TMC5在乳腺癌特异性骨转移中的诊断、治疗的应用

摘要

本发明公开了与乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移相关的分子标记物、抑制剂、试剂盒和药剂，属于生物医药领域。所述的分子标记物是TMC5基因或其表达的蛋白，所述TMC5基因在乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移中表达上调。所述抑制剂选自TMC5基因的反义链中的siRNA和shRNA，可以用在制备抑制乳腺癌和乳腺癌骨转移发生和/或发展的药物中。所述试剂盒包括能够定量检测TMC5基因的表达量的试剂。所述药剂中含有抑制TMC基因表达的试剂。本发明为乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移的诊断和治疗提供了新的靶点，具有重大的临床意义。

权利要求

1.一种TMC5基因或其编码蛋白的表达水平的检测试剂在制备用于辅助诊断乳腺肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述乳腺肿瘤包括乳腺癌或乳腺癌特异性骨转移。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过逆转录PCR、实时定量PCR、芯片、高通量测序平台检测样本中TMC5基因的表达水平；所述产品通过western blot、免疫组织化学染色或酶联免疫吸附检测样本中TMC5基因编码的蛋白的表达水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品中含有扩增TMC5基因的特异性引物如SEQ ID NO  .1和SEQ ID NO  .2所示；与TMC5基因核苷酸序列杂交的探针或与TMC5蛋白特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒；所述样本为组织、血清或细胞。

5.一种TMC5基因表达水平的抑制剂在制备治疗乳腺肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述乳腺肿瘤包括乳腺癌或乳腺癌特异性骨转移。

6.一种TMC5基因表达水平的抑制剂在制备抑制乳腺癌细胞迁移、增殖、骨微环境定植或破骨细胞形成的药物中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述TMC5基因表达水平的抑制剂包括特异靶向TMC5基因的siRNA、shRNA、表达siRNA的载体或表达shRNA的载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述shRNA或siRNA靶序列如SEQ ID NO：5所示。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO  .3～SEQ ID NO .4所示。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述表达siRNA的载体或表达shRNA的载体包括真核细胞表达载体。

说明书

TMC5在乳腺癌特异性骨转移中的诊断、治疗的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种潜在的乳腺癌特异性骨转移标记物TMC5用于制备检测试剂盒中的应用，TMC5基因在导致乳腺癌特异性骨转移的过程中发挥作用，并且涉及TMC5在乳腺癌特异性骨转移诊断、治疗以及预后中的应用。

背景技术

[0002] 乳腺癌是女性常见的一种恶性肿瘤，乳腺癌在欧美发达国家以及中国上海等大城市的发病率已经成为女性恶性肿瘤的首位。约80%的晚期乳腺癌伴随骨转移，进而发生高钙血症、骨质疏松和骨折，严重影响患者的生活质量和生存。

[0003] 由于乳腺癌具有惊人地增长速度和致死率，使得早期诊断和预后判断对于提高乳腺癌特异性骨转移患者的生存率具有十分重要的意义。目前的乳腺癌特异性骨转移诊断手段包括ECT、pet‑CT、穿刺活检等，但是这些检测手段存在灵敏度和特异性有限、有创性检查等缺点。因此，发现新的高效的乳腺癌特异性骨转移特异表达靶标对于乳腺癌特异性骨转移的早期诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

[0004] 针对上述问题，本发明主要提供了一种TMC5基因或其编码蛋白的表达水平的检测试剂在制备用于乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移的辅助诊断产品中的应用，发现TMC5基因在乳腺癌特异性骨转移呈现高表达。同时，提供了一种TMC5基因表达水平的抑制剂在制备治疗乳腺癌特异性骨转移的药物中的应用以及TMC5基因表达水平的抑制剂在制备抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭、钙离子趋化性、骨微环境定植和破骨细胞形成的药物中的应用。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

[0006] 本发明提供了一种TMC5基因或其编码蛋白的表达水平的检测试剂在制备用于辅助诊断乳腺肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括癌乳腺癌或乳腺癌特异性骨转移。

[0007] 进一步地，所述产品通过逆转录PCR、实时定量PCR、芯片、高通量测序平台检测样本中TMC5基因的表达水平；所述产品通过western blot、免疫组织化学染色或酶联免疫吸附检测样本中TMC5基因编码的蛋白的表达水平。

[0008] 更进一步地，所述产品中含有扩增TMC5基因的特异性引物如SEQ ID NO  .1和SEQ ID NO  .2所示、与TMC5基因核苷酸序列杂交的探针或与TMC5蛋白特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。

[0009] 更进一步地，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒；所述样本为组织、血清或细胞。

[0010] 本发明还提供一种TMC5基因表达水平的抑制剂在制备治疗乳腺肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌或乳腺癌特异性骨转移。

[0011] 本发明还提供一种TMC5基因表达水平的抑制剂在制备抑制乳腺癌细胞迁移、增殖、钙离子趋化性、骨微环境定植或破骨细胞形成的药物中的应用。

[0012] 进一步地，如上所述TMC5基因的表达抑制剂包括特异靶向TMC5基因的siRNA、shRNA、表达siRNA的载体或表达shRNA的载体。

[0013] 更进一步地，所述shRNA或siRNA靶序列如SEQ ID NO：5所示。

[0014] 更进一步地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO .3～SEQ ID NO .4所示。

[0015] 更进一步地，所述表达载体包括真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体包括质粒表达载体或病毒表达载体。

[0016] 与现有技术相比本发明的有益效果。

[0017] （1）本发明首次公开了TMC5基因及其编码的蛋白与乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移诊断和治疗相关的特异性标志物，TMC5基因有望成为诊断乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移的分子标志物，并为研究乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移的分子机理提供新的思路。

[0018] （2）TMC5在癌组织中RNA和蛋白水平显著上调。通过分析患者的临床病例资料，发现TMC5在乳腺癌特异性骨转移患者中显著高表达，且为特异性高表达，在肝肺转移中未发现其高表达这一现象。通过检测TMC5基因及其编码蛋白的表达水平，可以诊断乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移，从而可以制备含有TMC5基因或含有TMC5编码的蛋白的乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移辅助诊断试剂盒，利用检测基因表达水平的方式诊断乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移的方法更加灵敏更加特异，有利于疾病早期的诊断。

[0019] （3）本发明还提示可以通过干预TMC5基因的表达，可以显著抑制乳腺癌细胞的迁移、增殖、钙离子趋化性、骨微环境定植和破骨细胞形成，达到抑制乳腺癌骨转移的发生，其有可能作为乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移未来靶向治疗的特定靶点，为乳腺癌和乳腺癌特异性骨转移的治疗提供新思路。

附图说明

[0020] 图1. TMC5在159对乳腺癌组织中的表达水平。结果采用2‑ΔΔct值（－ΔΔCT＝ΔCT癌旁－ΔCT癌）进行分析，值越大，表示表达水平越高。

[0021] 图2. TMC5在正常乳腺上皮细胞和4种乳腺癌细胞系中的相对表达水平。“*”代表 p 值小于0.05。

[0022] 图3. Transwell实验证实TMC5对乳腺癌细胞的迁移能力的影响。A.过表达TMC5可以显著促进T47D细胞迁移；B.敲减TMC5后可以显著抑制MDA‑MB‑231细胞迁移；C.Transwell迁移细胞数统计图；“*”代表p值小于0.05。

[0023] 图4. Transwell实验证实TMC5对乳腺癌细胞的侵袭能力的影响。A.过表达TMC5可以显著促进T47D细胞侵袭；B.敲减TMC5后可以显著抑制MDA‑MB‑231细胞侵袭；C.Transwell侵袭细胞数统计图；“*”代表p值小于0.05。

[0024] 图5. TMC5过表达引起EMT相关指标表达发生变化。在MDA‑MB‑231和T47D细胞系中，过表达TMC5显著提高了Snail和Vimentin的表达，而显著抑制了E‑cadherin的表达。

[0025] 图6. 在MC3T3E1模拟的骨微环境下，TMC5表达对乳腺癌细胞趋化作用的影响。A.过表达TMC5显著促进T47D细胞的骨微环境趋化作用；B.敲减TMC5显著抑制MDA‑MB‑231细胞的骨微环境趋化作用；C.骨微环境趋化细胞数统计图；“*”代表p值小于0.05。

[0026] 图7. TMC5对破骨细胞形成的影响。A.过表达TMC5显著促进破骨细胞形成；B.敲减TMC5显著抑制破骨细胞形成；C.相对TRAP+（即破骨细胞）细胞数统计图；“*”代表 p值小于0.05。

[0027] 图8. 小鼠下肢骨组织HE染色。A.过表达TMC5提高乳腺癌骨转移灶面积；B.敲减TMC5降低乳腺癌骨转移灶面积。

[0028] 图9. 小鼠下肢骨X光显像结果。箭头指向溶骨性破损区域。A.过表达TMC5显著提高下肢骨骨破损数；B.敲减TMC5显著减少下肢骨骨破损；C.下肢骨骨破损数统计图；“*”代表p值小于0.05。

[0029] 图10. 破骨细胞抗酒石酸磷酸酶染色。A.过表达TMC5组小鼠破骨细胞溶骨区域面积明显高于对照组；B.敲减TMC5组小鼠破骨细胞溶骨区域面积显著降低；C.下肢骨溶骨区域面积统计图；“*”代表p值小于0.05。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

[0031] 实施例1 TMC5在乳腺癌组织中表达情况的研究。

[0032] 1.实验材料：乳腺癌组织样本，乳腺癌旁组织样本，TRIzol，dd水，异丙醇，氯仿等，详细试剂列于具体实验方法中。

[0033] 2.实验方法。

[0034] 2.1组织：用酒精擦拭眼科剪及镊子，将装有组织的冻存管提前解冻，待冰块消失后，用眼科剪剪下50‑100mg的组织样本，dd水涮洗后，用去酶水浸泡过的滤纸挤出组织样本里的油脂或血液成分，再将样本浸入含TRIzol的1.5mL EP管中，眼科剪剪碎，使TRIzol与组织样本充分接触，以利于RNA提取。

[0035] 2.2提取总RNA，具体步骤如下：

[0036] （1）将组织碎块与TRIzol的混合液室温静置10分钟；

[0037] （2）向EP管中加入200μL氯仿；

[0038] （3）剧烈震荡15秒，随后室温静置15分钟；

[0039] （4）将EP管放入离心机，4℃，12000rpm离心15分钟；

[0040] （5）轻柔的拿出离心机里的EP管，选用100μL或300μL的移液器将上清吸出，置入新的EP管中，吸上清时务必确保未扰动固体层；

[0041] （6）向EP管中加入与上清液等体积的异丙醇，振荡混匀，室温静置15分钟；

[0042] （7）于低温离心机中离心，4℃，12000rpm，10分钟；

[0043] （8）吸弃上清，仅保留沉淀。用去RNA酶水配置的75%乙醇将沉淀吹起，使其悬浮；

[0044] （9）离心，4℃，7500rpm离心5分钟；

[0045] （10）重复步骤（8）‑（10）；

[0046] （11）吸弃上清，仅保留沉淀，将EP管倒置，待白色的沉淀转为半透明时，添加20μL去RNA酶水；

[0047] （12）将EP管放在‑80℃深低温冰箱过夜，第二天分光光度计测量RNA浓度。

[0048] 2.3 real‑PCR实验：

[0049] 将上述RNA按照PrimeScript™ RT reagent Kit反转录试剂盒操作，逆转录为cDNA。根据SYBR® Premix Ex Taq II说明书，将cDNA和引物添加到20μL系统中，并采用说明书中的反应条件，进行实时定量PCR。

[0050] 所采用的引物序列：

[0051] Forward Primer 5 ’‑CATCTACCGGCTCCTTCTG‑3’ SEQ ID NO.1；

[0052] Reverse Primer 5 ’‑CCAATGATTCTCCTCAGAAACTC‑3’ SEQ ID NO.2。

[0053] 2.4 乳腺癌组织全蛋白提取：

[0054] （1）将2.5μL PMSF、5μL磷酸酶抑制剂和0.5μL蛋白酶抑制剂加入到500μL Lysis Buffer中，混匀，置于冰上；

[0055] （2）擦净眼科剪，取解冻后的组织样本，滤纸挤干脂肪组织后称量100mg，剪碎后加入500μL裂解液，低温匀浆；

[0056] （3）将EP管置于低温离心机中，4℃，12000rpm，离心五分钟；

[0057] （4）吸取上清，置于新的EP管中。

[0058] 2.5 蛋白定量：

[0059] （1）在96孔板中加入标准蛋白液，绘制标准曲线；

[0060] （2）在样品孔中每孔加入dd水16μL以及4μL蛋白液；

[0061] （3）通过使用BCA蛋白定量试剂盒，按照A液：B液=50：1配制，每孔加入200μL；

[0062] （4）将96孔板置于孵箱孵育30分钟；

[0063] （5）562nm波长下通过酶标仪测定各孔吸光度。

[0064] 2.6 Western blotting。

[0065] （1）电泳：

[0066] ①从‑80℃取出蛋白样本，在金属浴中100℃煮5分钟，涡旋，离心；

[0067] ②将预制胶底端保鲜膜撕掉，安装电泳装置，倒入电泳液；

[0068] ③每个泳道上蛋白样10μL，20微克，marker上样6μL，恒压100V电泳；

[0069] ④当指示剂到达预制胶底端，则关闭电源。

[0070] （2）电转移：

[0071] ①根据目的蛋白分子量选择不同孔径的PVDF膜，以6cm*6cm裁膜后用甲醇激活30秒，随后放入转移液中5分钟；

[0072] ②将海绵、滤纸、预制胶和PVDF膜制作成转移小体，安装电转移装置，电压100V，湿转1小时，4℃下进行蛋白的电转移；

[0073] ③结束后观察marker是否全部转移到膜上。

[0074] （3）封闭、一抗孵育、二抗孵育

[0075] ①配制封闭液，将膜置于封闭液中封闭2.5小时；

[0076] ②根据目的蛋白分子量大小裁膜；

[0077] ③将膜置于一抗中，孵育过夜；

[0078] ④TBST洗膜4次，每次15分钟；

[0079] ⑤将膜置于二抗中，避光孵育2小时。随后TBST洗膜4次，每次15分钟；

[0080] ⑥配制发光液，将A液与B液1:1混合；

[0081] ⑦发光仪发光，检测目的蛋白表达量。

[0082] 3.实验结果：通过real‑PCR和western blot证明了与乳腺癌旁组织相比， TMC5的‑ΔΔctRNA和蛋白的表达水平在乳腺癌组织中显著高表达（如图1）。注：结果采用2 值（－ΔΔCT＝ΔCT癌旁－ΔCT癌）进行分析，值越大，表示表达水平越高。

[0083] 实施例2 TMC5在乳腺癌细胞系中表达情况的研究。

[0084] 1.实验材料：乳腺癌细胞系（如图2所注），人正常乳腺细胞，TRIzol，dd水，异丙醇，氯仿等。

[0085] 2.实验方法。

[0086] 2.1细胞：当细胞长至90%密度时，吸弃培养基，洗2遍，根据不同细胞系胰酶消化不同时间，吸弃胰酶，完全培养基吹打细胞，在1.5mL EP管中离心，弃上清，加入1mL TRIzol，吹匀，使TRIzol与细胞充分接触。

[0087] 2.2乳腺癌组织全蛋白提取：

[0088] （1）将0.4μL磷酸酶抑制剂、0.2μLPMSF和0.04μL蛋白酶抑制剂加入到40μL Lysis Buffer中，配置成蛋白裂解液；

[0089] （2）吸弃细胞培养液，PBS清洗两遍；

[0090] （3）在每孔细胞中加入40μL裂解液，置于冰上，摇床20分钟；

[0091] （4）将裂解液和细胞一并吸出置于EP管中，低温离心机离心，4℃，12000rpm，20分钟；

[0092] （5）吸取上清液移至新的EP管中备用。

[0093] 2.3 分别按照实施例1中的2.2提取总RNA、2.3 real‑PCR实验条件、2.5 蛋白定量和2.6 Western blotting所述的试验条件进行相应的实验。

[0094] 3.实验结果：通过real‑pCR和western blot证明了与人正常乳腺细胞相比，，TMC5的RNA和蛋白水平在乳腺癌细胞系中成显著的高表达。

[0095] 实施例3 临床病例资料分析TMC5与乳腺癌特异性骨转移相关性。

[0096] 1.实验材料：收集患者资料并随访。

[0097] 2.实验方法：该部分所使用的卡方检验、Wilcoxon秩和检验、t检验、Kaplan‑Meier 生存曲线等基于SPSS统计软件（version 19.0, IBM, Chicago, IL, USA）。对于所有的检验结果，p＜0.05被认为具有显著统计学差异。

[0098] 3.实验结果：通过对患者的临床病例资料分析，发现TMC5与乳腺癌特异性骨转移有显著相关性（如表1）。TMC5在乳腺癌骨转移患者中显著高表达，且为特异性高表达，在肝肺转移中未发现其高表达这一现象。

[0099] 表1：纳入研究的159名乳腺癌患者临床病理学资料

[0100] 。

[0101] 表中*表示：p<0.05。a: Fisher精确概率法。

[0102] 实施例4 体外实验。

[0103] 1.实验材料：乳腺癌细胞系，培养基，胰酶，血清，PBS，转染试剂，基质胶，RANKL细胞因子，M‑CSF细胞因子，孔板等。

[0104] 2.实验方法。

[0105] 2.1 细胞转染：

[0106] （1）胰酶消化细胞，吹打均匀后计数，重新接种细胞，接种的细胞量视转染时间决定；

[0107] （2）当细胞长至50%密度时可以转染，更换培养基，同时加入慢病毒转染试剂polybrene 5μL（5μg/mL），此外，不同慢病毒载体的MOI分别加入对应的病毒悬液2μL，放回孵箱，恒温恒湿孵育；

[0108] （3）孵育一天后，观察细胞是否贴壁，吸弃培养基，PBS洗2遍，添加完全培养基后加入嘌呤霉素，对细胞进行筛选，以获得稳定表达目的基因的稳转细胞系；

[0109] （4）两天更换一次培养基，同时加入新的嘌呤霉素；

[0110] （5）在荧光显微镜下观察稳转细胞系的荧光情况，当表达荧光的细胞占总细胞数的85%以上时，使用PCR检测转染效率，经过反复传代筛选，当转染效率稳定时，表明稳转细胞系构建成功。

[0111] 2.2 Transwell迁移实验：

[0112] （1）将稳定转染的细胞消化，用双无培养基吹打均匀，重悬细胞并计数；

[0113] （2）在24孔板下室添加600μL完全培养基，放置小室，在小室上室加入2.3×105个细胞，总体积200μL。放回孵箱，孵育时间视细胞系的情况而定；

[0114] （3）达到预实验确定的孵育时间后，取出小室，准备甲醇，苏木素和伊红。甲醇固定1分钟，dd水涮洗；苏木素染色3分钟，涮洗；伊红染色30秒，dd水涮洗；

[0115] （4）使用干净棉签擦拭小室上室底层膜，确保不损伤膜的平整度，晾干后切膜，使用树脂将其固定在载玻片上，固定的过程中务必保证排净气泡；

[0116] （5）高倍显微镜下随机选取多个视野，并使用image J对细胞进行计数。

[0117] 2.3 Transwell侵袭实验：

[0118] （1）将Matrigel基质胶从‑20℃提前拿出，于4℃解冻；

[0119] （2）用完全培养基稀释Matrigel基质胶，添加比例为4：1。吸取50μL混合液置于小室上层，用细针戳破气泡；

[0120] （3）孵箱孵育4小时备用；

[0121] （4）余步骤同迁移实验。

[0122] 2.4 乳腺癌细胞向模拟骨转移微环境的体外细胞趋化实验：

[0123] （1）将transwell小室(孔径为8 μm)置入24孔板中；

[0124] （2）将MC3T3E1细胞以70‑80%的融合度预先铺于下室，用含10%胎牛血清的培养基培养；

[0125] （3）将MDA‑MB‑231或T47D乳腺癌细胞接种于上室，放入培养箱培养24小时（MDA‑MB‑231）或36小时（T47D）；

[0126] （4）将上室一侧膜表面的非迁移细胞轻轻擦除，将下室一侧膜表面的迁移细胞用4%多聚甲醛固定，随后对其进行染色和计数 。

[0127] 2.5 转移癌细胞原代培养集落形成实验：

[0128] （1）将小鼠浸泡于75%酒精中15分钟；

[0129] （2）用眼科剪剔除小鼠下肢骨附着的肌肉脂肪组织，尽可能保证骨骼无附着物；

[0130] （3）PBS清洗骨骼2遍；

[0131] （4）在超净台中，无菌眼科剪剪断骨骼两端，用1ml注射器抽取完全培养基，反复冲洗骨髓腔；

[0132] （5）收集冲洗液，细胞计数仪计数；

[0133] （6）6孔板中每孔接种2000个细胞，隔天换液，培养1周后，荧光显微镜下观察，记录集落数。

[0134] 2.6 软琼脂集落形成实验。

[0135] （1）制备3%的2‑羟乙基琼脂糖：

[0136] ①在干净干燥的100mL玻璃瓶中加入0.9g 2‑羟乙基琼脂糖，然后加入30mL蒸馏水；

[0137] ②用微波炉加热混合物15秒，然后轻轻旋转，重复此步骤3次，直到琼脂糖粉末完全溶解；

[0138] ③将装有溶液的瓶子高压灭菌15分钟；

[0139] ④琼脂糖溶液冷却至室温，室温下储存溶液。

[0140] （2）底层的制备：

[0141] ①在37℃的培养箱中预热5mL和10mL的移液管，以防止操作时琼脂糖在移液管中固化；

[0142] ②部分松开瓶盖，用微波炉加热预制的3% 2‑羟乙基琼脂糖溶液15秒。然后，轻轻旋转溶液，用微波炉再加热15秒；

[0143] ③如果瓶子里有残留的固体凝胶，再用微波炉加热几秒钟；

[0144] ④在接下来的步骤中，将装有琼脂糖溶液的瓶子放在45℃水浴中，以防止琼脂糖溶液过早固化；

[0145] ⑤在37℃水浴中加热细胞培养基；

[0146] ⑥用预热的移液管将3mL 3%琼脂糖溶液转移到50mL无菌锥形瓶中；

[0147] ⑦立即加入12mL温热的细胞培养基，轻轻倒置锥形瓶，使琼脂糖溶液与培养基混合。尽量不要形成任何气泡，因为这会干扰以后的细胞集落数计数；

[0148] ⑧向6孔板的每个孔中轻轻加入2mL该混合物，不形成任何气泡；

[0149] ⑨将6孔板在4℃平面上水平培养1小时，使混合物固化；

[0150] ⑩混合物凝固后，将板放入37℃培养箱中30分钟，底层即可使用。

[0151] （3）含细胞层的制备：

[0152] ①胰蛋白酶消化细胞并稀释至细胞浓度为4×104/mL；

[0153] ②用预热的移液管吸取2mL 3%琼脂糖，并转移至无菌的50mL锥形瓶中；

[0154] ③立即向锥形瓶中加入8mL细胞培养基，轻轻倒置，使琼脂糖与培养基混合；

[0155] ④取2mL细胞；

[0156] ⑤在1：1稀释中，将细胞与0.6%琼脂糖混合；

[0157] ⑥取1mL细胞‑琼脂糖混合物，轻轻加入到六孔板的底层（2×104cell/mL）；

[0158] ⑦将六孔板水平放置在4℃平面上至少15分钟，使顶层固化；

[0159] ⑧混合物凝固后，将平板放入37℃培养箱中一周，然后添加饲养层。

[0160] （4）饲养层的制备：

[0161] ①将预先制备的3% 2‑羟乙基琼脂糖溶液微波处理15秒，轻轻旋转溶液并用微波炉加热15秒；

[0162] ②在45℃水浴锅中平衡琼脂糖溶液瓶；

[0163] ③在37℃水浴中加热细胞培养基；

[0164] ④将1mL 3%琼脂糖溶液与9ml温热的细胞培养基混合到50mL锥形瓶中；

[0165] ⑤轻轻倒置锥形瓶，使琼脂糖与培养基混合；

[0166] ⑥在包含底层和软层的六孔板的每个孔中轻轻加入1mL上述混合物；

[0167] ⑦将六孔板水平放置在4℃平面上至少15分钟，使混合物固化；

[0168] ⑧饲养层凝固后，将平板放入37℃培养箱中；

[0169] ⑨每周重复此饲养程序，将1mL 0.3%琼脂糖/培养基处理溶液覆盖在现有饲养层中，用新培养基补充细胞，直到观察到集落形成。

[0170] （5）数据收集

[0171] ①细胞在软琼脂中生长2.5周后，用光学显微镜计数每个孔中的细胞集落数；

[0172] ②将样品储存在4℃以防止进一步的集落形成。用石蜡薄膜密封六孔板，防止凝胶变干。

[0173] 2.7 破骨细胞培养诱导：

[0174] （1）将４周龄BALB/C小鼠断颈处死，浸泡于75%酒精中15分钟。随后取出小鼠，在操作台上离断小鼠下肢骨附着的皮肤肌肉，从脊柱处分离下肢骨。随后将分离出的完整下肢骨置于PBS中3分钟；

[0175] （2）将下肢骨从PBS中取出，移入超净台中；

[0176] （3）另准备一培养皿，用无菌眼科剪快速剪断长骨两端，1mL注射器抽取完全培养基反复冲洗骨髓腔，直至发白；

[0177] （4）用1mL枪头反复轻柔吹打冲洗液，实现均质化。随后将冲洗液置于孵箱中培养24小时；

[0178] （5）收集培养皿中悬浮细胞。在15mL离心管中加入5mL的ficoll，随后在其上层缓慢加入等体积的细胞悬液。离心2500rpm，30min，此时可见两层液体之间云雾状的分层，吸取此部分置于新的15mL离心管中。加入3mL培养基，再次离心1000rpm，15min。弃上清，重悬细胞。用吸管吸取两层液体分界面处的雾状层液体于另一15ml离心管中，加入少量培养液冲洗、混匀。离心1000rpm，15min，弃上清液，重悬细胞；

[0179] （6）计数细胞，在96孔板中按照2000cells/孔接种细胞，细胞培养基为含30ng/mL M‑CSF的α‑MEM培养基；

[0180] （7）培养24小时后进行细胞换液，更换为含30ng/mL M‑CSF、50ng/mL RANKL的乳腺癌细胞条件培养基。保持此培养条件，2天换液一次；

[0181] （8）定期镜下观察多核巨噬细胞，第四天时可对细胞进行TRAP染色。

[0182] 3.实验结果：通过体外实验，证实过表达TMC5后促进乳腺癌细胞迁移侵袭。反之，抑制乳腺癌细胞迁移侵袭（图3和图4）。在乳腺癌细胞系中过表达TMC5后，可以促进Snail、Vimentin表达，抑制E‑ca表达；敲减TMC5，结果反之（图5）。通过MC3T3E1模拟骨微环境，过表达TMC5促进乳腺癌细胞趋化，敲减TMC5抑制乳腺癌细胞趋化作用（图6）。通过将单核巨噬细胞与乳腺癌细胞培养基共培养，发现过表达TMC5后可以显著促进破骨细胞形成，抑制TMC5抑制破骨细胞形成（图7）。

[0183] 实施例5 体内实验。

[0184] 进一步通过体内实验验证了TMC5促进乳腺癌细胞增殖、迁移和破骨细胞形成的能力。

[0185] 1.实验材料：BALB/C鼠，4T1稳转细胞系，多聚甲醛固定液，matrigel胶，TRAP染色试剂盒。

[0186] 2.实验方法。

[0187] 2.1小鼠乳腺脂肪垫原位成瘤实验：

[0188] （1）将BALB/c雌性小鼠（6周龄，体重16‑20g）随机分为4组（每组5只），分别为TMC5过表达组、TMC5敲减组和它们相应的对照组；

[0189] （2）将5×105个稳转4T1细胞悬浮于100μL PBS和100μL Matrigel胶的混合物中，注射至小鼠的第四对乳腺脂肪垫中；

[0190] （3）于注射后24天处死小鼠，切除肿瘤并拍照、固定、石蜡包埋；

[0191] （4）取小鼠肺、肝、骨，用4%多聚甲醛固定，随后进行显微镜下观察、H＆E染色。对小鼠后肢骨进行X线摄片成像及TRAP染色。

[0192] 2.2 HE染色实验：

[0193] （1）固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h；

[0194] （2）脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h；

[0195] （3）脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min），95%酒精（30min），100%酒精1（25min），100%酒精II（25min）；

[0196] （4）透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）；

[0197] （5）包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时；

[0198] （6）切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片；

[0199] （7）烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

[0200] 2.3组织切片HE染色步骤：

[0201] （1）将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各10min；

[0202] （2）脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2 min，PBS冲洗2次，每次5min；

[0203] （3）苏木素染色3min，自来水冲洗3 min，1%盐酸酒精分色2s，自来水冲洗2 min，依次浸入50%、70%、80%的酒精中各2min，伊红浸泡5s，自来水冲洗3min；

[0204] （4）再将组织切片依次侵入95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中各3min，最后再依次侵入二甲苯I，二甲苯II各5min；

[0205] （5）中性树胶封片，镜检。

[0206] 2.4破骨细胞抗酒石酸磷酸酶染色实验：

[0207] （1）37℃预热足够的去离子水；

[0208] （2）Fixation solution（固定液）室温放置，细胞爬片浸没30秒，用去离子水彻底清洗，不要让爬片太干燥；

[0209] （3）准备两个1.5mL EP管，各加0.5mL Fast garnet GBC Base solution（快速石榴石型碱溶液）和0.5mL Sodium Nitrite Solution（亚硝酸盐溶液），轻轻混匀30秒，室温静置2分钟。两者混合后为步骤三混匀的溶液；

[0210] （4）另标签一个50mL离心管为A（B），并按以下要求配置混合液；

[0211] （5）把步骤4中的配置的染色液倒入合适的染色缸中，水浴加热到37℃，再加玻片前一定要保证温度达到37℃；

[0212] （6）把爬片放入染色缸中，37℃避光孵育1小时；

[0213] （7）孵育1小时后，用去离子水彻底清洗爬片；

[0214] （8）在HematoxylinGill NO.3(苏木精溶液)复染2分钟；

[0215] （9）碱性自来水冲洗几分钟，直到出现蓝色的核；

[0216] （10）自然晾干，甘油明胶封片，显微镜观察。

[0217] 3.实验结果：

[0218] 体内实验证实，TMC5过表达的乳腺癌细胞，显著促进乳腺癌特异性骨转移，敲减TMC5后，显著抑制骨转移发生率（图8‑10）。

[0219] 综上所述，本发明在乳腺癌病人的癌组织和对应的癌旁组织中比较TMC5的表达，发现TMC5在癌组织中RNA和蛋白水平显著上调。通过分析患者的临床病例资料，发现TMC5在乳腺癌骨转移患者中显著高表达，且为特异性高表达，在肝肺转移中未发现其高表达这一现象。进而通过体内、体外功能实验发现：在乳腺癌细胞中TMC5蛋白的过表达与肿瘤细胞的迁移、增殖、钙离子趋化性、骨微环境定植和破骨细胞形成增加显著相关。当在乳腺癌细胞中敲除TMC5则可以显著抑制上述现象。同时，本发明还证实了TMC5基因可以显著促进乳腺癌患者发生骨转移，抑制TMC5的表达可以达到抑制乳腺癌骨转移的发生。