一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用

摘要

本发明提供一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法，通过采集人静脉血后分离红细胞并体外添加红细胞凋亡诱导药物诱导其快速凋亡，从而产生大量的凋亡囊泡，通过梯度离心法进行分离得到的凋亡囊泡。凋亡囊泡的制备方法简单，且时间短、产量高，并可以进行快速检测，通过本发明的方法制备的凋亡囊泡可促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化，从而提高人骨髓间充质干细胞体外成骨能力，达到促进骨再生的目的，在应用于促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化药物的制备和骨缺损治疗方面有着较广阔的开发前景。

权利要求

1.一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）静脉采集血液离心，提取下层红色沉淀，无菌PBS洗涤2次获得红细胞；

2）分离得到的红细胞中加入红细胞凋亡诱导液，冰上诱导处理15‑30分钟，通过梯度离心法获取人红细胞来源的凋亡囊泡；

所述红细胞凋亡诱导液由NH4Cl 150mM、KHCO310 mM和EDTA‑2Na 0.1mM组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，红细胞与红细胞凋亡诱导液体积比为1:6 ‑ 1:10。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导处理时间为30分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞凋亡诱导液pH7.1‑7.4。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述红细胞凋亡诱导液经过0.22 μm滤器过滤除菌后使用。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度离心法包括以下步骤：（1）将凋亡诱导处理后的红细胞悬液，800 g，4℃，离心10分钟，去除细胞碎片；

（2）收集上清液，16000g，4℃，离心30分钟；

（3）收集沉淀物，用无菌PBS洗涤1次，16000g，4℃，离心30分钟；

（4）收集沉淀物，用PBS重悬，获得人红细胞来源的凋亡囊泡。

7.采用权利要求1‑6任一项所述的方法获得的红细胞凋亡囊泡在促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化药物的制备中的应用。

说明书

一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物组织工程技术领域，具体为一种可用于促进间充质干细胞成骨分化的人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用。

背景技术

[0002] 外伤、感染、手术或先天畸形导致的骨缺损在临床中非常常见，通过骨组织工程进行骨再生治疗是组织工程研究领域的热点。近年来，外泌体等细胞外囊泡在骨再生中的应用逐渐得到重视。细胞外囊泡是细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到5000nm不等，根据粒径大小和分泌方式主要分为外泌体、微囊泡、凋亡囊泡。生理状态下的细胞主要分泌外泌体和微囊泡；而凋亡状态下的细胞主要分泌凋亡囊泡（apoptotic vesicles，apoVs），可以分为粒径50‑1000nm的凋亡微囊泡和粒径1000‑5000nm的凋亡小体以及粒径小于150nm的凋亡外泌体。细胞凋亡是机体新陈代谢必不可少的环节，而骨骼在损伤后修复过程中也存在着受损细胞凋亡等过程。现有技术在提取细胞凋亡囊泡时多采用星形孢菌素等细胞毒性药物与细胞共培养12‑24小时，使细胞缓慢凋亡的同时产生凋亡囊泡，时间较长、效率较低，且产量不高。红细胞（red blood cells，RBCs）是人体中含量最高的血液细胞，来源广泛，提取简便。目前，针对红细胞的研究多为利用红细胞制备囊泡膜或红细胞膜包裹药物、纳米颗粒等，而针对红细胞诱导产生凋亡囊泡应用于骨再生治疗的方法较少，且其同样存在时间长、效率低、产量低的技术问题，因此利用人红细胞快速制备大量凋亡囊泡并应用在骨组织缺损治疗和应用于促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化药物的制备方面有着较广阔的开发前景。

发明内容

[0003] 本发明通过采集人静脉血后分离红细胞并添加药物诱导其凋亡，从而快速产生大量红细胞来源的凋亡囊泡。

[0004] 本发明提供一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法，包括以下步骤：

[0005] 1）静脉采集血液离心10分钟，提取下层红色沉淀，无菌PBS洗涤2次获得红细胞；

[0006] 2）分离得到的红细胞中加入红细胞凋亡诱导液，冰上诱导处理15‑30分钟，通过梯度离心法获取人红细胞来源的凋亡囊泡。

[0007] 所述红细胞凋亡诱导液由 、 和EDTA‑2Na 0.1mM组成。

[0008] 具体的，红细胞与红细胞凋亡诱导液的体积比为1:6 ‑ 1:10。

[0009] 诱导处理时间优选为30分钟。

[0010] 所述红细胞凋亡诱导液pH7.1‑7.4，红细胞凋亡诱导液经过0.22 μm滤器过滤除菌后使用。

[0011] 所述的梯度离心法包括以下步骤：

[0012] （1）将凋亡诱导处理后的红细胞悬液，800 g，4℃，离心10分钟，去除细胞碎片；

[0013] （2）收集上清液，16000 g，4℃，离心30分钟；

[0014] （3）收集沉淀物，用无菌PBS洗涤1次，16000 g，4℃，离心30分钟；

[0015] （4）收集沉淀物，用PBS重悬，获得人红细胞来源的凋亡囊泡。

[0016] 本发明提供一种前述的方法在促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化上的应用。

[0017] 具体的，所述应用为将前述方法获得的红细胞凋亡囊泡应用于促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化药物的制备。在加入apoVs后，人骨髓间充质干细胞的RUNX2、ALP、OCN基因表达量和RUNX2蛋白表达量明显升高，人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化能力增加。

[0018] 有益效果：

[0019] 本发明通过采集人静脉血后分离红细胞并体外添加红细胞凋亡诱导药物诱导其凋亡，从而产生凋亡囊泡。本发明的红细胞凋亡囊泡（apoptotic vesiclesderived from red blood cells, RBC‑apoVs）制备方法简单，且耗时短（诱导凋亡时间仅需15‑30分钟）、11
成本低、产量大（获得的RBC‑apoVs浓度可达到5.9×10  Particles / mL）、效率高，并可以进行快速检测。

[0020] 由于本发明制备方法采用来源于人体自身血液中的红细胞获得凋亡囊泡，避免了伦理问题和免疫问题。

[0021] 使用本发明的方法获得的凋亡囊泡能够促进间充质干细胞成骨向分化，从而提高间充质干细胞体外成骨能力，达到促进骨再生的目的，在治疗骨组织缺损有着较广阔的开发应用前景。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0023] 图1为人红细胞体外诱导凋亡和提取RBC‑apoVs的流程示意图；

[0024] 图2为RBC‑apoVs的提取结果检测图，其中，A为人血中分离的红细胞的扫描电镜观测结果；B为RBC‑apoVs的透射电镜观测结果；C为RBC‑apoVs的纳米颗粒跟踪分析检测结果；D为RBC‑apoVs高表达红细胞特征标志蛋白CD235a和凋亡囊泡表面标志物磷脂酰丝氨酸的流式细胞术检测结果；

[0025] 图3为RBC‑apoVs促进人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化；其中，A为茜素红染色图；B为ALP染色图；C为ALP酶活性定量结果；

[0026] 图4为加入RBC‑apoVs后，人骨髓间充质干细胞的RUNX2、ALP、OCN基因Real‑time qPCR实验结果和RUNX2蛋白质印记实验结果，其中，A为RUNX2基因表达量；B为ALP基因表达量；C为OCN基因表达量；D为RUNX2蛋白表达量的蛋白印迹实验结果。

具体实施方式

[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0029] 下述实施例中所用的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

[0030] 实施例1人红细胞来源的apoVs的高效提取和特征分析

[0031] 1. 人红细胞凋亡囊泡的制备流程具体如下（如图1所示）：

[0032] （1）静脉采集健康人的血液，室温下300g离心10分钟，提取下层红细胞沉淀；用无菌PBS洗涤、离心（300 g，室温，离心10分钟），重复2次，获得的沉淀物为红细胞（RBCs）。

[0033] 使用场发射扫描电镜观察红细胞形态。

[0034] （2）将分离得到的红细胞体外添加红细胞凋亡诱导液，冰上诱导其快速凋亡。红细胞与红细胞凋亡诱导液的体积比约为1:6   1:10。~

[0035] 红细胞凋亡诱导液的配制方法为：氯化铵 8.3 g、碳酸氢钾1.0 g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA‑2Na）37.2 mg，调节pH7.1‑7.4，加蒸馏水定容至1 L，经
0.22 μm滤器过滤除菌后使用。

[0036] （3）凋亡诱导处理15‑30分钟后，通过梯度离心法获取RBC‑apoVs。具体的：

[0037] 将凋亡诱导后的红细胞悬液800 g，4℃，离心10分钟，去除细胞碎片；

[0038] 收集上清液，16000 g，4℃，离心30分钟；

[0039] 收集沉淀物，用无菌PBS洗涤，16000 g，4℃，离心30分钟；

[0040] 收集沉淀物，用200 μl无菌PBS重悬，获得RBC‑apoVs。

[0041] 通过冷冻透射电镜检测RBC‑apoVs的形态，使用ZetaView纳米颗粒跟踪分析检测其粒径和浓度，使用流式细胞术分析RBC‑apoVs所包含的红细胞特征标志蛋白CD235a及凋亡囊泡表面特征标志物磷脂酰丝氨酸。

[0042] 2. 场发射扫描电镜：

[0043] 1）取新鲜分离的红细胞，加入新鲜配制的2.5%戊二醛，4℃固定30分钟以上；

[0044] 2）PBS洗涤2次，加适量Milli‑Q水重悬，取2‑3滴，滴加到硅片上；

[0045] 3）放入含硅胶干燥剂的玻璃干燥器中，自然干燥24小时；

[0046] 4）用双面胶带将干燥后的硅片粘贴在样品台上，离子溅射仪喷金，Hitachi S4800扫描电镜观察。

[0047] 结果如图2A所示，红细胞表面规整，呈双凹圆盘状。证明该法能有效分离红细胞。

[0048] 3. 冷冻透射电镜：

[0049] 1）吸取5μl凋亡微囊泡悬液滴到铜网上，室温静置1min；

[0050] 2）用滤纸沿铜网外侧吸去多于液体，吸取5μl2%醋酸铀酰滴入铜网上，室温下静置30秒；

[0051] 3）用滤纸沿铜网外侧吸去多余液体，室温下静置干燥；

[0052] 4）透射电镜下拍摄图像，电压设置为120kV。

[0053] 结果如图2B所示，人红细胞凋亡囊泡呈中间凹陷的圆盘状，符合凋亡囊泡的特征。

[0054] 4. ZetaView纳米颗粒跟踪分析：

[0055] 1）样本用PBS进行适量稀释后，使用ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪进行分析；

[0056] 2）观测待测囊泡的布朗运动轨迹。

[0057] 所得结果如图2C所示 ，其平均粒径180 .4nm，平均浓度可达到，说明采用本申请实施例1的方法提取得到的RBC‑apoVs产量
较高，且其得到的凋亡囊泡主要为凋亡微囊泡。

[0058] 5. 流式细胞术检测：

[0059] 1）鉴定RBC‑apoVs表面的人红细胞表面特异标记蛋白CD235a：将本实施例获得的凋亡囊泡样本液用流式缓冲液稀释至 作为试验组加入PE‑抗人CD235a抗体，设立不加抗体的空白对照组，分别4℃避光孵育30分钟。

[0060] 2）鉴定RBC‑apoVs表面的磷脂酰丝氨酸：样本稀释至 ，根据Annexin V‑FITC试剂盒（碧云天，C1062L）说明书进行Annexin V‑FITC染色，Annexin‑V可以特异性结合磷脂酰丝氨酸。设立不加Annexin V‑FITC的空白对照组。

[0061] 所得结果如图2D所示，左侧浅色峰代表空白对照组，右侧深色峰代表实验组，实验结果表明RBC‑apoVs的表面高表达红细胞特征蛋白CD235a，阳性率99.9%；同时高表达凋亡囊泡标志磷脂酰丝氨酸，阳性率92.4%。以上结果证明，本法提取得到的是红细胞来源的凋亡囊泡，具备红细胞及凋亡囊泡的表面特征。

[0062] 实施例2体外染色和半定量实验检测人红细胞来源的apoVs对人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化的作用

[0063] 将人骨髓间充质干细胞进行普通增殖培养（proliferation medium, PM）或成骨诱导培养（osteogenic medium, OM）或在成骨诱导培养条件下加入人红细胞来源的apoVs（OM+RBC‑apoVs：0.50μg/ml）。在成骨诱导培养7天后进行后进行茜素红染色、ALP染色和ALP酶活性定量检测。

[0064] 1. 细胞培养：人骨髓间充质干细胞购于美国ScienCell Research Laboratories(Carlsbad, CA, USA)。

[0065] 增殖培养基（PM）：含有10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素的α‑MEM培养基。

[0066] 成骨向分化培养基（OM）：含有10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素，0.2 mM维生素C, 10 mMβ‑磷酸甘油钠和100 nM地塞米松的α‑MEM培养基。

[0067] 在成骨诱导培养条件下加入0.90μg/ml人红细胞来源的apoVs（OM+RBC‑apoVs）。

[0068] 细胞以 个/孔的密度接种至12孔板，37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次。

[0069] 2. 茜素红染色：

[0070] 1）细胞成骨诱导7天后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入95%乙醇，室温固定30分钟；

[0071] 2）弃去95%乙醇，用Milli‑Q水洗涤3次；

[0072] 3）每孔加入适量茜素红染液，室温染色直至有差异时终止;

[0073] 4）用Milli‑Q水洗涤3次，进行扫描。

[0074] 染色结果如图3A所示，与PM组相比，OM组的颜色加深，而OM+RBC‑apoVs组的颜色较OM组显著变深，说明添加RBC‑apoVs后细胞的矿化能力显著增强，证明添加RBC‑apoVs促进了人骨髓间充质干细胞的成骨分化。

[0075] 3. ALP染色：

[0076] 1）细胞成骨诱导7天后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入95%乙醇，室温固定30min；

[0077] 2）弃去95%乙醇，用PBS洗涤3次；

[0078] 3）每孔加入碱性磷酸酶染液，室温避光染色直至有差异时终止;

[0079] 4）用PBS洗涤3次，进行扫描。

[0080] 染色结果如图3B所示，与PM组相比，OM组的颜色加深，而OM+RBC‑apoVs组的颜色较OM组显著变深，说明添加RBC‑apoVs后细胞的碱性磷酸酶活性明显提高，碱性磷酸酶是成骨细胞的活性标志物之一，以上结果说明添加RBC‑apoVs促进了人骨髓间充质干细胞细胞的成骨分化。

[0081] 4. ALP酶活性定量检测：

[0082] 碱性磷酸酶测试盒（酶标仪法）购自南京建成生物工程研究所。

[0083] 1）细胞成骨诱导7天后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入100μl1%TritonX‑100，冰上处理10分钟；

[0084] 2）将裂解后的细胞转移至离心管中，4℃，14000g，离心15min，收集上清液：

[0085] 3）BCA法测量每样本的总蛋白浓度；

[0086] 4）在96孔板中，每孔加入30μl的上清液，100μl检测工作液；

[0087] 5）混匀，37℃下孵育15min；

[0088] 6）每孔加入150μl显色液，检测520nm下的吸光度值。

[0089] 结果如图3C所示，与普通增值培养组（PM）相比，成骨诱导培养后OM组的ALP表达量显著提高，而与OM组相比，OM+RBC‑apoVs组的ALP表达量显著提高（***P<0.001）。以上结果显示，添加RBC‑apoVs能有效促进干细胞的体外成骨能力。

[0090] 实施例3体外分子生物实验检测人红细胞来源的apoVs对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的作用

[0091] 将人骨髓间充质干细胞以 个/孔的密度接种至6孔板，在以下三种培养条件下培养：1）增殖培养基（PM）；2）成骨诱导（OM）；3）成骨诱导培养基中加入人红细胞来源的apoVs（OM+RBC‑apoVs：0.50μg/ml）。14天后收集细胞，qRT‑PCR检测成骨关键基因RUNX2、ALP、OCN的表达。

[0092] 将人骨髓间充质干细胞接种于60mm培养皿，分别进行普通增殖培养（PM）或成骨诱导培养（OM）或在成骨诱导培养条件下加入人红细胞来源的apoVs共培养14天，检测成骨关键蛋白RUNX2的表达。

[0093] qRT‑PCR实验检测成骨关键基因RUNX2、ALP、OCN的表达步骤如下：

[0094] 1. 细胞总RNA提取

[0095] 将人骨髓间充质干细胞以 个/孔的密度接种至6孔板，3种不同条件诱导14天后提取总RNA。具体步骤如下：

[0096] 1）吸净培养基，PBS冲洗。

[0097] 2）加入Trizol试剂（1 ml/孔），移入1.5ml的离心管中。

[0098] 3）加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，冰上放置3分钟。

[0099] 4）4℃，12000g，离心15分钟。

[0100] 5）静置，吸取上层水相转移到另一离心管。

[0101] 6）加入400μl异丙醇，混匀，冰上静置5分钟。

[0102] 7）4℃，12000g，离心10分钟。

[0103] 8）弃上清，加入1ml预冷无水乙醇和DEPC水配制的75%乙醇，洗涤沉淀。

[0104] 9）4℃，7500g，离心5分钟。

[0105] 10）弃上清，吸净液体，室温下干燥沉淀，加入适量DEPC水，提取的总RNA于‑80℃分装保存或进行下一步实验。

[0106] 2. 逆转录合成cDNA

[0107] 1）逆转录反应体系为20μl，总RNA使用量约为1000ng。

[0108] 2）取提取的总RNA 1000ng，按照试剂盒说明书在冰上配制逆转录反应液。

[0109] 3）逆转录反应条件：37℃，15分钟进行逆转录反应；85℃，5秒进行逆转录酶失活反应；4℃保持，可以于‑20℃分装保存或进行下一步实验。

[0110] 3. 实时定量PCR反应

[0111] 1）每个样品每个基因检测三个副孔，八联管每孔内配置20μl反应体系，使用试剂及用量如下，其中引物序列如表1所示：

[0112]

[0113] 2）PCR反应条件为：95℃热启动10分钟，95℃变性30秒；60℃退火延伸1分钟，共40个循环；

[0114] 3）以GAPDH为内参，使用ΔΔCt法分析数据，实验数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。

[0115] 引物序列如表1所示：

[0116] 表1.qRT‑PCR引物序列

[0117]

[0118] 结果如图4A‑C所示：与增殖培养基组（PM）相比，成骨诱导培养后成骨相关基因RUNX2、ALP、OCN表达水平均显著上升。与对照组（OM）相比，在成骨诱导培养条件下加入人红细胞来源的apoVs后，RUNX2、ALP、OCN基因表达水平显著提高，证明RBC‑apoVs可以促进人骨髓间充质干细胞的成骨相关基因的表达（**P<0.005）。

[0119] 4. 蛋白质印记实验

[0120] （1）收取60mm培养皿中的细胞，每个培养皿加入适量RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，使用细胞刮刀将细胞收集至离心管中；

[0121] （2）冰上放置30 min，使细胞完全裂解；

[0122] （3）4℃，12000g离心20分钟，吸取上清，使用BCA法检测蛋白浓度，99℃5分钟使蛋白变性，即得到蛋白样品;

[0123] （4）配置10％SDS‑PAGE胶，每孔加入等量蛋白样品：

[0124] （5）恒压80V电泳，待电泳条带完全的跑出浓缩胶时，调整电压至120V，直至溴酚蓝完全跑出分离胶；

[0125] （6）按照海绵—滤纸—分离胶—膜—滤纸—海绵的模型放置转膜夹，110V，300mA电转1.5小时;

[0126] （7）电转结束后，将PVDF膜取出置于5％的脱脂奶粉中，摇床封闭1小时：

[0127] （8）根据蛋白分子量大小，将RUNX2和GAPDH蛋白条带剪下，孵育相应的一抗，4℃，过夜；

[0128] （9）TBST洗膜3次，每次10分钟，孵育二抗，室温摇床孵育60分钟；

[0129] （10）TBST洗膜3次，每次10分钟，然后进行曝光。

[0130] 结果如图4D所示，在成骨诱导（OM）培养条件下，诱导的同时加入apoVs会显著增加成骨标志蛋白RUNX2的表达量，证明人红细胞来源的apoVs促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化。

[0131] 可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行局部修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明保护范围之内。