高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用转让专利
申请号 : CN202210477686.8
文献号 : CN114569709B
文献日 : 2022-07-12
发明人 : 赵李祥 , 冯天云 , 易诚 , 葛友桢 , 胡洪鹏 , 蒋剑豪 , 钟天翼
申请人 : 苏州慧疗生物医药科技有限公司 , 苏州大学
摘要 :
本发明提供了高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用，通过PCR方法从B16细胞中扩增出ADAM‑28基因，将其克隆入慢病毒载体中构建重组慢病毒，用重组慢病毒感染B16‑F10细胞，得到高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞系，通过辐照灭活后，得到黑色素瘤自体肿瘤疫苗。本发明首次制备高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞系，并以此制备得到黑色素瘤自体肿瘤疫苗。通过小鼠肿瘤模型，验证了该疫苗高效激活CD8+ T细胞免疫应答，具有明显的肿瘤免疫预防效果，从而可以将其应用在制备肿瘤的免疫预防药物领域中，特别是黑色素瘤。
权利要求 :
1.一种高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.携带ADAM‑28基因的Venus载体的构建：设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经B amH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus‑ADAM28；
S2. 高表达ADAM‑28基因的黑色素瘤细胞系的构建：将S1获得的阳性质粒Venus‑ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG共转染293T细胞，获得重组慢病毒；再将获得重组慢病毒感染黑色素瘤细胞B16‑F10，然后筛选出过表达ADAM‑ 28的B16‑F10细胞，通过定量PCR的方法鉴定出高表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，下称B16‑Adam28细胞；
S3.高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤疫苗的制备：收集培养密度达70%‑80%的B16‑Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行辐照
5 6
处理，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液重悬至10‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗；
所述步骤S1中一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物分别为：引物1 Seq NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；
引物2 Seq NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG。
2.根据权利要求1所述的高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述S1中以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因的条件为：
94℃预变性4min；
94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
72℃延伸10min；
12℃冷却30min。
3.根据权利要求1所述的高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述S2中阳性质粒Venus‑ADAM28，辅助质粒ΔR，辅助质粒REV和辅助质粒VSVG混合比例为质量比(10‑11):(6.5‑7):(2.3‑2.8):(3‑3.5)。
4.根据权利要求1所述的高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述S3中辐照处理为用γ射线辐照，辐照剂量为50‑100Gy。
5.如权利要求1所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法制备得到的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
6.如权利要求5所述黑色素瘤自体肿瘤疫苗在制备黑色素瘤预防药物中的应用。
说明书 :
高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备及其应用。
背景技术
[0002] 黑色素瘤是由黑色素细胞而恶变引发的一种皮肤癌，主要是由紫外线(UV)诱导DNA发生突变而产生，多发生于皮肤，偶发于粘膜和内脏，具有高侵染性，易复发等特点。黑色素瘤是第三常见的皮肤癌，黑色素瘤的发病率上升迅速，是发病率上升最高的癌症之一，+其中转移性黑色素瘤具有很高的致命性，是最致命的皮肤癌。免疫系统主要通过CD8 T细胞介导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL) 效应来杀灭肿瘤细胞。T细胞应答过程依赖于细胞的定向运动及免疫识别，整合素是介导该过程的重要分子，其表达水平与机体的抗肿瘤免疫效应息息相关。ADAM‑28属于去整合素金属蛋白酶家族的一员，在免疫细胞运动和识别中起重要作用。
[0003] 目前，关于ADAM‑28与黑色素瘤的相关研究比极少。通过对公共数据库的分析，我们的研究发现：恶性黑色素瘤细胞中ADAM‑28的表达水平极低；而且ADAM28的表达水平越高，黑色素瘤患者预后越好。因此， ADAM‑28很可能在免疫系统对抗黑色素瘤的过程中起重要作用；高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞可能更易激发抗肿瘤免疫应答，具备成为自体黑色素瘤苗的潜力。
发明内容
[0004] 要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿+瘤疫苗的制备方法，由此制备的肿瘤疫苗能激发机体高水平的CD8 T细胞应答，可用于制备肿瘤的免疫预防药物。
[0005] 技术方案：一种高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0006] S1.携带ADAM‑28基因的Venus载体的构建：
[0007] 设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经BamH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus‑ADAM28；
[0008] S2. 高表达ADAM‑28基因的黑色素瘤细胞系的构建：
[0009] 将S1获得的阳性质粒Venus‑ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG共转染293T细胞，获得重组慢病毒；再将获得重组慢病毒感染黑色素瘤细胞B16‑F10，然后筛选出过表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，通过定量PCR的方法鉴定出高表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，下称B16‑Adam28细胞；
[0010] S3.高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤疫苗的制备：
[0011] 收集培养密度达70%‑80%的B16‑Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行5 6
辐照处理，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液重悬至10 ‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗；
辐照处理，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液重悬至10 ‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗；
[0012] 所述步骤S1中一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物分别为：
[0013] 引物1 SEQ NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；
[0014] 引物2 SEQ NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG。
[0015] 优选的，所述S1中以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因的条件为：
[0016] 94℃预变性4min；
[0017] 94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
[0018] 94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0019] 94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0020] 94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0021] 94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
[0022] 72℃延伸10min；
[0023] 12℃冷却30min。
[0024] 优选的，所述S2中阳性质粒Venus‑ADAM28，辅助质粒ΔR，辅助质粒REV和辅助质粒VSVG混合比例为质量比(10‑11):(6.5‑7):(2.3‑2.8):(3‑3.5)。
[0025] 优选的，所述S3中辐照处理为用γ射线辐照，辐照剂量为50‑100Gy。
[0026] 上述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法制备得到的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
[0027] 上述黑色素瘤自体肿瘤疫苗在制备肿瘤预防及治疗药物中的应用。
[0028] 优选的，所述肿瘤为黑色素瘤。
[0029] 有益效果：本发明的高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用，具有以下优点：
[0030] 1. 通过PCR方法从B16细胞中扩增出ADAM‑28基因，将其克隆入慢病毒载体中构建重组慢病毒，用重组慢病毒感染B16‑F10细胞，得到高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞系，通过辐照灭活后，得到黑色素瘤自体肿瘤疫苗，该疫苗经体内试验证明具有肿瘤免疫预防效果；
[0031] 2. 本发明构建的高表达ADAM‑28的B16‑F10细胞（疫苗）ADAM‑28表达水平显著提+高；射线处理过的B16‑Adam28细胞接种小鼠后，可显著提高小鼠脾脏中CD8 T细胞的应答；
+
射线处理过的B16‑Adam28细胞对B16‑F10细胞的生长具有显著的抑制作用，并激活CD8 T细胞应答；提示B16‑Adam28细胞可作为自体瘤苗用于黑色素瘤的预防，本发明首次构建了高表达ADAM‑28的黑色素瘤稳转细胞系，并对其活化T细胞应答和对黑色素瘤的预防效应进行了相关研究，从而为其在预防黑色素瘤中的应用提供了直接的证据；
+
射线处理过的B16‑Adam28细胞对B16‑F10细胞的生长具有显著的抑制作用，并激活CD8 T细胞应答；提示B16‑Adam28细胞可作为自体瘤苗用于黑色素瘤的预防，本发明首次构建了高表达ADAM‑28的黑色素瘤稳转细胞系，并对其活化T细胞应答和对黑色素瘤的预防效应进行了相关研究，从而为其在预防黑色素瘤中的应用提供了直接的证据；
[0032] 3. 本发明首次制备高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞系，并以此制备得到黑色素瘤+自体肿瘤疫苗。通过小鼠肿瘤模型，验证了该疫苗高效激活CD8 T细胞免疫应答，具有明显的肿瘤免疫预防效果，从而可以将其应用在制备肿瘤的免疫预防药物领域中，特别是黑色素瘤。
附图说明
[0033] 图1为实施例2中高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞的流式细胞图；
[0034] 图2为实施例2中高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞的显著性差异分析图；
[0035] 图3为实施例3中肿瘤体积与时间的关系图；
[0036] 图4为实施例4中自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8+ T细胞比例的流式细胞图；
[0037] 图5为实施例4中自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8+ T细胞比例的显著性差异分析图（图中比例为百分比%）；
[0038] 图6为实施例4中自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8+ T细胞分泌IFN‑γ的促进作用图（图中比例为百分比%）；
[0039] 上述附图中，* 表示差异具有显著性： * p<0.05，***p<0.0001。
具体实施方式
[0040] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0041] 实施例1
[0042] 一种高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0043] S1.携带ADAM‑28基因的Venus载体的构建：
[0044] 设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，特异性引物序列如下：引物1 SEQ NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；引物2 SEQ NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG；使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经BamH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus‑ADAM28，其中，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因的条件为：
[0045] 94℃预变性4min；
[0046] 94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
[0047] 94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0048] 94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0049] 94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0050] 94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
[0051] 72℃延伸10min；
[0052] 12℃冷却30min；
[0053] S2. 高表达ADAM‑28基因的黑色素瘤细胞系的构建：
[0054] 通过CaCl2转染法将步骤S1获得的阳性质粒Venus‑ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG共转染293T细胞，转染体系为1000ul混合体系，其中包括ΔR为6.5ug、REV为2.3ug、VSVG为3.5ug、Venus‑ADAM28为11ug、2×HBSS 500ul、余量为超纯水，将阳性质粒Venus‑ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG静置15min加入293T细胞中，混匀，培养8h后更换培养基，继续培养48h；使用荧光显微镜蓝光条件观察细胞状态，观察到绿色荧光即收集培养基，并用0.45um过滤器过滤，获得重组慢病毒；再将200000个黑色素瘤细胞B16‑F10加入6孔板中，加入2ml DMEM培养基和1mL重组慢病毒液，在1800rpm室温离心1h，感染12h，获得重组慢病毒感染黑色素瘤细胞B16‑F10，使用荧光显微镜观察细胞状态，通过流式分选仪器，以绿色荧光蛋白为标记，然后筛选出过表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，使用流失细胞术检测纯度，提取过表达ADAM‑28的B16‑F10细胞的RNA，通过定量PCR的方法鉴定出高表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，下称B16‑Adam28细胞；
[0055] S3.高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤疫苗的制备：
[0056] 收集培养密度达70%‑80%区间范围的B16‑Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行γ射线辐照处理，辐照剂量为100Gy，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀5 6
以磷酸盐缓冲液重悬至10 ‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
以磷酸盐缓冲液重悬至10 ‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
[0057] 实施例2
[0058] 一种高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0059] S1.携带ADAM‑28基因的Venus载体的构建：
[0060] 设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，特异性引物序列如下：引物1 SEQ NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；引物2 SEQ NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG；使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经BamH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus‑ADAM28，其中，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM‑28基因的条件为：
[0061] 94℃预变性4min；
[0062] 94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
[0063] 94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0064] 94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0065] 94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
[0066] 94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
[0067] 72℃延伸10min；
[0068] 12℃冷却30min；
[0069] S2. 高表达ADAM‑28基因的黑色素瘤细胞系的构建：
[0070] 通过CaCl2转染法将步骤S1获得的阳性质粒Venus‑ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG共转染293T细胞，转染体系为1000ul混合体系，其中包括ΔR为7ug、REV为2.8ug、VSVG为3ug、Venus‑ADAM28为10ug、2×HBSS 500ul、余量为超纯水，将阳性质粒Venus‑ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG静置15min加入293T细胞中，混匀，培养6h后更换培养基，继续培养48h；使用荧光显微镜蓝光条件观察细胞状态，观察到绿色荧光即收集培养基，并用0.45um过滤器过滤，获得重组慢病毒；再将200000个黑色素瘤细胞B16‑F10加入6孔板中，加入2ml DMEM培养基和1mL重组慢病毒液，在1800rpm室温离心1h，感染12h，获得重组慢病毒感染黑色素瘤细胞B16‑F10，使用荧光显微镜观察细胞状态，通过流式分选仪器，以绿色荧光蛋白为标记，然后筛选出过表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，使用流失细胞术检测纯度，提取过表达ADAM‑28的B16‑F10细胞的RNA，通过定量PCR的方法鉴定出高表达ADAM‑28的B16‑F10细胞，下称B16‑Adam细胞；
[0071] S3.高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤疫苗的制备：
[0072] 收集培养密度达70%‑80%区间范围的B16‑Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行γ射线辐照处理，辐照剂量为100Gy，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀5 6
以磷酸盐缓冲液重悬至10 ‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
以磷酸盐缓冲液重悬至10 ‑10个/mL，然后离心收集细胞沉淀，即得所述高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
[0073] 对比例1
[0074] 采用Venus替换实施例2中的阳性质粒Venus‑ADAM28作为对照，其他工艺条件均与实施例2中相同，得到对比例细胞（疫苗）为B16‑V细胞。
[0075] 对比例2
[0076] 采用未感染病毒的黑色素瘤细胞作为对照，得到对比例细胞（疫苗）为B16细胞。图1中的结果表明，Venus和Venus‑ADAM28病毒均能高效的感染B16细胞，得到B16‑Venus和B16‑Adam28细胞系。图2中定量PCR的结果表明，B16‑Adam28细胞中ADAM‑28基因的表达水平是对照细胞B16和B16‑Venus的7000倍。这些结果表明，通过本发明中的构建方法得到了高表达ADAM‑28的黑色素瘤细胞系B16‑Adam28。
[0077] 实施例3
[0078] 动物实验：
[0079] 实验分组：试验分3组，分别为γ射线辐照过的B16细胞（对比例2）、B16‑Venus细胞6
（对比例1）和B16‑Adam28细胞（实施例2）。C57BL/6小鼠分别用1×10个疫苗（50uL）免疫2
4
次，免疫间隔期为2周。最后一次免疫后两周，小鼠腹部皮下接种5×10 个B16‑F10细胞，观测肿瘤生长情况。
（对比例1）和B16‑Adam28细胞（实施例2）。C57BL/6小鼠分别用1×10个疫苗（50uL）免疫2
4
次，免疫间隔期为2周。最后一次免疫后两周，小鼠腹部皮下接种5×10 个B16‑F10细胞，观测肿瘤生长情况。
[0080] 图3为肿瘤体积与时间的关系，可以看出B16‑Adam28组肿瘤生长速度较其它组均有显著下降，差异显著；该结果表明，本发明公开的高表达ADAM‑28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗具有很好的肿瘤免疫预防效果。
[0081] 实施例4
[0082] 取实施例3中的小鼠，在接种肿瘤18天后处死，收集小鼠脾脏细胞，通过细胞计数+ 及流式细胞术分析CD8 T细胞的比例。
[0083] 图4和5为上述自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8+ T细胞比例的影响图（包括图4的流式细胞图和图5的显著性差异分析图），可以看出接种高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤苗组小鼠+ 脾脏中IFN‑γ阳性的CD8 T细胞显著高于其它组。
[0084] 图6为上述自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8+ T细胞分泌IFN‑γ的促进作用图，可以看出+胞内染色的结果表明高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤苗组中IFN‑γ阳性的CD8 T细胞显著高于其它组；
[0085] 以上结果说明本发明公开的高表达ADAM‑28的自体黑色素瘤苗可以诱导高水平的+CD8 T细胞抗肿瘤免疫应答，并显著预防黑色素瘤。
[0086] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。