水稻剑叶鞘及穗部白化性状基因OsWSSP的克隆及应用

摘要

本申请涉及水稻剑叶鞘及穗部白化性状基因OsWSSP的克隆及应用。本申请首次发现，OsWSSP的启动子发生倒位突变导致该基因编码蛋白的表达量降低，从而引起水稻剑叶鞘及穗部出现白化表型。同时，本申请还开发并验证了与目标基因OsWSSP紧密连锁的分子标记，以用于不同水稻品系及其衍生的杂交种的筛选标记。

权利要求

1.一种OsWSSP基因，其核酸序列如SEQ ID.NO.1所示或SEQ ID.NO.2所示。

2.一种启动子，其核酸序列如SEQ ID.NO.5所示或SEQ ID.NO.6所示。

3.权利要求1所述的基因在调控水稻剑叶鞘和穗部的叶绿体发育和/或叶绿素合成中的应用。

4.一种引物组，其特征在于，所述引物组至少包含如下2个引物对：第1对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.8所示；

第2对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.10所示。

5.一种引物组，其特征在于，所述引物组至少含有如下4个引物对：第1对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.12所示；

第2对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.14所示；

第3对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.16所示；

第4对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.18所示。

6.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的基因，和/或权利要求2所述的启动子，和/或权利要求4或5所述的引物组。

7.一种水稻品种的鉴定方法，包括鉴定水稻基因组中的如权利要求1所述的基因，和/或权利要求2所述的启动子，包括以下步骤：（1）提取水稻样品基因组DNA；（2）利用权利要求

4或5所述的引物组对所述基因组DNA进行PCR扩增；（3）分析所述扩增后的产物大小。

8.权利要求1所述的基因、或权利要求2所述的启动子、或权利要求4或5所述的引物组、或权利要求6所述的试剂盒、或权利要求7所述的方法在鉴定水稻品种或在水稻育种中的用途。

9.如权利要求3所述的应用，或如权利要求7所述的方法，或如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述水稻包括黄华占、日本晴、光敏或温敏不育系。

10.如权利要求9所述的应用、方法或用途，其特征在于，所述水稻具有剑叶鞘及穗部白化表型。

说明书

水稻剑叶鞘及穗部白化性状基因OsWSSP的克隆及应用

技术领域

[0001] 本申请涉及水稻剑叶鞘及穗部白化性状基因OsWSSP的克隆及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

[0002] 水稻是我国重要的粮食作物之一。水稻光合效率关乎稻谷产量，而光合效率与叶绿体的发育及光合色素的含量密切相关。因此，深入解析水稻绿色组织中叶绿体发育的分子机制，对水稻光合效率的提升具有重要意义。水稻中相关研究主要集中在叶片的叶绿体发育调控方面，而其穗部及剑叶鞘叶绿体发育及其光合效率，对稻谷产量的影响研究较为匮乏。

[0003] 目前，水稻中相关研究主要集中在叶片的叶绿体发育调控方面，人们已利用叶色突变作为两系杂交水稻不育系和杂交种纯种筛选标记，但淡绿色和浅黄色的叶子很难区分，这使得叶色突变作为筛选工具的效率很低。因此，如果能够找到影响水稻穗及剑叶鞘白化的相关基因，将不仅利于深化水稻叶绿体发育的分子机制研究，同时有助于拓展穗轴及叶鞘白化调控基因在水稻杂交育种中的应用研究。

[0004] 另外，在品种鉴定中，田间种植鉴定虽具有适用范围广泛、鉴定结果可靠等优点，但该方法时间长、效率低、工作量大、结果滞后。一般而言，所需鉴定目标性状大多为数量性状，受环境影响较大，需要具有一定田间检验经验的人员才能保证检测准确性，而DNA指纹图谱技术则具有高效、准确、实验操作简单、不受环境影响等优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。

[0005] 已知比较成熟、应用比较广泛的DNA指纹图谱技术包括RAPD、ISSR、InDel等，这些技术各有优势。InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion‑deletion)，是同源序列比对产生空位(gap)的现象。由于InDel分子标记具有数量丰富、多态性高、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，在植物品种鉴定及纯度检测的方面具有广阔的应用前景。然而，InDel产生主要与基因组的特征和DNA复制错误有关，大部分插入/缺失突变的产生机制现在仍旧未知。由于插入和删除的比例会因为测序错误而增加，并且在这些测序错误区域，真实InDel多态性率也增加，因此，对于在庞大的基因组测序数据中那些数以万计的插入和缺失之处，哪些位置是操作问题、哪些位置是测序错误、哪些位置是真正的InDel变异等问题为获得有效的分子标记引物带来了挑战。

发明内容

[0006] 本申请首次发现了一种控制水稻孕穗期剑叶鞘以及开花期以及种子灌浆期穗部表现出明显白化表型的基因OsWSSP，以及该基因的CDS编码的蛋白，并进一步确定了该基因或蛋白调控该表型的分子机理。

[0007] 其中，发明人发现该基因的启动子出现倒位突变，该突变导致目标蛋白表达量降低，从而导致水稻孕穗期剑叶鞘以及开花期以及种子灌浆期穗部表现出白化的表型。

[0008] 同时，本申请还筛选出了最优的鉴别引物来提高分子辅助育种的效率。具体而言：

[0009] 本申请提供一种OsWSSP基因，其核酸序列如SEQ ID.NO.1所示或SEQ ID.NO.2所示。

[0010] 其中，SEQ ID.NO.1为OsWSSP基因的基因组DNA全序列；SEQ ID.NO.2为突变的OsWSSP基因的基因组DNA全序列。

[0011] 本申请还提供一种启动子，其核酸序列如SEQ ID.NO.5所示或SEQ ID.NO.6所示。

[0012] 其中，SEQ ID.NO.5为OsWSSP基因的基因组DNA中的启动子序列；SEQ ID.NO.6为突变的OsWSSP基因的基因组DNA中的启动子序列。

[0013] 上述启动子的差别导致OsWSSP基因对应的蛋白表达量不同。

[0014] 本申请还提供上述的基因、或序列如SEQ ID.NO.4所示的蛋白或其编码核酸、或上述的启动子在鉴定水稻品种或水稻育种中的应用。

[0015] 本申请还提供上述的基因、或序列如SEQ ID.NO.4所示的蛋白或其编码核酸、或上述的启动子在调控水稻剑叶鞘和穗部的叶绿体发育和/或叶绿素合成中的应用。

[0016] 在一种实施方式中，上述蛋白的编码核酸的序列如SEQ ID.NO.3所示。

[0017] 其中，SEQ ID.NO.3为OsWSSP基因的基因组DNA中的CDS序列，其编码的蛋白序列如SEQ ID.NO.4所示。

[0018] 在一些实施方式中，上述蛋白在剑叶鞘及穗部出现白化的水稻中的表达量低于正常水稻中的表达量。

[0019] 本申请进一步提供一种引物组，所述引物组至少包含如下2个引物对：

[0020] 第1对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.8所示；

[0021] 第2对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.10所示。

[0022] 本申请还提供一种引物组，所述引物组至少含有如下4个引物对：

[0023] 第1对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.12所示；

[0024] 第2对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.14所示；

[0025] 第3对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.16所示；

[0026] 第4对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.18所示。

[0027] 本申请提供一种试剂盒，其包含上述的基因，和/或上述的启动子，和/或上述的引物组。

[0028] 本申请提供一种水稻品种的鉴定方法，包括鉴定水稻基因组中的上述的基因，和/或上述的启动子，和/或序列如SEQ ID.NO.4所示的蛋白或其编码核酸的步骤。

[0029] 本申请提供一种水稻品种的鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取水稻样品基因组DNA；(2)利用上述的引物组对所述基因组DNA进行PCR扩增；(3)分析所述扩增后的产物大小。

[0030] 本申请还提供上述的基因、或上述的蛋白或其编码核酸、或上述的启动子、或上述的引物组、或上述的试剂盒、或上述的方法在鉴定水稻品种或水稻育种中的用途。

[0031] 在一些实施方式中，水稻包括黄华占、日本晴、光敏或温敏不育系、和/或它们衍生的杂交种。

[0032] 在一些实施方式中，水稻的剑叶鞘和穗部是正常非白化的、或具有白化表型。

[0033] 本申请中，引物、引物组或引物对可以指同一概念。

附图说明

[0034] 图1常规栽培稻HHZ(野生型)与近等基因系NIL(突变型)表型比较。

[0035] 图2目标基因OsWSSP的精细定位。

[0036] 图3OsWSSP倒位变异断点PCR验证。

[0037] 图4超表达WSSP基因能够恢复突变体oswssp的穗轴白化表型。

[0038] 图5目标区间紧密连锁标记的多态性检测。

[0039] 图6目标基因OsWSSP侧翼标记辅助鉴定BC3F1的杂合单株。

具体实施方式

[0040] 本申请通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或者实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0041] 实施例1水稻穗轴及剑叶鞘白化表型的鉴定

[0042] 从水稻自然群体材料中筛选到一份孕穗期剑叶鞘以及开花期以及种子灌浆期穗部表现出明显白化表型的突变体，命名为oswssp(White Sword leaf Sheath and Panicle)。为了确定该性状的遗传基础，我们通过将oswssp与穗部白化正常的品种黄华占(HHZ)杂交构建F2分离群体。

[0043] 进一步通过BSA‑seq分析，初步将目标基因OsWSSP定位于第2染色体短臂约1.61Mb的物理区间内。利用双亲深度重测序(>30X)，在此区间内开发并利用InDels标记，辅助回交5代，选择构建了HHZ背景的近等基因系(NILs)。

[0044] 与常规栽培种黄华占(HHZ)比较，近等基因系NIL的主要特征为：孕穗期剑叶鞘以及开花期与种子灌浆期穗部表现出明显白化表型(图1)，同时这两个部位的叶绿素含量下降(图1)。

[0045] 实施例2穗轴及剑叶鞘白化基因OsWSSP的定位与白化机制

[0046] 利用BSA‑seq将目标基因定位在1.61Mb的物理区间后，进一步在该区间加密分子标记，利用F2对目标基因OsWSSP进行精细定位，最终将目标基因确定在146kb的物理区间(图2)。

[0047] 使用IGV(Integrative Genomics Viewer)软件，可视化比较双亲覆盖该区间候选基因的Paired‑end reads序列，查找候选基因中潜在的有义突变位点，从而寻找潜在的候选基因。结果发现：其中一个候选基因启动子区域存在倒位变异。

[0048] 为了证实这一结论，发明人针对该倒位位点设计2对鉴定引物(表1)：

[0049] 第1对引物(鉴定1)，上游引物序列如SEQ ID.NO.7所示(UP_F)，下游引物序列如SEQ ID.NO.8所示(UP_R)；

[0050] 第2对引物(鉴定2)，上游引物序列如SEQ ID.NO.9所示(Down_F)，下游引物序列如SEQ ID.NO.10所示(Down_R)。

[0051] 通过PCR扩增最终证实了倒位的真实性(图3)。

[0052] 进一步的，构建玉米Ubiquitin启动子驱动野生型日本晴WSSP基因CDS序列的双元超表达载体proUBI::WSSP，以穗轴白化的突变体oswssp为受体进行遗传转化，阳性转基因材料(com_#1、com_#2、com_#3)的穗轴白化表型被恢复为野生型表型(如图4)。可见，这些结果都佐证了目标候选基因启动子的变异是导致了oswssp剑叶鞘和穗部白化表型的直接原因。

[0053] 表1 引物序列

[0054]

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[0057]

[0058]

[0059] 实施例3与目标基因OsWSSP紧密连锁标记的开发与应用

[0060] 利用双亲重测序的数据，在目标区间均有的区域设计与目标基因连锁的InDel分子标记引物，经过大量的前期筛选后，筛选出19对引物组，采用这些引物，通过2.5％的琼脂糖水平凝胶即可分辨出野生型HHZ和突变体oswssp之间的多态性(图5)。可以看出，本申请的19对引物对中(表1)，仍然有一些引物扩增出的条带有缺失、不清晰或区分不明显等不足(如930269、938043、941198等)，因此，发明人进一步筛选并通过实验最终证实了4对特异性最好、稳定性最强的InDel标记引物(图6，表1)：

[0061] 第1对引物(筛选4)，上游引物序列如SEQ ID.NO.11所示(827382_F)，下游引物序列如SEQ ID.NO.12所示(827382_R)；

[0062] 第2对引物(筛选6)，上游引物序列如SEQ ID.NO.13所示(894514_F)，下游引物序列如SEQ ID.NO.14所示(894514_R)；

[0063] 第3对引物(筛选12)，上游引物序列如SEQ ID.NO.15所示(973145_F)，下游引物序列如SEQ ID.NO.16所示(973145_R)；

[0064] 第4对引物(筛选13)，上游引物序列如SEQ ID.NO.17所示(998331_F)，下游引物序列如SEQ ID.NO.18所示(998331_R)。

[0065] 这些标记引物能辅助选择BC3F1的杂合基因型(例如图6中第4，6，8，17，19，21)，并用于水稻近等基因系的创制。

[0066] 综上，本申请已尽力描述了发明的思路和实施效果证据。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚的明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或者改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。