体1加入2.0mg ALP)。震荡混匀后，将混合物在2℃～8℃环境中反应12‑18小时。

[0138] 步骤A4：抗体1偶联物的终止和纯化：抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1‑10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入4μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入10μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。

[0139] 步骤A5：将得到的为酶标抗体1偶联物与缓冲液4充分混匀配制成试剂A。

[0140] (3)试剂B的生产

[0141] 将FITC标记PGP9.5抗体2偶联物作为试剂B的原料，以缓冲液4将其充分混匀配制成试剂B。

[0142] 具体包括以下步骤：

[0143] 步骤B1：抗体2的除盐：使用缓冲液6作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液6清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液6开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2mL)。

[0144] 将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000rpm、离心10分钟。

[0145] 步骤B2：抗体2连接FITC：称取FITC用缓冲液11配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比3:100的比例(即1mg抗体加入30μg FITC)，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20‑30℃)反应18小时。

[0146] (4)试剂C的生产

[0147] 将抗FITC抗体标记磁微粒作为试剂C的原料，以缓冲液5将其充分混匀配制成试剂C。

[0148] 具体包括以下步骤：

[0149] 步骤C1：磁微粒的清洗

[0150] 选择0.5μm的磁微粒原料充分混匀0.5小时。使用缓冲液7对磁珠进行重悬，浓度为5mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。一共重复三次重悬、分离步骤。

[0151] 步骤C2：磁微粒的重悬

[0152] 使用缓冲液7对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为5mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。

[0153] 步骤C3：抗FITC抗体的选择及除盐

[0154] 按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以1:4的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液6作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液6清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液6开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2mL)。

[0155] 将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000rpm、离心20分钟。

[0156] 步骤C4：磁微粒的活化

[0157] 选择粒径为0.5μm的羧基磁微粒进行活化。(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)将一定量的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液7溶解至4mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:1的比例(即1mg磁微粒加入10ugEDC)，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。

[0158] 步骤C5：活化磁微粒的清洗

[0159] 使用缓冲液7对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为5mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。

[0160] 一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液7将磁微粒进行重悬，浓度为5mg/ml。

[0161] 步骤C6：抗FITC抗体连接磁微粒

[0162] 按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:3的比例(即1mg磁珠加入30ug抗FITC抗体)，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2℃条件下持续混匀反应24小时。

[0163] 步骤C7：抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭

[0164] 在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液8对连接物进行重悬，浓度为5mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。

[0165] 步骤C8：抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗

[0166] 在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液9对连接物进行重悬，浓度为5mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。

[0167] 一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。

[0168] 步骤C9：抗FITC抗体微粒连接物的重悬

[0169] 在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液9对连接物进行重悬，浓度为5mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/20的缓冲液10，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。

[0170] 实施例2

[0171] (1)缓冲液的配制

[0172] 缓冲液1：称取15.1g的乙醇胺、6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.3～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0173] 缓冲液2：称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0174] 缓冲液3：称取15.0g的Tris、60g的牛血清白蛋白、10.0gNaCl、100g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～10.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0175] 缓冲液4：称取15.0g的Tris、9.0g的NaCl、50g的牛血清白蛋白、20.0g甘油、40g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0176] 缓冲液5：称取5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.60g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、50g的牛血清白蛋白、140g蔗糖、5.0g黄原胶、5g海藻酸钠、15g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在6.2～8.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0177] 缓冲液6：称取5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.60g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、5.0g的KCl加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0178] 缓冲液7：称取30g的MES(2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸)加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0179] 缓冲液8：称取5.0g的Tris、9.0g的NaCl、20.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0180] 缓冲液9：称取5.0g的Tris、9.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取2mL吐温20加入上述容器中，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0181] 缓冲液10：称取15.0g的Tris、9.0g的NaCl、150g牛血清白蛋白、100g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取20mL ProClin300加入上述容器中，调试pH值在7.5～9.2之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0182] 缓冲液11：称取18g的Tris加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在8.0～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0183] (2)试剂A的生产

[0184] 将酶标记PGP9.5抗体1偶联物作为试剂A的原料，以缓冲液4将其充分混匀配制成试剂A。

[0185] 具体包括：

[0186] 步骤A1：抗体1的活化：抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2‑亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2‑IT与抗体1摩尔比30:1的比例(即：1mg抗体1加入30μl 2IT溶液)将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。

[0187] 步骤A2：碱性磷酸酶(ALP)的活化：ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入50μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。

[0188] 步骤A3：抗体1和ALP的连接：抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体1与ALP质量比1:1的比例在抗体1溶液中加入ALP溶液(即：1.0mg抗体1加入1.0mg ALP)。震荡混匀后，将混合物在2℃～8℃环境中反应12‑18小时。

[0189] 步骤A4：抗体1偶联物的终止和纯化：抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1‑10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入20μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。

[0190] 步骤A5：将得到的为酶标抗体1偶联物与缓冲液4充分混匀配制成试剂A。

[0191] (3)试剂B的生产

[0192] 将FITC标记PGP9.5抗体2偶联物作为试剂B的原料，以缓冲液4将其充分混匀配制成试剂B。

[0193] 具体包括以下步骤：

[0194] 步骤B1：抗体2的除盐：使用缓冲液6作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液6清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液6开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2.6mL)。

[0195] 将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：8000rpm、离心10分钟。

[0196] 步骤B2：抗体2连接FITC：称取FITC用缓冲液11配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比15:100的比例(即1mg抗体加入150μg FITC)，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20‑30℃)反应18小时。

[0197] (4)试剂C的生产

[0198] 将抗FITC抗体标记磁微粒作为试剂C的原料，以缓冲液5将其充分混匀配制成试剂C。

[0199] 具体包括以下步骤：

[0200] 步骤C1：磁微粒的清洗

[0201] 选择3μm的磁微粒原料充分混匀0.5小时。使用缓冲液7对磁珠进行重悬，浓度为10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。一共重复三次重悬、分离步骤。

[0202] 步骤C2：磁微粒的重悬

[0203] 使用缓冲液7对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为10mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。

[0204] 步骤C3：抗FITC抗体的选择及除盐

[0205] 按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以4:1的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液6作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液6清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液6开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2.6mL)。

[0206] 将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：8000rpm、离心10分钟。

[0207] 步骤C4：磁微粒的活化

[0208] 选择粒径为3μm的羧基磁微粒进行活化。(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)将一定量的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液7溶解至15mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:30的比例(即1mg磁微粒加入300ugEDC)，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。

[0209] 步骤C5：活化磁微粒的清洗

[0210] 使用缓冲液7对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。

[0211] 一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液7将磁微粒进行重悬，浓度为10mg/ml。

[0212] 步骤C6：抗FITC抗体连接磁微粒

[0213] 按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:20的比例(即1mg磁珠加入200ug抗FITC抗体)，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在8℃条件下持续混匀反应16小时。

[0214] 步骤C7：抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭

[0215] 在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液8对连接物进行重悬，浓度为10mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。

[0216] 步骤C8：抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗

[0217] 在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液9对连接物进行重悬，浓度为10mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。

[0218] 一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。

[0219] 步骤C9：抗FITC抗体微粒连接物的重悬

[0220] 在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液9对连接物进行重悬，浓度为10mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/50的缓冲液10，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。

[0221] 实施例3

[0222] (1)缓冲液的配制

[0223] 缓冲液1：称取15.0g的乙醇胺、6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.3～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0224] 缓冲液2：称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0225] 缓冲液3：称取13.0g的Tris、40g的牛血清白蛋白、8.0gNaCl、50g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～10.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。缓冲液4：称取5.8g的13.0g的Tris、9.0g的NaCl、10.0g的牛血清白蛋白、10.0g甘油、10.0g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.5～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0226] 缓冲液5：称取5.8g的Na2HPO4·12H2O、0.58g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、10.0g的牛血清白蛋白、100g蔗糖、2.0g黄原胶、2.0g海藻酸钠、8.0g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在6.2～8.0之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0227] 缓冲液6：称取5.8g的Na2HPO4·12H2O、0.58g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、2.0g的KCl加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0228] 缓冲液7：称取20.0g的MES(2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸)加入纯化水并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0229] 缓冲液8：称取3.0g的Tris、9.0g的NaCl、10.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0230] 缓冲液9：称取3.0g的Tris、9.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取1mL吐温20加入上述容器中，调试pH值在7.0～7.6之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0231] 缓冲液10：称取10.0g的Tris、9.0g的NaCl、100g牛血清白蛋白、80g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取10mL ProClin300加入上述容器中，调试pH值在7.5～9.2之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0232] 缓冲液11：称取15g的Tris加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在8.0～9.5之间并定容至1000ml。用0.22μm的滤膜进行过滤。

[0233] (2)试剂A的生产

[0234] 将酶标记PGP9.5抗体1偶联物作为试剂A的原料，以缓冲液4将其充分混匀配制成试剂A。

[0235] 具体包括：

[0236] 步骤A1：抗体1的活化：抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2‑亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2‑IT与抗体1摩尔比20:1的比例将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入10μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。

[0237] 步骤A2：碱性磷酸酶(ALP)的活化：ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比40:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。

[0238] 步骤A3：抗体1和ALP的连接：抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体1与ALP质量比1:1.5的比例在抗体1溶液中加入ALP溶液(即：1.0mg抗体1加入1.5mg ALP)。震荡混匀后，将混合物在4℃环境中反应15小时。

[0239] 步骤A4：抗体1偶联物的终止和纯化：抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1‑10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入10μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入30μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至1mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。

[0240] 步骤A5：将得到的为酶标抗体1偶联物与缓冲液4充分混匀配制成试剂A。

[0241] (3)试剂B的生产

[0242] 将FITC标记PGP9.5抗体2偶联物作为试剂B的原料，以缓冲液4将其充分混匀配制成试剂B。

[0243] 具体包括以下步骤：

[0244] 步骤B1：抗体2的除盐：使用缓冲液6作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液6清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液6开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2mL)。

[0245] 将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至3mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000rpm、离心20分钟。

[0246] 步骤B2：抗体2连接FITC：称取FITC用缓冲液11配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比9:100的比例(即1mg抗体加入90μg FITC)，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20‑30℃)反应18小时。

[0247] (4)试剂C的生产

[0248] 将抗FITC抗体标记磁微粒作为试剂C的原料，以缓冲液5将其充分混匀配制成试剂C。

[0249] 具体包括以下步骤：

[0250] 步骤C1：磁微粒的清洗

[0251] 选择1.5μm的磁微粒原料充分混匀0.5小时。使用缓冲液7对磁珠进行重悬，浓度为8mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。一共重复三次重悬、分离步骤。

[0252] 步骤C2：磁微粒的重悬

[0253] 使用缓冲液7对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。

[0254] 步骤C3：抗FITC抗体的选择及除盐

[0255] 按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以1:1的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液6作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液6清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液6开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2mL)。

[0256] 将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至2mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000rpm、离心20分钟。

[0257] 步骤C4：磁微粒的活化

[0258] 选择粒径为1.5μm的羧基磁微粒进行活化。(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)将一定量的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液7溶解至10mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:9的比例(即1mg磁微粒加入90ugEDC)，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。

[0259] 步骤C5：活化磁微粒的清洗

[0260] 使用缓冲液7对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。

[0261] 一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液7将磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。

[0262] 步骤C6：抗FITC抗体连接磁微粒

[0263] 按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:15的比例(即1mg磁珠加入150ug抗FITC抗体)，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在4℃条件下持续混匀反应20小时。

[0264] 步骤C7：抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭

[0265] 在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液8对连接物进行重悬，浓度为8mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。

[0266] 步骤C8：抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗

[0267] 在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液9对连接物进行重悬，浓度为8mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。

[0268] 一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。

[0269] 步骤C9：抗FITC抗体微粒连接物的重悬

[0270] 在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液9对连接物进行重悬，浓度为8mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/30的缓冲液10，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。

[0271] 4.检测方法

[0272] 采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：

[0273] 免疫反应：将30uL样本、50uL试剂B、50uL试剂A、50uL试剂C依次加入11号孔位，在37℃条件下反应20min。

[0274] 磁分离及清洗：在12号孔位加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出11号孔位，在12号孔位脱磁。清洗2min后。在13、14号孔位分别进行1次磁分离及清洗。

[0275] 读值：在15号孔位加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出14号孔位，在15号孔位脱磁。碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)。

[0276] 根据检测的校准品数值可获得一条PGP9.5浓度‑发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。

[0277] 样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。

[0278] 5.检测指标

[0279] 分别检测实施例1‑3的相关指标具体如以下所示，其中，批间差、特异性以及瓶间差仅列举实施例1的相关结果。

[0280] 5.1准确度

[0281] 将浓度约为3000pg/mL(允许偏差±10％)的脑特异性蛋白产物(PGP9.5)液(A)加入到浓度范围0pg/mL‑40pg/mL的样本B中，所加入PGP9.5抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率R，其回收率应在90％～110％范围内。

[0282]

[0283] 式中：R为回收率；V为样品A液的体积；V0为血清样品B液的体积；C为血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；C0为血清样品B液的3次测量平均值；CS为样品A液的浓度。

[0284] 5.2空白限

[0285] 将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值 和标准差(SD)。平均值 即为空白限，结果应≤40pg/mL。

[0286] 5.3线性区间

[0287] 将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，在80～2560pg/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。

[0288]

[0289] 式中：r为相关系数；xi为稀释比例；yi为各个样本测定结果均值；为稀释比例的均值； 为样本测定结果总均值。

[0290] 5.4重复性

[0291] 同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值 和标准差SD。按公式(3)计算变异系数(CV)，结果CV≤8％。

[0292]

[0293] 式中：s为样本测试值的标准差；为样本测试值的平均值。

[0294] 5.5批间差

[0295] 用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值 和标准差SD，根据公式(3)得出变异系数(CV)，结果CV≤12％。

[0296] 5.6特异性

[0297] 在不含任何分析物的样本中加入5000pg/mL的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，测3次取均值，按公式(4)计算结果，交叉反应率应小于5％

[0298] RCR＝M/C×100％(4)

[0299] 式中：RCR为交叉反应率；M为交叉反应物测定结果均值；C为交叉反应物标示值。

[0300] 5.7校准品和质控品瓶间差

[0301] 检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次，按公式(5)计算，测定结果的均值与标准差(S1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定5次，计算结果的均值 和标准差(S2)，按照公式(6)、(7)计算瓶间重复性CV％，测量结果应满足2.10要求。

[0302]

[0303]

[0304]

[0305] (说明：当S1

[0306] 式中：S为标准差。

[0307] 6.检测结果

[0308] 6.1准确度

[0309] 表14

[0310]实例 实施例1 实施例2 实施例3
高值样本浓度 3000 3000 3000
低值样本浓度 5 5 5
低值样本平行1 4.123 4.521 5.026
低值样本平行2 4.258 4.669 5.341
低值样本平行3 4.079 4.352 5.297
低值样本均值 4.1533 4.514 5.221
稀释样本平行1 317.502 287.218 311.594
稀释样本平行2 310.629 276.552 306.286
稀释样本平行3 310.996 281.934 309.765
稀释样本均值 313.04 281.901 309.215
回收率 103.10％ 92.61％ 101.51％

[0311] 6.2空白限

[0312] 表15

[0313]

[0314] 6.3线性范围

[0315] 表16

[0316]

[0317] 6.4重复性

[0318] 表17

[0319]

[0320] 6.5批间差

[0321] 表18

[0322]

[0323]

[0324] 6.6特异性

[0325] 表19

[0326]

[0327] 6.7瓶间差

[0328] 表20

[0329]

[0330] 最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。