水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用

摘要

本发明公开了一种水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用，所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，在本发明中，利用CRISPR‑Cas9编辑技术，编辑水稻OsbZIP39基因第一外显子区域的靶序列，使靶序列产生缺失2个碱基的突变，得到基因突变植株osbzip39，发现其负责镉吸收转运的基因表达下调而负责镉外排的基因表达上调，因而对镉的外排能力增强，从而可以抵抗高浓度镉胁迫。水稻OsbZIP39基因的克隆和新功能的发现，为水稻遗传育种提供了新的基因靶点和资源。

权利要求

1.一种水稻OsbZIP39基因突变载体在提高水稻镉抗性中的应用，其特征在于，所述基因突变载体是利用CRISPR‑Cas9编辑技术，编辑水稻OsbZIP39基因第一外显子区域的靶序列，使靶序列产生缺失2个碱基的突变构建而得，所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述靶序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的水稻OsbZIP39基因突变载体在提高水稻镉抗性中的应用，其特征在于，针对所述靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种提高水稻镉抗性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用CRISPR‑Cas9编辑技术构建水稻OsbZIP39基因突变载体，使水稻OsbZIP39基因的功能丧失；所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种培育抗镉水稻的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用CRISPR‑Cas9编辑技术构建水稻OsbZIP39基因突变载体，使水稻OsbZIP39基因的功能丧失；所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用。

背景技术

[0002] 近年来土壤镉(cadmium，Cd)污染问题日益严峻，土壤Cd超标会对植物造成极大危害，不仅影响其正常生长造成粮食作物的减产，而且土壤中的Cd会在粮食作物中富集，对人体健康造成极大的威胁。

[0003] 水稻作为重要的粮食作物之一，其品质受到民众的广泛关注。目前，我国许多省市均存在大米Cd含量超标的问题，因此挖掘水稻抗Cd基因，解析水稻对Cd的调控机制，降低大米中的Cd含量，是发展绿色农业，保证农作物产量和质量，实现食品与环境安全和提高农业产值的基础。

发明内容

[0004] 基于此，本发明的目的之一是提供一种水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用。

[0005] 实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

[0006] 水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用，所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0007] 本发明还提供了水稻OsbZIP39基因在水稻遗传育种中的应用。

[0008] 本发明还提供了水稻OsbZIP39蛋白在提高水稻镉抗性中的应用，所述水稻OsbZIP39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明还提供了水稻OsbZIP39蛋白在水稻遗传育种中的应用。

[0010] 本发明还提供了一种水稻OsbZIP39基因突变载体，所述基因突变载体是利用CRISPR‑Cas9编辑技术构建而得，所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 在其中一些实施例中，所述CRISPR‑Cas9编辑技术编辑水稻OsbZIP39基因第一外显子区域的靶序列，使靶序列产生缺失2个碱基的突变；所述靶序列如SEQ ID NO.3所示。

[0012] 在其中一些实施例中，针对所述靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

[0013] 本发明还提供了上述水稻OsbZIP39基因突变载体在提高水稻镉抗性中的应用。

[0014] 本发明还提供了上述水稻OsbZIP39基因突变载体在水稻遗传育种中的应用。

[0015] 一种提高水稻镉抗性的制剂，所述制剂的活性成分包括上述水稻OsbZIP39基因突变载体。

[0016] 一种提高水稻镉抗性的方法，所述方法包括步骤：利用CRISPR‑Cas9编辑技术构建水稻OsbZIP39基因突变载体，使水稻OsbZIP39基因的功能丧失；所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0017] 一种培育抗镉水稻的方法，所述方法包括步骤：利用CRISPR‑Cas9编辑技术构建水稻OsbZIP39基因突变载体，使水稻OsbZIP39基因的功能丧失；所述水稻OsbZIP39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0018] 在其中一些实施例中，所述CRISPR‑Cas9编辑技术编辑水稻OsbZIP39基因第一外显子区域的靶序列，使靶序列产生缺失2个碱基的突变；所述靶序列如SEQ ID NO.3所示。

[0019] 在其中一些实施例中，针对所述靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0021] 在本发明中，利用CRISPR‑Cas9编辑技术，编辑水稻OsbZIP39基因第一外显子区域的靶序列，使靶序列产生缺失2个碱基的突变，得到基因突变植株osbzip39，发现其负责镉吸收的基因表达下调而负责镉外排的基因表达上调，因而对镉的外排能力增强，从而可以抵抗高浓度镉胁迫。水稻OsbZIP39基因的克隆和新功能的发现，为水稻遗传育种提供了新的基因靶点和资源。

附图说明

[0022] 图1中的A为本发明实施例1中水稻OsbZIP39基因的外显子区域信息，B为水稻OsbZIP39基因第一外显子靶点位置产生的缺失2个碱基的突变。

[0023] 图2为本发明实施例2中野生型ZH11和基因突变osbzip39株系对高浓度镉胁迫的抗性研究结果。

[0024] 图3为本发明实施例3中野生型ZH11和基因突变osbzip39株系对镉转运能力的研究结果，其中Infflux表示镉离子内流；Efflux表示镉离子外排。

[0025] 图4为本发明实施例4中野生型ZH11和基因突变osbzip39株系中镉途径相关基因表达量的检测结果。

具体实施方式

[0026] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

[0027] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

[0028] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0029] 在本发明的其中一个方面，提供了水稻OsbZIP39基因在提高水稻镉抗性中的应用，所述水稻OsbZIP39基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

[0030] SEQ ID NO.1

[0031] ATGGCGGAGCCGGCCCTGCTGGACCCCACCGCCGCCTTCGACCTCCGCCTCTACCCGGCCCACCTCTTCGACCACGAACTCCCTCTCGCCGGCGGCGGCGGCGGCGACGACGACGACGACCTCCCGCTCGACGGGCTCGAGTTCGACCTGCCCGGCGATTTCTCCGTGGAGGACTTCCTCCTCCGGTCTCCGGAGCGGGACGACTCCGGCGAGGGCTCTGCTGCCGGATCCGGGCCCACCGCCTCCCCGTCGTCGTCCCCGACCACCTCGGCGTCCAACTCCGCCGTCGCCAACGGCAGCGGCGGCGAGGTCAAGCACGAGGAGTCGGATGAGGGGAGGAGCGGTGGGGGTGACCCCAAGTGGAGCCTGAAGCGGAAGCAGGCGAGCCCCGGCCCGAGCTCGGACGCGGCCAAGTGCCGCCGATCCGGGGACGGCGACGTTTCTCCGTCGGCGTCGGCGTCGCGGACCGCTGTGGATTCCGACGAGGGGGGGACGGTGTGCGAGGAGGAGGAGGACGAGCGGCGGGCGGCGCGGCTGATGCGGAACCGCGAGAGCGCGCAGCTGTCTCGGCAGAGGAAGAAGCGGTACGTGGAGGAGCTGGAGGAGAAGGTGAAATCGATGCACTCGGTGATTAATGACCTCAATTCTAGGATCTCCTTTGTCGTGGCCGAGAACGCAACACTGCGGCAGCAGCTTAGTGGCGGCAGTGTGAATTGCCCACCACCTGGGGTGTATCCGCCGGCGCCAATTCCCGGCATGCATTTCCCATGGATGCCTGGGTATGCAATGAGACCCCCTGGTTCCCATGTACCTCTTGTGCCAATCCCCCGGTTGAAGCCGCAACAGCCAGTGCCTTCATCCAAAGTAGTGAAGAAACCAGAGAGCAAGAAGACTGTGGAGAACAAGAGTAAGAGCAAGACCAAGACCAAGAAGGTGGCTAGTGTTAGCCTTCTTGGTTTGCTGCTTATTATGCTTGTCTTTGGTGCTTTCATTCCAGGGTTTAATCATAACTTTGGAATGTGTGGGCAGAGTGATAATGCTATGTTTAGGAATTTTGGTCAGTCTCATGCTAGGGTGTTGAGTGTCAGTAGCCAGGATAAAAGTAGTTTGAACAATAGCGACATGATTGGTGTTGATGTTGGAAAGATGACGGGGAATACTGATGGGCCAGGGAAGAAACATCAGCCTGCACACAACTCAAGTGAGATCCTCCCTGCTTTGTTGTATGTGCCGAGGAATGGAAAGCATGTTAAGATCAACGGCAACCTGATTATTCATTCTGTGCTTGCAAGCGAGAAAGCAGTGGCACATAAGGCCTCAAAAGATGATAGTGATCAGTCAGCTAGAGATCACAAAGAGACTAGTGTTGCCATAGCTCGTTATCTTTCGCTGCCTGGAAAGGATGTGAATCGACAGGAGACATCCTCGGCAGATGGACCATTGCCACAATGGTTTCGTGAAGGAATGGAAGGACCTATATTAAATTCTGGAATGTGCAGTGAGGTATTTCAGTTTGACATTTCGACGGCTTCTAGCAATCCTGGTGGCATTATACCTGCATCTCCTGTTGTGAACTCGTCAAGTGTCAATGCTACCGAGAAAATCCCAGCACATTCTGCTGCTTATCATGGCAAGCTGAAAAACAGAAGAGTCATGTACAATGAAGCGATTCCACTCACCGGGAAGACGGCGAACAACACAGAGCCTTTTAACAGAACCTCTGAAAGCAGCAGCAAGTTACCTGATAGCAAGCCAGCATCATCAGTTGTTGTCTCGGTGCTAGCCGATCCAAGGGAGGCTGGTAATGGGGATGGCGATCCGAGAGTATCTCCGAAACCCCTGTCCAAGATATTTGTTGTTGTTCTTGTTGACGGTGTGAGATATGTCACTTACTCCTGCACGCTTCCTTTCAAGAGCTCCAGCCCACATCTTGTGAACTAA[0032] SEQ ID NO.2

[0033] MAEPALLDPTAAFDLRLYPAHLFDHELPLAGGGGGDDDDDLPLDGLEFDLPGDFSVEDFLLRSPERDDSGEGSAAGSGPTASPSSSPTTSASNSAVANGSGGEVKHEESDEGRSGGGDPKWSLKRKQASPGPSSDAAKCRRSGDGDVSPSASASRTAVDSDEGGTVCEEEEDERRAARLMRNRESAQLSRQRKKRYVEELEEKVKSMHSVINDLNSRISFVVAENATLRQQLSGGSVNCPPPGVYPPAPIPGMHFPWMPGYAMRPPGSHVPLVPIPRLKPQQPVPSSKVVKKPESKKTVENKSKSKTKTKKVASVSLLGLLLIMLVFGAFIPGFNHNFGMCGQSDNAMFRNFGQSHARVLSVSSQDKSSLNNSDMIGVDVGKMTGNTDGPGKKHQPAHNSSEILPALLYVPRNGKHVKINGNLIIHSVLASEKAVAHKASKDDSDQSARDHKETSVAIARYLSLPGKDVNRQETSSADGPLPQWFREGMEGPILNSGMCSEVFQFDISTASSNPGGIIPASPVVNSSSVNATEKIPAHSAAYHGKLKNRRVMYNEAIPLTGKTANNTEPFNRTSESSSKLPDSKPASSVVVSVLADPREAGNGDGDPRVSPKPLSKIFVVVLVDGVRYVTYSCTLPFKSSSPHLVN

[0034] 应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，在不改变氨基酸序列的前提下，对本发明的编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

[0035] 本发明的另一方面提供了一种培育抗镉水稻的方法，所述方法包括步骤：利用CRISPR‑Cas9编辑技术，在针对水稻OsbZIP39基因第一外显子区域靶序列的sgRNA序列(SEQ ID NO.4)指导下，编辑第一外显子区域的靶序列(SEQ ID NO.3)，使靶序列产生缺失2个碱基的突变(图1中的B)，使水稻OsbZIP39基因的功能丧失，构建获得水稻OsbZIP39基因突变载体。

[0036] 靶序列(SEQ ID NO.3)：5'‑GCCCCAAGTGGAGCCTGAAG‑3'

[0037] sgRNA序列(SEQ ID NO.4)：

[0038] TAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGGCTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCACATGTCTCTTCAGCATCCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

[0039] 以下结合具体实施例来详细说明本发明。

[0040] 实施例1水稻OsbZIP39基因突变载体的构建和基因突变水稻T0植株的获得[0041] 本实施例首先构建得到了水稻OsbZIP39基因突变载体，再继而获得了基因突变水稻T0植株。具体包括以下步骤：

[0042] 1、菌种活化和质粒提取制备

[0043] 将携带pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H载体(实验室保存，华南农业大学刘耀光院士馈赠)的菌种(TOP10F’,实验室保存)在含有卡那霉素(25μg/ml)的LB平板培养基上划线培养过夜，将携带pYLsgRNA1‑OsU3/LacZ载体(所述pYLsgRNA1‑OsU3/LacZ载体为携带SEQ ID NO.4的sgRNA序列、OsU3启动子序列、LacZ基因序列的PUC18载体，可通过本领域常规技术构建)的菌种(DH5α)在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板培养基上划线培养过夜，分别挑取单菌落培养种子液，再扩大培养，提取质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H和pYLsgRNA1‑OsU3/LacZ；

[0044] 2、构建sgRNA表达盒

[0045] (1)、第一轮PCR反应

[0046] 以2‑5ngpYLsgRNA1‑OsU3/LacZ质粒为模板，U‑F(SEQ ID NO.5)和OsU3T1R(SEQ ID NO.6)为引物(引物在反应体系中的浓度各为0.2μM)，扩增体系为10μl(具体为2x PCRbuffer forKOD FX 5μl、2mM dNTPs 2μl、U‑F 0.2μl、OsU3T1R 0.2μl、pYLsgRNA1‑OsU3/LacZ质粒0.2μl、KOD FX 0.2μl、灭菌超纯水2.2μl)，进行PCR扩增，得到产物a；以2‑5ngpYLsgRNA1‑OsU3/LacZ质粒为模板，gR‑R(SEQ ID NO.7)和OsU3T1F(SEQ ID NO.8)为引物(引物在反应体系中的浓度各为0.1μM)，扩增体系为10μl(具体为2x PCRbuffer forKOD FX 5μl、2mM dNTPs 2μl、gR‑R 0.2μl、OsU3T1F 0.2μl、pYLsgRNA1‑OsU3/LacZ质粒0.2μl、KOD FX 0.2μl、灭菌超纯水2.2μl)，进行PCR扩增，得到产物b；PCR反应程序均为：98℃10s，
55℃15s，72℃20s，28个循环；

[0047] U‑F(SEQ ID NO.5)：5'‑CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‑3'

[0048] OsU3T1R(SEQ ID NO.6)：5'‑AAACCTTCAGGCTCCACTTGGGGC‑3'

[0049] gR‑R(SEQ ID NO.7)：5'‑CGGAGGAAAATTCCATCCAC‑3'

[0050] OsU3T1F(SEQ ID NO.8)：5'‑GGCAGCCCCAAGTGGAGCCTGAAG‑3'

[0051] (2)、第二轮PCR反应

[0052] 分别取1μl第一轮PCR反应获得的产物a和b，用H2O稀释10倍，然后各取1μl混合作为模板，Pps‑GGL(SEQ ID NO.9)和Pgs‑GGR(SEQ ID NO.10)作为引物，扩增体系为50μl，用高保真酶PRIMESTAR MAX PCR酶进行扩增(具体体系为：2x PrimeSTARMax Premix 25μl、Pps‑GGL 1.5μl、Pgs‑GGR 1.5μl、模板1μl、灭菌超纯水21μl)，得到sgRNA表达盒；PCR反应程序如下：28个循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s；

[0053] Pps‑GGL(SEQ ID NO.9)：

[0054] 5'‑TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG‑3'

[0055] Pgs‑GGR(SEQ ID NO.10)：

[0056] 5'‑AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC‑3'

[0057] 3、步骤(1)获得的pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H载体与步骤(2)获得的sgRNA表达盒进行酶切‑连接反应，得到连接产物(即：水稻OsbZIP39基因突变载体)；所述酶切‑连接反应为：37℃10min，10℃5min，20℃5min，3个循环；再37℃3min，10℃5min，20℃5min，10个循环；最后37℃5min。所述pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H载体与sgRNA表达盒的质量比为8：1；

[0058] 连接反应体系如表1所示：

[0059] 表1酶切‑连接反应体系

[0060]

[0061] 4、连接产物转化E.coli感受态细胞

[0062] 从超低温冰箱中取出一管大肠杆菌感受态DH5α，放置在冰上约10min待感受态融化。按1:10的比例，将步骤3获得的连接产物，加入E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激90s，破坏感受态细胞的双分子膜结构，再冰浴5min；然后加入1ml LB培养基，37℃培养1～1.5h后，5000g离心1min，弃500μl上清后重悬细菌。将细菌涂平板(涂板培养基为LB+25μg/ml Kan，0.3～0.5mM IPTG，适量X‑gal)，倒置于37℃培养箱中过夜。挑选蓝斑阳性克隆；

[0063] 5、冻融转化农杆菌

[0064] 将步骤4的阳性克隆扩大培养后提取质粒，加入农杆菌EHA105感受态中，冰浴30min后，液氮速冻5min，室温化冻，然后加入1mLYEB培养基，28℃培养3～4h后涂平板(同步骤4)，28℃黑暗培养2‑3天，PCR鉴定阳性农杆菌；

[0065] 6、将步骤5的阳性农杆菌EHA105侵染水稻野生株中花11号(ZH11)诱导产生的愈伤，得到基因突变水稻T0植株。具体步骤如下：

[0066] A、水稻愈伤的诱导

[0067] (1)、去除中花11号水稻野生株(ZH11)种子的壳，并保持水稻胚的完整；

[0068] (2)、用70％的乙醇处理去壳的种子1‑2分钟，轻轻摇晃多次，然后用灭菌的蒸馏水冲洗两次，再加入适量20％的漂渍液(每50ml加入一滴吐温20)，在恒温摇床上120rpm，22℃慢摇45‑60分钟，用灭菌蒸馏水轻柔冲洗10次左右，去除种子表面的漂渍液(该操作在超净工作台内完成)；

[0069] (3)、用高压灭菌的镊子将消毒完的种子均匀的放置在含有2mg/ml NB培养基平板表面(愈伤诱导培养基)；NB培养基配方如表2所示。

[0070] 表2水稻愈伤形成及农杆菌介导水稻转化中所用培养基的配方

[0071]

[0072]

[0073]

[0074] (4)、用封口膜将平板封口后，放置在密闭避光的纸箱25℃，诱导15天左右；

[0075] (5)、将愈伤从水稻小苗上剥离下来，在相同的诱导培养基上继代培养，直到获得活性较强浅黄色愈伤。

[0076] B、农杆菌的转化

[0077] (1)、挑取含有目标质粒的单克隆(即步骤5中的阳性农杆菌EHA105)接种于5ml液体细菌培养基，培养基中加入50μg/ml的利福平和50mg/L卡那霉素，在28℃，200rpm培养至OD600约0.5左右；

[0078] (2)、按1:100的比例加入至100ml含50μg/ml的利福平和50mg/L卡那霉素的细菌培养基中，在28℃，200rpm培养过夜，让农杆菌生长至OD600＝0.8‑1.0；

[0079] (3)、4000rpm，离心10分钟收集菌体，去上清，用同样体积的AAM培养基重悬菌体，然后在同样条件下离心，去上清；AAM培养基配方如表2所示；

[0080] (4)、用AAM培养基重悬菌体至OD600＝0.4左右，并转入新的灭菌的250ml三角瓶中；

[0081] (5)、选择淡黄色，不易碎的，直径约为5mm的胚性愈伤，将其浸入农杆菌菌液中，大约浸泡30分钟，偶尔轻柔晃动，使愈伤均匀接触菌液。

[0082] (6)、将侵染过的愈伤放在灭菌的滤纸上吸干残留的菌液，稍微晾干，将其均匀放置在已配制好的2N6‑AS固体平板表面，每个平板上大约放置25颗愈伤，用封口膜封口后置于25℃下暗培养2‑3天。在共培养时，要注意检查防止农杆菌的过度生长；2N6‑AS培养基配方如表2所示。

[0083] C、选择培养和植株的再生

[0084] (1)、将共培养完的愈伤转移新的灭菌250ml三角瓶中，用含有500mg/l头孢菌素和200mg/l羧苄青霉素的灭菌蒸馏水洗至少10次，每次用50‑75ml水，清洗时要轻微晃动三角瓶，最后加入100ml灭菌蒸馏水(含相同的抗生素)，25℃，120rpm慢摇两小时，倒去水，将愈伤转移至灭菌的滤纸上吸除多余的水分，稍微晾干；

[0085] (2)、转移愈伤至新的选择培养基中，培养基中加入250mg/l头孢菌素，250mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素，将培养皿置于避光的纸箱内，25℃培养三周，经常检查污染情况，应及时将同一培养皿中未污染的愈伤转移至新的培养基中；选择培养基配方如表3所示。

[0086] 表3农杆菌介导水稻转化中抗性愈伤选择及再生所用培养基的配方

[0087]

[0088]

[0089]

[0090] (3)、经2‑3周的选择培养，将抗性愈伤切下转移至新的固体的前再生培养基中，置于25℃，16h光照/8h黑暗条件下继续培养2‑3周；然后将愈伤转移到再生培养中平板上，让其再生成水稻小苗；前再生培养基和再生培养基配方如表3所示。

[0091] (4)、转移再生出小苗至新的MS培养基中，在25℃，16h光照/8h条件下培养，使小苗长至可以移栽的大小；MS培养基配方如表2所示。

[0092] (5)、移植约10cm高的小苗至盛有土壤的小盒中，转移至温室中正常生长，即得基因突变水稻T0植株的幼苗。

[0093] 7、基因突变水稻T0植株的打靶效果检测

[0094] 以上一步获得的基因突变水稻T0植株的DNA为模板，针对OsbZIP39基因第一外显子区域靶序列(位置如图1中的A所示)的SEQ ID NO.11(5'‑TCACCGAGTGCATCGATTTC‑3')和SEQ ID NO.12(5'‑ACTTCCTCCTCCGGTCTCC‑3')为引物，进行PCR扩增，扩增体系20μl(2x TaqMasterMix(Vazyme)10μl、SEQ ID NO.111μl、SEQ ID NO.121μl、DNA模板1μl、灭菌超纯水7μl)。PCR反应程序如下：95℃5min,30个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃5min。对扩增产物进行测序。

[0095] 经测序检测，本实施例获得的基因突变水稻T0植株可在OsbZIP39基因第一外显子靶点位置产生如图1中的B所示的缺失2个碱基的突变，命名为基因突变水稻osbzip39株系。

[0096] 实施例2基因突变水稻osbzip39株系对高浓度镉的抗性

[0097] 本实施例研究了基因突变水稻osbzip39株系对高浓度镉的抗性。

[0098] 将野生型ZH11种子和基因突变水稻osbzip39的种子表面消毒萌发后，用水稻营养液培养至两周龄幼苗，然后在水培液中添加300μM氯化镉继续水培5天，观察水稻幼苗的表型，结果如图2所示。

[0099] 从图2可以看出，相比野生型ZH11水稻幼苗，基因突变水稻osbzip39株系对高浓度的镉胁迫，表现出更强的抗性。

[0100] 实施例3基因突变水稻osbzip39株系对镉的转运能力

[0101] 本实施例研究了基因突变水稻osbzip39株系对镉的转运能力。

[0102] 将野生型ZH11种子和基因突变水稻osbzip39的种子表面消毒萌发后，用水稻营养液培养至两周龄幼苗，利用非损伤微测系统对野生型ZH11幼苗和基因突变水稻osbzip39幼苗的镉转运能力进行评估。其中，非损伤微测系统测定镉离子流速的具体步骤如下：

[0103] 1、用LIX载体，在装有镉离子LIX的试剂瓶中迅速蘸一下，使其尖端充满。

[0104] 2、取一支玻璃流速传感器，用电解液灌充注射器从后端注入电解液，产生10毫米液柱。

[0105] 3、将流速传感器尖端与LIX载体尖端在同一水平面上相对。由于毛细作用，LIX进入离子选择性流速传感器，通过推拉流速传感器压力调节装置调整LIX的长度至6‑10毫米，得到制作好的镉离子流速传感器。

[0106] 4、将配置好的镉离子校正液放置载物台上，开始校正镉离子流速传感器。

[0107] 5、截取两周大ZH11和osbzip39的主根根尖，测定其分生区部位5分钟内的镉离子流速。

[0108] 结果如3所示，从图3可知，相比野生型ZH11水稻幼苗，基因突变水稻osbzip39株系对镉的外排能力增强。

[0109] 实施例4基因突变水稻osbzip39株系中镉途径相关基因表达量

[0110] 本实施例研究了基因突变水稻osbzip39株系中镉途径相关基因表达量。

[0111] OsHMA3是定位在水稻根部液泡膜上的镉(Cd)转运蛋白，属于重金属ATP酶家族成2+
员，负责Cd 从根向地上部运输的速率(Sasaki et al.,2014)。OsCAL1主要在水稻根外皮层
2+
和木质部薄壁细胞表达，它通过促进Cd 分泌到细胞外间隙，从而降低水稻细胞中的Cd(Luo et al.,2018)。

[0112] 将野生型ZH11种子和基因突变水稻osbzip39的种子表面消毒萌发后，用水稻营养液培养至两周龄幼苗，然后在水培液中添加300μM氯化镉继续水培5天后，取样提取幼苗DNA，利用荧光定量PCR检测镉途径相关基因的表达。其中：

[0113] 检测OsHMA3基因的引物：

[0114] SEQ ID NO.13

[0115] 5'‑GGCCAGAGGAGCCTCAAATTC‑3'

[0116] SEQ ID NO.14

[0117] 5'‑AACTCTACTAGGCATGGCAGG‑3'

[0118] 检测OsCAL1基因的引物：

[0119] SEQ ID NO.15

[0120] 5'‑CGCAGAGCCACAGGTTCAA‑3'

[0121] SEQ ID NO.16

[0122] 5'‑GACCTTCTTGCAGAAGCACTTG‑3'

[0123] 荧光定量PCR扩增的扩增体系为10μl(2x  Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、模板DNA 0.5μl、灭菌超纯水3.5μl)。
PCR反应程序如下：95℃30s,40个循环：95℃5s，60℃30s。

[0124] 结果如图4所示。图4结果显示，水稻中与镉吸收转运相关基因OsHMA3在基因突变水稻osbzip39株系中表达下调，而与镉外排相关的基因OsCAL1在基因突变水稻osbzip39株系中表达上调，说明水稻OsbZIP39基因通过调节镉途径相关基因的表达参与水稻中镉的转运。

[0125] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0126] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。