蛋白抑制剂及其应用

摘要

一类Legumain蛋白抑制剂及其应用，其结构式为该抑制剂能够特异性抑制肿瘤细胞中高表达的Legumain蛋白，通过与Legumain蛋白的结合域结合，抑制其活性并降低蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并诱导降低肿瘤细胞对化疗的耐受能力，具有特异性好，生物利用度高，无肝肾毒副作用等特点，可用于治疗乳腺癌，其作用机制明确，能有效抑制肿瘤的转移和侵袭。

权利要求

1.一类Legumain蛋白抑制剂，其特征在于，为以下任一一种结构及其药学上可接受的盐：① ②

③ ④

⑤ ⑥

⑦ 以及⑧

2.一种合成权利要求1所述Legumain蛋白抑制剂①、②、③、⑤、⑥或⑧的方法，其特征在于，以CH3CH(NH2)COOH为原料，加入CH3CHO、NaBH3CN并以H2O和CH3OH为溶剂混合后室温反应得到CH3CH[N(CH2CH3)2]COOH；通过加入NH2NHBoc、EDC、HOBt、DIEA并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc；进一步加入TFA、DCM并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNH2TFA，再加入NH2COCH2Br、K2CO3并以THF为溶剂室温反应得到CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNHCH2CONH2，最后加入ClCOCH2R，Na2CO3并以THF为溶剂室温反应得到CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHN(COCH2R)CH2CONH2；

所述的方法的合成路线具体为：

其中：基团R如权利要求1中化合物①、②、③、⑤、⑥或⑧结构式所示。

3.根据权利要求2所述的Legumain蛋白抑制剂的合成方法，其特征是，具体包括：步骤1)将原料CH3CH(NH2)COOH溶于冰水和甲醇的混合溶剂中，然后将NaBH3CN分批加入，搅拌几分钟后逐滴滴加乙醛后在室温下反应，然后将浓盐酸缓慢加入调节pH至1.5，并进一步反应后进行TLC检测反应，反应结束后先旋掉甲醇，然后加二氯甲烷萃取杂质，将水相旋干后加入甲醇溶解硅胶拌样，再用柱层析纯化后得到黄色油状物CH3CH[N(CH2CH3)2]COOH；

步骤2)将CH3CH[N(CH2CH3)2]COOH溶解于二氯甲烷中，分别加入NH2NHBoc，EDC，HOBT，最后加入DIEA，反应后TLC检测并加水洗涤及二氯甲烷萃取，得到CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc；

步骤3)将CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc溶解于二氯甲烷中，加入TFA，室温过夜反应后TLC检测并旋干溶剂后柱层析纯化，得到黄色油状物CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNH2TFA；

步骤4)将CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNH2TFA溶解于THF中，分别加入NH2COCH2Br和碳酸钾，室温反应后TLC检测并直接加硅胶拌样旋干后柱层析纯化，得到黄色油状物CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNHCH2CONH2；

步骤5)将CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHNHCH2CONH2溶解于THF中，先加入碳酸钠，然后在低温下缓慢加入ClCOCH2R，滴加完之后在室温下反应后TLC检测并加水洗涤，乙酸乙酯萃取旋干后柱层析纯化后得到白色固体CH3CH[N(CH2CH3)2]CONHN(COCH2R)CH2CONH2即化合物。

4.一种基于权利要求1所述Legumain蛋白抑制剂的应用，其特征在于，将其用于制备抗肿瘤药物；

所述的肿瘤为人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231和/或小鼠高转移性乳腺癌细胞4T1.2。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述的药物，其有效剂量为1mg‑800mg/天。

说明书

蛋白抑制剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种医药领域的技术，具体是一类小分子天冬酰胺内肽酶(Legumain) 蛋白抑制剂及其应用

背景技术

[0002] 天冬酰胺内肽酶(又称AEP)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其结构相当保守，是目前已知的哺乳动物体内唯一的天冬酰胺内肽酶，可特异性水解天冬氨酸肽键，在细胞内发挥剪切蛋白与信号转导的作用，与抗原呈递、肿瘤、阿尔兹海默症、肝损伤、肾损伤等病理生理过程密切相关，对Legumain在肿瘤中的机制研究显示，其具有对肿瘤中的重要通路PI3K‑ AKT‑mTOR的调节作用，Legumain高表达时会上调这一通路的表达，从而减少细胞粘附，抑制细胞凋亡，增强肿瘤细胞抗化疗能力加强肿瘤生长，促进肿瘤血管生成和调节上皮‑间质转化(EMT)来促进乳腺癌的侵袭和转移。除这一通路外，Legumain还通过对NF‑κB通路、Erk 通路等的调控作用发挥促进肿瘤生长的作用。免疫组化实验显示Legumain在包括乳腺癌在内的多种癌种中高表达，其在肿瘤内部的高表达被认为和不良预后，临床分期等高度相关。因此Legumain有望成为新的肿瘤靶向治疗靶标。

[0003] 现有针对Legumain开发的抑制剂主要包括寡核苷酸类，天然药物分子类，小分子化合物类等，但寡核苷酸类抑制剂体内稳定性差，易降解，生物利用度低；天然药物分子类成分复杂，具有多靶点效应，机制尚不明确；部分小分子化合物类存在特异性不足，生物利用度低等问题。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一类Legumain蛋白抑制剂及其应用，能够特异性抑制肿瘤细胞中高表达的Legumain蛋白，通过与Legumain蛋白的结合域结合，抑制其活性并降低蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并诱导降低肿瘤细胞对化疗的耐受能力，具有特异性好，生物利用度高，无肝肾毒副作用等特点，可用于治疗乳腺癌，其作用机制明确，能有效抑制肿瘤的转移和侵袭。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 本发明涉及一类Legumain蛋白抑制剂的合成方法，以CH2CH(NH2)COOH为原料，加入为CH3CHO、NaBH3CN并以H2O和CH3OH为溶剂混合后室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH；通过加入肼基甲酸叔丁酯(NH2NHBoc)、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺(EDC)、1‑羟基苯并三氮唑(HOBt)、N,N‑二异丙基乙胺(DIEA)并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc；进一步加入三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷(DCM)并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNF2TFA，再加入NH2COCH2Br、 K2CO3并以四氢呋喃(THF)为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHCH2CONH2，最后加入ClCOCH2R，Na2CO3并以THF为溶剂室温反应得到 CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2R)CH2CONH2。

[0007] 所述的方法的合成路线具体为：

[0008]

[0009] 其中：基团R为H、C1‑6烷基、C2‑6不饱和脂肪链烷基、C2‑6不饱和脂肪链羟基、C3‑6环烷基、卤代C1‑6烷基、羟基C1‑6烷基、氨基C1‑6烷基、卤代C2‑6不饱和脂肪链烷基、C1‑6烷基‑ C3‑6环烷基或卤代C3‑6环烷基。

[0010] 本发明涉及一类Legumain蛋白抑制剂，其化学结构式为：

[0011]

[0012] 所述的Legumain蛋白抑制剂优选为以下任一一种结构及其药学上可接受的盐或氘代物：

[0013] ① ②③ ④
⑤ ⑥
⑦ 以及⑧

[0014] 本发明涉及一种基于上述Legumain蛋白抑制剂的应用，将其用于制备抗肿瘤药物或抗阿尔兹海默症药物。

[0015] 所述的肿瘤，具体为人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231或小鼠高转移性乳腺癌细胞4T1.2。

[0016] 所述的药物，其有效剂量优选为1mg‑800mg/天。

[0017] 技术效果

[0018] 与现有技术相比，本发明合成路线步骤较少，反应条件简单，工业合成门槛较低，具有较好的工业实用性，制备得到的抑制剂在不具备细胞毒性的基础上，抑制肿瘤细胞转移侵袭，并结合对破骨细胞的抑制效果对乳腺癌细胞骨转移具有抑制作用。

附图说明

[0019] 图1为实施例中S6(CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2Cl)CH2CONH2)的核磁共振图谱1H‑NMR(400MHz，DMSO‑d6)；

[0020] 图2A‑D分别为实施例中化合物①药物与AEP酶分子对接后的活化能变化、结合位点示意图；

[0021] 图2E、F为实施例中给予不同浓度化合物①后AEP酶活性的时间变化规律及差异倍数示意图；

[0022] 图2G、H为实施例中给予不同浓度化合物①后在细胞与上清液中AEP的酶活性及差异倍数示意图，其中图2G为实施例中化合物①处理4T1.2细胞96h后AEP的表达水平示意图；

[0023] 图2I、J为实施例中化合物①处理4T1.2细胞与4T1.2 AEP KO细胞96h后AEP的表达水平及差异倍数示意图；

[0024] 图3A‑F分别为实施例中给予化合物①后E‑cadherin、Snail、MMP‑9蛋白的表达情况示意图；

[0025] 图4A为实施例中乳腺癌细胞MDA‑MB‑23与4T1.2细胞在给予化合物①的情况下细胞活力实验结果示意图；

[0026] 图4B‑E分别为实施例中4T1.2细胞与MDA‑MB‑231细胞划痕实验结果示意图；

[0027] 图4F为实施例中不同浓度化合物①与AEP KO刺激后的侵袭细胞示意图；

[0028] 图4G为对应的统计图；

[0029] 图5为实施例中4组小鼠的生存曲线示意图；

[0030] 图6A‑D分别为实施例中PBS、0.44mg/ml表柔比星、0.44mg/ml表柔比星+0.7mg/ml 化合物①、0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml化合物①四组小鼠的生物发光结果示意图；

[0031] 图7A‑D分别为实施例中PBS、0.44mg/ml表柔比星、0.44mg/ml表柔比星+0.7mg/ml 化合物①、0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml化合物①四组小鼠骨样本的X射线CT结果示意图；

[0032] 图7E为实施例中4组样本的骨侵蚀体积示意图；

[0033] 图7F为实施例中4组样本骨表面积和骨体积的比值示意图；

[0034] 图7G、H分别为实施例中PBS组与0.44mg/ml表柔比星组示意图；

[0035] 图7I为实施例中0.44mg/ml表柔比星+化合物①组示意图；

[0036] 图7J‑M为实施例中四组小鼠骨切片的TRAP染色结果示意图；

[0037] 图7N为实施例中四组切片中的破骨细胞数量示意图。

具体实施方式

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例涉及化合物①的合成路线如下，化合物②～化合物⑧采用类似方式亦可制备得到：

[0040]

[0041] 本实施例具体包括以下步骤：

[0042] 步骤1)将原料S1，即CH2CH(NH2)COOH溶于冰水和甲醇的混合溶剂中，然后将 NaBH3CN分批加入，搅拌几分钟后逐滴滴加乙醛(先加入5当量)。滴加完毕后在室温下反应6 小时，再加入剩余5当量的乙醛，反应两小时。然后将浓盐酸缓慢加入调节pH至1.5，并在 40℃下反应1.5小时。

[0043] 后处理过程：TLC检测反应(DCM:MeOH＝7:1)。反应结束后，先旋掉甲醇，然后加二氯甲烷萃取杂质，产品在水相中，旋干水相后加入甲醇溶解硅胶拌样。然后用柱层析纯化 (DCM:MeOH:水＝1000:100:5)后得到黄色油状物S2，即CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH共9.6g。

[0044] 步骤2)将S2，即CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH溶解于二氯甲烷中，分别加入 NH2NHBoc，EDC，HOBT，最后加入DIEA，室温反应2小时。

[0045] 后处理过程：TLC检测反应。反应结束后，加水洗涤，二氯甲烷萃取，得到S3，即 CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc粗品直接投下一步。

[0046] 步骤3)将S3，即CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc溶解于二氯甲烷中，加入TFA，室温过夜反应。

[0047] 后处理过程：TLC检测反应。反应结束后，旋干溶剂后柱层析纯化(DCM:MeOH ＝20:1)后得到黄色油状物S4，即CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNF2TFA共3.6g。

[0048] 步骤4)将S4，即CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNF2TFA溶解于THF中，分别加入 NH2COCH2Br和碳酸钾，室温反应24小时。

[0049] 后处理过程：TLC检测反应。反应结束后，直接加硅胶拌样旋干后柱层析纯化 (DCM:MeOH：氨水＝200:20:1)后得到黄色油状物S5，即 CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHCH2CONH2共2g。

[0050] 步骤5)将S5，即CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHCH2CONH2溶解于THF中，先加入碳酸钠，然后在低温下缓慢加入ClCOCH2R，滴加完之后在室温下反应2小时。

[0051] 后处理过程：TLC检测反应。反应结束后，加水洗涤，乙酸乙酯萃取旋干后柱层析纯化(PE:EA＝1:1)后得到白色固体S6，即CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2Cl)CH2CONH2即化合物①，共50mg。

[0052] 如图1所示，为S6，即CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2Cl)CH2CONH2的核磁共振图谱1H‑NMR(400MHz，DMSO‑d6)。

[0053] 实施例2

[0054] 本实施例涉及化合物①抑制人Legumain蛋白的表达与活性证明，具体包括：

[0055] 步骤1)AEP活性检测实验：为了确定抑制剂对AEP酶活性的抑制作用，将重组人 legumain蛋白(rhLegumain，目录#2199‑CY)在含有50mM乙酸钠和100mMNaCl的活化缓冲液中稀释至100μg/mL，pH4.0，持续2h在37℃。30ng/μl活化的rhLegumain在测定缓冲液 (50mMMES、250mMNaCl)中稀释，与30μl不同剂量的抑制剂(0nM、10nM、100nM和 1μM，在测定缓冲液中稀释)结合在pH5.0下，然后添加到黑色孔板中30分钟。之后，加入在测定缓冲液中稀释的40μl200μM底物Z‑AAN‑AMC，包括含有60μl测定缓冲液(50mMMES， 250mMNaCl，pH5.0)和40μl200μM底物的对照。使用酶标仪(Bio‑tek)分别在380和 460nm(顶部读数)测量酶活性，以动力学模式读取5分钟，共13个循环。同时，legumain与 AMC一起孵育以排除该化合物直接淬灭AMC的可能性。

[0056] 如图2所示，图2A‑D分别为抑制剂药物与AEP酶分子对接后的活化能变化、结合位点等。由图可知，AEP酶分子与抑制剂药物对接后活化能上升，难以被激活酶活性。图2E为给予不同浓度抑制剂后AEP酶活性的时间变化规律，由图可知，与对照(0nM)相比，在1 μM(p<0.01)和100nM的抑制剂(p<0.05)浓℃下，AEP酶活性随时间变化得到了显著抑制。

[0057] 为了进一步验证抑制剂是否能有效抑制AEP的内源性酶活性，收集不同剂量抑制剂培养的293L细胞的总细胞裂解物和培养基，分析AEP活性。图2G为给予不同浓度抑制剂后在细胞与上清液中AEP的酶活性，由图可知，抑制剂能够以剂量依赖性方式抑制细胞培养基中 AEP的酶活性。

[0058] 步骤2)AEP表达的免疫印迹实验：分别用100nM、1μM和0nM的抑制剂刺激乳腺癌4T1.2细胞，培养96h后弃培养基，PBS洗涤1次，加入RIPA裂解液(含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。将细胞裂解液离心、定量、煮沸变性，用聚丙烯酰胺凝胶SDS‑PAGE 电泳分离蛋白样品，之后电转至硝酸纤维素膜上，经5％BSA室温封闭1h后，用AEP一抗 4℃孵育过夜，再用相应的二抗室温孵育1h，ECL化学发光液避光孵育2min，最后用化学发光成像系统显影检测蛋白的表达水平。

[0059] 如图2所示，图2G为抑制剂处理4T1.2细胞96h后AEP的表达水平，图2I为抑制剂处理4T1.2细胞与4T1.2 AEP KO细胞96h后AEP的表达水平，结果表明，与对照组相比，1 μM抑制剂培养的细胞中AEP表达降低82.31％(0nM)(p<0.05)。在AEPKO细胞系中，与对照组和加扰组(scramble组)相比，AEP表达下降了90％以上。此结果表明抑制剂能够抑制 AEP蛋白的表达水平。

[0060] 实施例3

[0061] 本实施例涉及抑制剂通过影响Snail、E‑cadherin、MMP‑9等上皮细胞‑间充质转化 (EMT)过程中关键蛋白的表达提高肿瘤细胞转移侵袭能力。

[0062] 所述的EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在肿瘤细胞的EMT过程中，将提高肿瘤细胞的迁移与侵袭、降解细胞外基质的能力，上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。可以通过检测E‑
cadherin、Snail 等关键蛋白检测EMT变化过程，判断肿瘤细胞迁移侵袭能力。

[0063] 本实施例具体为：分别用100nM、1μM和0nM的抑制剂刺激乳腺癌4T1.2细胞，培养96h后弃培养基，PBS洗涤1次，加入RIPA裂解液(含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。将细胞裂解液离心、定量、煮沸变性，用聚丙烯酰胺凝胶SDS‑PAGE电泳分离蛋白样品，之后电转至硝酸纤维素膜上，经5％BSA室温封闭1h后，用AEP一抗4℃孵育过夜，再用相应的二抗室温孵育1h，ECL化学发光液避光孵育2min，最后用化学发光成像系统显影检测蛋白的表达水平。

[0064] 如图3所示，图3A‑F分别为给予抑制剂后E‑cadherin、Snail、MMP‑9蛋白的表达情况。由图可知，在给予抑制剂后E‑cadherin表达上调、Snail、MMP‑9表达下调。此结果可以表明，给予抑制剂后肿瘤细胞的EMT过程被抑制，肿瘤细胞的转移侵袭能力下降。

[0065] 实施例4

[0066] 本实施例涉及抑制剂对细胞无细胞毒作用，不影响细胞增殖，具体步骤包括：

[0067] 收集细胞，加人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231和小鼠高转移性乳腺癌细胞4T1.2悬液 100μl(约5000‑10000个细胞)到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。每板设对照(加100μl 培养基)；置37℃，5％CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。每孔加入10μl不同浓度抑制剂药物溶液，37℃孵育。每孔加入10μlMTS溶液，37℃孵育1‑4小时。测定490nm各孔的吸光值。同时设置空白孔(培养基和MTS溶液，无细胞)，对照孔(不加抑制剂的培养基和MTS溶液，有细胞)，每组设定3‑5复孔。

[0068] 细胞活力计算：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞OD‑空白OD/对照细胞OD‑空白OD)×100

[0069] 如图4A所示，图4A为乳腺癌细胞MDA‑MB‑23与4T1.2细胞在给予抑制剂的情况下细胞活力实验结果。由图可知，在给予抑制剂后，两种细胞的生长繁殖进度与对照组相差很小。此结果表明，该抑制剂对细胞无细胞毒作用，不影响细胞增殖。

[0070] 实施例5

[0071] 本实施例涉及抑制剂抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，具体包括：

[0072] 步骤1)细胞划痕实验：细胞划痕法是检测细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞，设置正常对照组和实验组。实验结束后，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长至中央划痕区，以次判断细胞的生长迁移能力。

[0073] 取对数生长期乳腺癌MDA‑MB‑231细胞和4T1.2细胞，消化后计数，以5*104个/孔的密度接种于培养皿中。细胞融合率达95％时，在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划下的细胞，显微镜下拍照。设置对照组和给药组，对照组加入对应的培养基，给药组加入含不同浓度抑制剂的培养基，每组3个复孔。当对照组周边细胞生长至划痕区域时，弃培养基， PBS洗涤1‑2次去除漂浮的细胞，显微镜下每孔随机选取3个视野拍照。

[0074] 如图4所示，图4B‑E分别为4T1.2细胞与MDA‑MB‑231细胞划痕实验结果，由图可知，AEPKO或抑制剂处理减弱了4T1.2细胞与MDA‑MB‑231细胞的迁移能力，且抑制迁移能力的效果具有浓度依赖性。

[0075] 步骤2)Transwell小室侵袭实验：Transwell侵袭实验，其原理就是Transwell嵌套将培养孔分为上下室，在上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑。在聚碳酸酯膜(多孔膜)上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞若要进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯。计数进入下室的细胞数量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

[0076] 在Transwell上室中铺布Matrigel基质胶，后将对数生长期乳腺癌4T1.2细胞消化4
并计数，用含10％胎牛血清的培养基重悬细胞，以5*10 个/孔(300uL)接种至Transwell小室的上室，下室加入含10％胎牛血清的培养基。细胞贴壁后，弃上下室培养基，PBS洗涤一次，设置对照组和给药组，对照组上室加入等量DMSO，给药组上室加入不同浓度的抑制剂，每组设置3个复孔。上室均用无血清培养基，下室均加入500uL含有20％胎牛血清的培养基，之后置于恒温培养箱中继续培养12h。12h后，取出小室，弃培养基，PBS洗涤一次，用棉签轻轻刮去上室细胞，PBS洗涤3次，去除上室刮下的细胞。之后用4％多聚甲醛固定下室细胞 
15min，PBS洗涤3次，结晶紫染色30min，随后用流水缓慢洗去多余染色液直至背景干净。室温干燥后，显微镜下拍照，计数并统计侵袭细胞的数目。

[0077] 如图4所示，图4F为不同浓度抑制剂与AEP KO刺激后的侵袭细胞，图4G为对应的统计图。由图可知，抑制剂可抑制各细胞降解基质胶侵袭至下室，减少各细胞的侵袭细胞数目，且抑制侵袭的效果具有浓度依赖性。以上结果说明抑制剂可明显抑制乳腺癌细胞的侵袭。

[0078] 实施例6

[0079] 本实施例涉及抑制剂延长乳腺癌小鼠生存期。

[0080] 本实施例具体包括：对40只BALB/C小鼠进行皮下注射5×104个乳腺癌4T1.2细胞，并均分为4组，在注射肿瘤细胞3天后分别腹腔注射给予PBS、0.44mg/ml表柔比星、 0.44mg/ml表柔比星+0.7mg/ml抑制剂、0.44mg/ml表柔比星+10mg/kg抑制剂，剂量为 5ml/kg，给药间隔为3天。记录每组小鼠的死亡时间，统计4组小鼠的生存期数据。

[0081] 所述的表柔比星(Epirubicin)属于抗生素类抗肿瘤药。为阿霉素的同分异构体，是传统肿瘤化疗药物，对多种移植性肿瘤均有效。

[0082] 如图5，图5为4组小鼠的生存曲线。由图可知，给予0.44mg/ml表柔比星 +0.7mg/ml抑制剂与0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml抑制剂的两组小鼠，其生存期与给予 PBS、0.44mg/ml表柔比星的二组小鼠有显著差异(p＜0.01)，而给予不同浓度抑制剂的两组小鼠之间并无明显差异。此结果说明，抑制剂能明显延长肿瘤小鼠的生存期。

[0083] 实施例7

[0084] 本实施例涉及抑制剂抑制小鼠体内乳腺癌4T1.2细胞的远端骨侵蚀和转移。

[0085] 在乳腺癌的发生发展过程中，常伴随骨转移，进而严重影响乳腺癌患者的治疗与预后，并对患者的骨骼造成不可逆损伤，严重影响生活质量。

[0086] 本实施例具体包括：将2*104个乳腺癌4T1.2‑luc细胞注射到共24只小鼠的左心室，从而通过动脉系统直接进入骨骼，制造小鼠乳腺癌骨转移模型。将这些小鼠均分为4组，在注射肿瘤细胞3天后分别腹腔注射给予PBS、0.44mg/ml表柔比星、0.44mg/ml表柔比星 +0.7mg/ml抑制剂、0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml抑制剂，剂量为5ml/kg，给药间隔为3 天。在小鼠骨转移模型中，最常见的转移位置为近端胫骨、股骨和背脊。

[0087] 生物发光成像实验：萤光素酶(英文名称：Luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，可以在特定波长的激发光激发后，释放出特定波长的发射光。借助这一原理，我们可以在肿瘤细胞内转染入荧光素酶基因，使肿瘤细胞表达荧光素酶，给予荧光素钾盐作为荧光素酶的底物后，在生物发光仪器上可以实现肿瘤细胞在活体小鼠体内的追踪及定量检测。

[0088] 如图6，图6A‑D分别为PBS、0.44mg/ml表柔比星、0.44mg/ml表柔比星+0.7mg/ml 抑制剂、0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml抑制剂四组小鼠的生物发光结果。由图可知，对照组和表柔比星单药治疗组中所有小鼠的胫骨近端、股骨或背侧脊柱都有肿瘤生长(图6A、B)，而表柔比星+抑制剂low组中(图6C)，仅一半小鼠在骨骼中有肿瘤块，而表柔比星+抑制剂high 组均无肿瘤转移(图6D)。此结果说明，给予抑制剂后小鼠体内肿瘤细胞骨转移被抑制，且抑制剂的抑制效果具有浓度依赖性。

[0089] X射线CT实验：X射线(X‑ray)，又称为伦琴射线或X光，是一种波长范围在0.01纳米到10纳米之间的一种电磁波。波长极短的特性，使其能够透过材料，但会随材料的密度而衰减，在接收仪器接收后可得到材料组织密度的信息，了解材料内部结构。CT指利用X射线，与灵敏度极高的探测器一同围绕材料进行高速、高精度、高灵敏度的断面扫描，并通过计算机模拟得到材料3D层面上的内部结构情况，在材料学、医学等方面具有重要用途。

[0090] 对4组小鼠因肿瘤自然死亡后，取死亡小鼠后肢骨，分离肌肉。福尔马林中固定3 天，在EDTA脱钙液中脱钙14天。对4组小鼠的后肢骨样本进行X射线CT检测并进行3D重构以探究骨内部肿瘤侵蚀情况。

[0091] 如图7A‑D所示，分别为为PBS、0.44mg/ml表柔比星、0.44mg/ml表柔比星 +0.7mg/ml抑制剂、0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml抑制剂四组小鼠骨样本的X射线CT结果，图7E为4组样本的骨侵蚀体积，图7F为4组样本骨表面积和骨体积的比值，代表骨完整度。由图可知，PBS组与0.44mg/ml表柔比星组的骨样本骨结构不完整，存在骨侵蚀。而给予抑制剂的两组骨结构完整，骨侵蚀程度较轻。且四组骨样本的骨侵蚀体积与骨表面积和骨体积的比值均具有明显趋势(p＜0.05)，且具有浓度依赖性。结果表明，抑制剂能够有效抑制小鼠远端骨转移与骨侵蚀。

[0092] 组织形态学实验：在肿瘤骨转移过程中，骨组织中破骨细胞数量将显著上升，造成骨组织侵蚀，且肿瘤细胞将在骨样本中生长。因此，可以通过针对肿瘤细胞的HE染色与针对破骨细胞的TRAP染色，探究小鼠骨样本中的破骨细胞与肿瘤细胞分布及数量，验证骨侵蚀情况。

[0093] HE染色指苏木素‑伊红染色，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红染液为酸性，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。不同种细胞因细胞性状、细胞质不同，可在HE染色中区分。

[0094] TRAP染色指抗酒石酸酸性磷酸酶染色，是专一检测破骨细胞的染色法，可使破骨细胞呈红色，背景呈绿色或蓝色。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为破骨细胞的标志酶，特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所特有，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。在含酒石酸的酸性条件下，TRAP能将萘酚AS‑BI磷酸盐水解，产生的萘酚AS‑BI立即与苏木素结合，在酶活性部位形成不溶性的红色染料，通过观察红色染料的形成可间接了解酸性磷酸酶的活性，进一步鉴别及分析破骨细胞的状态。

[0095] HE染色:将四组小鼠骨样本石蜡包埋，切成5μm的切片。依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10min‑二甲苯Ⅱ10min‑无水乙醇Ⅰ5min‑无水乙醇Ⅱ5min‑95％酒精5min‑90％酒精5min‑
80％酒精5min‑70％酒精5min‑蒸馏水洗。切片入苏木素染3‑8min，自来水洗，1％的盐酸‑酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1‑3min。将切片依次放入95％酒精I 5min‑95％酒精II 5min‑无水乙醇Ⅰ5min‑无水乙醇Ⅱ5min‑二甲苯Ⅰ
5min‑ 二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。最后显微镜镜检，图像采集分析。

[0096] TRAP染色：石蜡切片脱蜡5～10min，重复一次。无水乙醇5min，90％乙醇和70％乙醇各2min。水洗2min。自然晾干，TRAP固定液4℃固定30s～3min，多数情况下30～60s 即可。水洗，稍微晾干。切片入TRAP孵育液，置于37"C温箱，浸染45～60min，水洗。苏木素染色液染色5～8min或甲基绿染色液染色2～3min。水洗、晾干、镜检。

[0097] 组织形态学检验结果如图7G‑N，其中图7G、H分别为PBS组与0.44mg/ml表柔比星组，可见被染成深蓝色的肿瘤细胞突破了骨组织，呈现侵袭状，而在图7I，0.44mg/ml表柔比星+抑制剂组可见，肿瘤细胞未呈现侵袭骨组织状，骨转移肿瘤界面减少。

[0098] 如图7J‑M所示，为四组小鼠骨切片的TRAP染色结果，图7N为四组切片中的破骨细胞数量，由图可知，相比给予抑制剂治疗的2组，对照组或表柔比星治疗组骨病变中破骨细胞数量更多，对照组或表柔比星治疗组的数量分别增加了4倍和3.6倍(图7N)。

[0099] 与现有技术相比，本发明在对肿瘤细胞无细胞毒性的情况下，能够抑制LGMN的表达与活性，进而抑制肿瘤细胞的转移侵袭。本发明特异性地通过抑制LGMN抑制乳腺癌的骨转移，抑制乳腺癌患者骨转移过程中的骨侵蚀。

[0100] 本发明筛选得到的小分子化合物能通过抑制乳腺癌细胞内Legumain蛋白的结合域，显著抑制Legumain发挥催化作用，并抑制Legumain表达，从而进一步下调下游蛋白AKT、 mTOR的磷酸化，下调肿瘤细胞的上皮‑间质转化(EMT)水平，最终抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭能力。并且本发明筛选得到的小分子化合物还具有特异性好，生物利用度高等特点，其并不直接抑制肿瘤细胞增殖，几乎不存在毒副作用，只抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，与化疗药联用时可抑制乳腺癌肿瘤的生长与转移，大大延长生存期。

[0101] 上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。