一种基于双药共组装的兼具光-化疗的仿生纳米粒的制备及其应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备及其应用。所述仿生纳米粒由外壳和所述外壳包覆的纳米内核组成，所述外壳为HepG2细胞膜，所述纳米内核由抗肿瘤疏水性药物索拉非尼、抗心血管疾病疏水性药物普萘洛尔及光敏剂吲哚菁绿共组装形成。所仿生纳米粒能通过细胞膜同源识别作用在肝癌部位特异性积蓄，并在808 nm激光的照射下精准高效释放药物，实现多药‑多疗法联合抗肝癌作用，对肝癌的生长具有显著的抑制作用，在制备抗肝癌药物中具有广大的应用前景。

权利要求

1.一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒，其特征在于，所述仿生纳米粒由外壳和所述外壳包覆的纳米内核组成，所述外壳为真核细胞膜，所述纳米内核由抗肿瘤疏水性药物、抗心血管疾病疏水性药物及光敏剂共组装形成，所述仿生纳米粒的粒径为100‑

400 nm，所述仿生纳米粒在近红外光照射下具有光动力效应；所述真核细胞膜为HepG2细胞膜，所述抗肿瘤疏水性药物为索拉非尼，所述抗心血管疾病疏水性药物为普萘洛尔，所述光敏剂为吲哚菁绿。

2.一种如权利要求1所述的基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）将一定量的抗肿瘤疏水性药物溶于乙醇中，得到溶液A，其中抗肿瘤疏水性药物的浓度为1 μM   1000000 μM；

~

2）将一定量的抗心血管疾病疏水性药物溶于乙醇中，得到溶液B，其中抗心血管疾病疏水性药物的浓度为1 μM   1000000 μM；

~

3）将一定量的光敏剂溶于水中，得到溶液C，其中光敏剂的浓度为1 μM   1000000 μM；

~

4）将1体积份溶液A与1体积份溶液B混合均匀，得到混合溶液AB；取1体积份溶液C加入

17体积份的超纯水中，得到稀释后的溶液C；将2体积份混合溶液AB在涡旋状态下加入至18体积份稀释后的溶液C中，得到溶液D；

5）将1体积份真核细胞膜分散液与10体积份的溶液D混合，在室温下以超声功率250 W、超声频率40 KHz的条件超声10 min，即获得所述仿生纳米粒的水溶液。

3.根据权利要求2所述的基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备方法，其特征在于，所述真核细胞膜分散液的制备方法为：采用差速离心法提取真核细胞膜，将真核细胞膜按照0.002 g / 1 mL的比例溶于超纯水中，即得到真核细胞膜分散液。

4.一种如权利要求1所述的仿生纳米粒在制备抗肝癌药物中的应用。

说明书

一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备及

其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备及其应用。

背景技术

[0002] 肝癌是最常见的原发性肝癌，可由慢性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染、糖尿病等疾病引起。由于其发病隐匿、早期诊断不易、恶性程度高等特点，大多数病人确诊时己达中晚期。加之治疗过程中多药耐药的发展、邻近或远端组织的转移以及严重的副作用，肝癌的死亡率始终居高不下。目前，肝癌的主要治疗手段包括手术切除、肝移植、化疗或放疗等。其中，外科手术切除是早期肝癌治疗的首选方式，但由于受限于较低的早期筛查率，仅有少数病人能从中获益。

[0003] 索拉非尼（Sorafenib, SF）是一种小分子靶向多激酶抑制剂，不仅可以阻断Raf/MEK/ERK信号通路直接干扰肝癌细胞的生长，还可以通过抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR）和血小板源性生长因子受体（PDGFR），阻碍肝癌新生血管的形成，间接遏制肿瘤的发生发展。然而，大量的临床实践表明，即使SF极大改善了肝癌患者的疾病进展，多数患者在治疗后也易出现耐药现象，因此，寻找合适的药物增敏剂成为SF治疗肝癌的一大挑战。目前，已有研究者探究了多种药物增敏剂，以增强肝癌细胞对SF敏感性。中国专利201010587253.5公开了一种含有表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和SF的组合物，其中，EGCG一方面增强了SF对肝癌细胞的抑制作用，另一方面减小了SF的用量，降低了药物使用成本。此外，中国专利201910793921.0也公开了一种将SF与硝普钠联合应用于肝癌治疗的联合用药物，该组合用药同样增加了SF对肝癌细胞的抑制作用，且减少了SF的用药剂量，从而减小了毒副作用。由此可见，药物联用以增强肝癌细胞对SF的敏感性及减小其毒副作用是一种有效的肝癌治疗策略。

[0004] 普萘洛尔（Propranolol, PPL）是一种β肾上腺素受体阻断剂，被广泛应用于心血管疾病的治疗。近年来，有研究指出β肾上腺素受体在多种肿瘤细胞中均有表达，且与肿瘤细胞的增殖、转移、免疫逃逸等行为密切相关。目前，有研究证实，PPL不仅能通过抑制β肾上腺素能受体信号通路从而抑制肝癌细胞增殖，还可以增强肝癌细胞对SF的敏感性，对解除癌细胞的耐药性存在积极作用。因此，将SF与PPL联合使用是一种抑制肝癌发生发展的有效策略。

[0005] 随着纳米科学技术的快速发展，利用纳米生物材料构建药物输送体系为肿瘤治疗带来了新的机遇和挑战。目前，研究者们以开发了多种基于SF的纳米药物递送系统。中国专利201810781142.4公开了一种基于中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物，该药物将SF与质粒共载于中空的介孔二氧化硅中，改善了SF的生物利用度及提高了质粒的转染效率，提高了SF的抗肿瘤效果。中国专利202110518445.9公开了一种负载近红外发射荧光分子/SF的纳米粒子及其制备方法，该纳米粒子将吡咯并吡咯氮杂氟硼化合物与SF共载于高分子共聚物中，增加了SF的水溶性，并为其体内代谢研究提供了荧光检测手段。然而，基于SF与PPL共同构建纳米药物递送系统用于肝癌的协同治疗尚未见报道。

[0006] 基于上述背景，本发明拟构建基于SF和PPL共组装的双药纳米递送系统，该系统借助两种药物间的分子间作用力，共组装形成纳米内核，并引入近红外荧光探针吲哚菁绿（ICG）使纳米药物兼具光疗协同增效的作用，同时，在纳米内核外包裹肝癌细胞来源的仿生细胞膜，使该纳米药物具有肿瘤同源靶向及免疫逃逸的功能。本发明提供的基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒，将多药‑多疗法联用策略整合到同一药物递送平台，有效改善了单一化疗手段对肿瘤抑制作用的局限性，在肝癌治疗领域表现出积极的运用潜力。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备及其应用。本发明通过疏水性药物分子之间的π‑π堆积，静电作用力、疏水相互作用进行共组装，构筑兼具光‑化疗协同作用的纳米内核，并在其外层包覆上肿瘤细胞来源的细胞膜，使其具有良好的肿瘤识别能力和免疫逃逸功能。该仿生纳米粒整合了多药‑多疗法联合应用策略，实现了更好的肿瘤抑制作用。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

[0009] 本发明提供了一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒，所述仿生纳米粒由外壳和所述外壳包覆的纳米内核组成，所述外壳为真核细胞膜，所述纳米内核由抗肿瘤疏水性药物、抗心血管疾病疏水性药物及光敏剂共组装形成，所述仿生纳米粒的粒径为100‑400 nm，并且，所述仿生纳米粒在近红外光照射下具有光动力效应。

[0010] 进一步的，上述一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒中，所述真核细胞膜为HepG2细胞膜。

[0011] 进一步的，上述一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒中，所述抗肿瘤疏水性药物为索拉非尼。

[0012] 进一步的，上述一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒中，所述抗心血管疾病疏水性药物为普萘洛尔。

[0013] 进一步的，上述一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒中，所述光敏剂为吲哚菁绿。

[0014] 本发明还提供了上述一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

[0015] （1）将一定量的抗肿瘤疏水性药物溶于乙醇中，得到溶液A，其中抗肿瘤疏水性药物的浓度为1 μM   1000000 μM；~

[0016] （2）将一定量的抗心血管疾病疏水性药物溶于乙醇中，得到溶液B，其中抗心血管疾病疏水性药物的浓度为1 μM   1000000 μM；~

[0017] （3）将一定量的光敏剂溶于去离子水中，得到溶液C，其中光敏剂的浓度为1 μM   ~1000000 μM；

[0018] （4）将1体积份溶液A与1体积份溶液B混合均匀，得到混合溶液AB；取1体积份溶液C加入17体积份的超纯水中，得到稀释后的溶液C；将2体积份混合溶液AB在涡旋状态下加入至18体积份稀释后的溶液C中，得到溶液D；

[0019] （5）将1体积份真核细胞膜分散液与10体积份溶液D比例混合，在室温下以超声功率250 W、超声频率40 KHz的条件超声10 min，即获得所述仿生纳米粒的水溶液；

[0020] 其中，所述真核细胞膜分散液的制备方法为：采用差速离心法提取真核细胞膜，将真核细胞膜按照0.002 g/1 mL的比例溶于超纯水中，即得到真核细胞膜分散液。

[0021] 本发明还提供了上述一种基于双药共组装的兼具光‑化疗的仿生纳米粒在抗肝癌药物中的应用。

[0022] 本发明的优点在于：

[0023] （1）本发明所制备的仿生纳米粒的内核是由临床一线药物索拉非尼、普萘洛尔，以及FDA批准使用的具有良好安全性的近红外荧光探针吲哚菁绿共组装而成，不含外源性合成载体，具有良好的生物安全性。

[0024] （2）本发明所制备的仿生纳米药物使用的是肝癌细胞HepG2来源的细胞膜，HepG2细胞膜赋予该纳米药物良好的肿瘤靶向性，增强纳米对肿瘤细胞的特异性识别作用。

[0025] （3）本发明所制备的仿生纳米粒在多种生理条件下具有良好的稳定性。

[0026] （4）本发明所制备的仿生纳米粒能够在808 nm激光的照射下，能有效产生活性氧自由基，产生光动力效应，从而干扰肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤的生长。

[0027] （5）本发明所制备的仿生纳米粒的制备过程简单、高效，将多药‑多疗法策略整合于同一纳米药物递送系统，有效改善了单一化疗手段对肿瘤抑制作用的局限性，在肝癌治疗领域表现出积极的运用潜力。

附图说明

[0028] 图1为本发明中索拉非尼、普萘洛尔以及吲哚菁绿的结构式图。І，索拉非尼；ІІ，普萘洛尔；ІІІ，吲哚菁绿。

[0029] 图2为PSINPs的粒径图。

[0030] 图3为CM@PSINPs的粒径图。

[0031] 图4为CM、PSINPs、CM@PSINPs的粒径、电势对比图。

[0032] 图5为CM@PSINPs水溶液常温储存下7天的稳定性。

[0033] 图6为CM@PSINPs在不同生理条件下的稳定性。

[0034] 图7为游离ICG溶液、PSINPs、CM@PSINPs中ICG与的降解速率对比图。

[0035] 图8为不同药物的丁达尔效应。I，ICG；II，SF；III，PPL；IV，PSINPs；V，CM@PSINPs。

[0036] 图9为ICG、PSINPs纳米、CM@PSINPs纳米及游离ICG的荧光发射强度对比图。

[0037] 图10为PSINPs纳米、CM@PSINPs纳米以及游离ICG的单线态氧生成检测对比图。

[0038] 图11为HepG2细胞裂解液、HepG2细胞膜、PSINPs 以及CM@PSINPs的SDS‑PAGE蛋白表征图。泳道I，HepG2细胞裂解液；泳道II，HepG2细胞膜；泳道III，PSINPs；泳道IV，CM@PSINPs。

[0039] 图12为各组纳米药物的细胞增殖抑制作用图。

[0040] 图13为肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02对于不同纳米药物的摄取图。

具体实施方式

[0041] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

[0042] 实施例1

[0043] 本实施例提供了一种普萘洛尔‑索拉非尼‑吲哚菁绿共组装纳米粒（PSINPs）的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0044] 精密称取普萘洛尔（PPL）0.00400 g，将其溶于1 mL乙醇中，得到4 mg/mL溶液A；精密称取索拉非尼（SF）0.00400 g，将其溶于1 mL乙醇中，得到4 mg/mL溶液B；精密称取吲哚菁绿（ICG）0.00400 g，将其溶于1 mL超纯水中，得到4 mg/mL溶液C；取50 μL溶液A与50 μL溶液B混合，得到混合溶液AB；将50 μL溶液C分散于850 μL超纯水中得到稀释后的溶液C；取100 μL混合溶液 AB在涡旋状态下逐滴加入到900 μL 稀释后的溶液C中，即得到所述纳米粒PSINPs的水溶液。

[0045] 如图2所示，本实施例制备所得的PSINPs的平均粒径为150 nm左右。

[0046] 实施例2

[0047] 本实施例提供了HepG2细胞裂解液及HepG2细胞膜沉淀的制备方法，所述方法如下：

[0048] HepG2细胞裂解液的制备：培养HepG2细胞至生长密度为80‑90%，使用含EDTA的0.25 wt%胰酶将其消化3‑5 min，并在1500 rpm条件下离心5 min获得细胞沉淀，沉淀物经生理盐水清洗3次后分散于含有1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的0.25× 生理盐水中，并于4℃冰箱放置1 2小时，即获得HepG2细胞裂解液。
~

[0049] HepG2细胞膜沉淀的制备：培养HepG2细胞至生长密度为80‑90%，使用含EDTA的0.25 wt%胰酶将其消化3‑5 min，并在1500 rpm条件下离心5 min获得细胞沉淀，沉淀物经生理盐水清洗3次后分散于含有1 mM PMSF的0.25× 生理盐水中，并于4℃冰箱放置1 2小~
时；随后将细胞悬液转移至预冷的细胞匀浆器中，缓慢研磨30次使其充分裂解，采用4℃，
1500 rpm低速离心10 min以去除细胞碎片杂质及较大的细胞器，取上清液在4℃，15000 rpm高速离心30 min，所得到的沉淀即为HepG2细胞膜沉淀（CM），将0.002 g CM分散于1 mL超纯水中，即得到HepG2细胞膜分散液，备用。

[0050] 实施例3

[0051] 本实施例提供了一种HepG2细胞膜包裹的PSINPs（CM@PSINPs）的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0052] 将实施例2中收集得到的HepG2细胞膜分散液，与实施例1制得的PSINPs纳米粒的水溶液按1：10的体积比混合后，在常温条件下超声（250 W，40 KHz）10 min，即得到所述纳米粒CM@PSINPs的水溶液。

[0053] 如图3所示，本实施例制备所得的CM@PSINPs的平均粒径为160 nm左右。

[0054] 实施例4

[0055] 使用马尔文粒径仪测定实施例1制得的PSINPs，实施例2中制得的CM以及实施例3制得的CM@PSINPs的粒径及电势。

[0056] 如图4所示，在PSINPs纳米粒表面包裹上细胞膜后，纳米粒径增大约10 nm，且其电势明显减小，更加接近于细胞膜本身的电势，表明细胞膜在纳米表面的成功包裹。

[0057] 实施例5

[0058] 将实施例3制得的CM@PSINPs放置于常温水溶液中储存，并连续7天测定其粒径变化，观察其稳定性。

[0059] 结果如图5所示，仿生纳米粒CM@PSINPs粒径在7天内未发生明显改变，具有良好的稳定性。

[0060] 实施例6

[0061] 将实施例3制得的CM@PSINPs分别置于不同生理条件（DMEM细胞培养基+体积分数10%胎牛血清、RPMI 1640细胞培养基+体积分数10%胎牛血清、DMEM细胞培养基、RPMI 1640细胞培养基）下储存，在不同时间段测定其粒径变化，观察其稳定性。

[0062] 如图6所示，仿生纳米粒CM@PSINPs粒径在多种生理条件下均具有良好的稳定性，储存48 h内纳米粒径未发生明显改变。

[0063] 实施例7

[0064] 将ICG等效浓度均为200 μg/mL的ICG水溶液、PSINPs水溶液，CM@PSINPs水溶液分别放置于25℃下避光储存，并连续7天测定不同组别中ICG降解速度，考察药物中ICG的稳定性。

[0065] 如图7所示，对比游离ICG溶液和PSINPs纳米中ICG的降解速率，细胞膜包裹的纳米组（CM@PSINPs）中的ICG降解速率显著减缓，说明细胞膜的包裹对于ICG的降解起到一定保护作用，能有效维持纳米药物的稳定性。

[0066] 实施例8

[0067] 将200 μg/mL的ICG水溶液、200 μg/mL的SF水溶液、200 μg/mL的PPL水溶液、实施例1中制备的PSINPs纳米粒水溶液，以及实施例3中制备的CM@PSINPs纳米粒水溶液分别置于不同的西林瓶中，用激光笔照射。

[0068] 如图8所示，实施例1中制备的PSINPs纳米粒水溶液，以及实施例3中制备的CM@PSINPs纳米粒水溶液在激光照射下可观察到明显的丁达尔现象，即一束均一的光路，说明了其二者具有明显的纳米形态。

[0069] 实施例9

[0070] 取ICG等效浓度均为0.4 μg/mL的ICG水溶液、PSINPs水溶液，CM@PSINPs水溶液，测定其荧光发射强度。

[0071] 结果如图9所示，对比游离ICG的荧光发射强度，PSINPs的ICG荧光发射强度明显下降，这是由于在SF与PPL共组装的过程中，ICG被包裹于PSINPs纳米内核中，从而导致其荧光发射下降；同时，CM@PSINPs的荧光发射强度相较PSINPs进一步下降，证明细胞膜有效包裹于纳米内核PSINPs的表面。

[0072] 实施例10

[0073] 分别取5.4 μg/mL的ICG水溶液、实施例1中制备的PSINPs纳米粒水溶液，以及实施例3中制备的CM@PSINPs纳米粒水溶液，分别加入终浓度为30 μg/mL 1,3‑二苯基异苯并呋喃（1,3‑DPBF），在不同光照时间后，测415 nm处的紫外吸收，判断不同药物中单线态氧的生成能力。

[0074] 结果如图10所示，相比游离的ICG溶液，PSINPs与CM@PSINP均表现出更好的单线态氧生成能力。在光照10 min后，PSINPs在415 nm处的吸收下降了88.4%，CM@PSINP在415 nm处的吸收下降了91.1%，而ICG在415 nm处的吸收仅下降了20.2%。说明制备成纳米粒后，药物具有更好的单线态氧生成能力，且细胞膜的包裹并不影响这一过程，在光照后产生了更多的单线态氧，表现出更强的光动力治疗潜力。

[0075] 实施例11

[0076] 通过SDS‑PAGE蛋白凝胶电泳实验，考察实施例3中制备的CM@PSINPs纳米粒中细胞膜蛋白的保留情况。具体步骤为：

[0077] （1）制备聚丙烯酰胺凝胶：分别制备12%分离胶和5%浓缩胶，在浓缩胶凝固前插入梳子制备上样孔，待浓缩胶完全凝固后，小心拔出梳子；

[0078] （2）样品制备：将实施例2制得的HepG2细胞裂解液、HepG2细胞膜分散液，实施例1中制备的PSINPs水溶液，以及实施例3中制备的CM@PSINPs分别取1 mL，于4℃、15000 rpm条件下离心30 min，去除上清溶液，将沉淀浓缩于100 μL超纯水中，再各取8 μL分别与2 μL SDS loading buffer（5×）（购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）充分混合，并在95℃下金属浴10 min后使蛋白充分变性，并加入不同的上样孔内；

[0079] （3）电泳：将电泳仪设置为80 V，20 min、100 V，1 h，待样品蛋白充分分开后，停止电泳，取出凝胶；

[0080] （4）染色：将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中，避光染色20 min，待样品充分染色后，用脱色液充分清洗，直至蛋白条带清晰且没有多余残留染色液为止。

[0081] （5）使用化学发光仪拍摄图片。

[0082] 如图11所示，结果表明，以单一的HepG2细胞裂解液、HepG2细胞膜为参照，实施例3中制备的CM@PSINPs充分保留了HepG2细胞的大部分蛋白，在凝胶电泳图中能观察到明显相似的蛋白条带，说明仿生纳米粒CM@PSINPs上基本完整保留了细胞膜上的蛋白，为纳米粒的同源靶向及免疫逃逸功能提供可靠依据。

[0083] 实施例12

[0084] 通过MTT细胞毒性实验，考察不同组别的纳米药物对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用。具体步骤为：

[0085] （1）取对数生长的HepG2细胞，经0.25%胰蛋白酶‑EDTA（1 mM）消化后收集细胞沉4
淀，并将其重悬于新鲜MEM培养基中，随后以1.0 × 10个/孔的密度接种于96孔板中，并置于37℃，5% CO2培养箱持续培养24 h，待细胞完全贴壁，进行后续处理。

[0086] （2）分别设定PSINPs组、PSINPs加光照组、CM@PSINPs组及CM@PSINPs加光照组，将各组纳米药物用培养基稀释至一系列浓度（1、4、8、16、20 μg/mL）。将不同组别的药物加入培育有HepG2细胞的96孔板中孵育，其中PSINs加光照组及CM@PSINPs加光照组在加药4 h后2
用808 nm激光（1 W/cm）照射5 min后继续孵育。

[0087] （3）待药物作用24 h后，去除旧的含药培养基，将0.05 mg/mL MTT溶液按100 μL/孔添加到每个孔中，继续孵育4 h。随后在每个孔中添加100 μL DMSO溶解蓝紫色甲瓒结晶，并通过酶标仪测定其在570 nm波长处的吸光度值，计算其细胞增殖抑制率。

[0088] 结果如图12所示，经计算可知，PSINPs、CM@PSINPs、PSINPs+光照组及CM@PSINPs加光照组的IC50值分别为9.34 μg/mL、16.71 μg/mL、5.10 μg/mL、3.41 μg/mL。该结果表明，PSINPs具有明显的细胞杀伤能力，且在引入光照后，PSINPs的细胞毒性进一步加强，说明该纳米粒具有一定的光‑化疗协同作用；在PISNPs纳米外层包裹上细胞膜后，药物的细胞毒性有所下降，推测是由于纳米粒被细胞膜包裹后药物释放减少；然而，在此基础上引入光照后，CM@PSINPs的细胞增殖抑制作用显著增强，推测是由于在光照条件下，光敏剂ICG引起纳米粒温度升高导致细胞膜脱落，进而触发纳米粒的有效释放，值得注意的是，CM@PSINPs+光照组的细胞毒性甚至明显强于PSINPs+光照组，这是由于CM@PSINPs外层包裹HepG2仿生膜，HepG2细胞对其同源摄取增加，因此在光照后能够在细胞内部高效释放药物，导致细胞杀伤能力显著增强。

[0089] 实施例13

[0090] 通过激光共聚焦显微镜监测不同细胞对不同纳米药物的摄取情况。具体步骤为：

[0091] （1）将肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02分别以2.0 × 105个/孔的密度接种于12孔板中，并在37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h。待细胞完全贴壁，进行后续处理。

[0092] （2）配置ICG溶液，制备PSINPs、CM@PSINPs纳米药物，分别将其稀释至ICG等效浓度均为2 μg/mL后，加入不同细胞中孵育4 h。

[0093] （3） 除去旧培养基，将细胞用生理盐水清洗3遍后，加入Hoechst 33342染色液孵育10 min，再用生理盐水清洗细胞两遍，并用抗荧光猝灭剂封片，使用激光共聚焦显微镜拍摄细胞的摄取情况。

[0094] 结果如图13所示，HepG2细胞用CM@PSINPs处理后表现出最强的荧光，这说明HepG2细胞对于CM@PSINPs的摄取要显著强于对游离的ICG以及PSINPs纳米的摄取，说明在纳米药物PSINPs表面包裹上HepG2细胞膜后，CM@PSINPs具有良好的同源靶向能力；同时，正常肝细胞L02对于PSINPs及CM@PSINPs均不存在明显的摄取，说明纳米粒对于正常肝细胞具有良好的安全性，为其在体内的生物应用奠定了实验基础。

[0095] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。