融合RNA及其外泌体递送系统

摘要

本发明公开了融合RNA及其外泌体递送系统。本发明的融合RNA是经修饰的RNF112基因对应的mRNA。本发明还公开了所述融合RNA的编码核酸以及表达载体。将本发明的所述融合RNA导入外泌体或导入可产生外泌体的细胞中可获得装载所述融合RNA的外泌体。本发明制备的外泌体可作为目的基因mRNA的递送系统将其导入靶细胞或靶组织中，从而治疗相关疾病。

权利要求

1.一种融合RNA，所述融合RNA的序列包括RNA结合蛋白的RNA识别序列以及SEQ ID NO.1所示的RNA序列；RNA结合蛋白的RNA识别序列连接于SEQ ID NO.1所示的RNA序列的3’端。

2.根据权利要求1所述的融合RNA，其特征在于，所述RNA结合蛋白包括L7AE、MS2、TAT。

3. 根据权利要求2所述的融合RNA，其特征在于，所述L7AE的RNA识别序列为SEQ ID NO.5所示的序列。

4.编码权利要求1‑3中任一项所述的融合RNA的核酸分子。

5.包含权利要求4所述的核酸分子的载体。

6.一种RNA递送系统，所述RNA递送系统包括权利要求5所述的载体、表达外泌体蛋白和RNA结合蛋白的载体。

7.根据权利要求6所述的RNA递送系统，其特征在于，所述RNA结合蛋白连接于外泌体蛋白的C端。

8.根据权利要求6或7所述的RNA递送系统，其特征在于，所述外泌体蛋白是Lamp2b。

9.根据权利要求6或7所述的RNA递送系统，其特征在于，所述RNA结合蛋白包括L7AE、MS2、TAT。

10.根据权利要求6所述的RNA递送系统，其特征在于，所述表达外泌体蛋白和RNA结合蛋白的载体还表达靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞。

11.根据权利要求10所述的RNA递送系统，其特征在于，所述靶向分子包括与细胞膜表面抗原相互作用的靶向肽、识别特定细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段、亲合体。

12.根据权利要求6所述的RNA递送系统，其特征在于，所述RNA递送系统还包括促进外泌体生产或分泌的载体。

13.根据权利要求12所述的RNA递送系统，其特征在于，所述载体表达STEAP、syndevan‑

4和NadB。

14.一种外泌体，所述外泌体包括权利要求1‑3中任一项所述的融合RNA。

15.根据权利要求14所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体还包括靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞。

16.根据权利要求15所述的外泌体，其特征在于，所述靶向分子包括靶向肽、抗体或其抗原结合片段、亲合体。

17.权利要求14‑16中任一项所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下任一项：

1）将权利要求1‑3中任一项所述的融合RNA、权利要求4所述的核酸分子导入外泌体中；

2）将权利要求6‑13中任一项所述的RNA递送系统导入产生外泌体的细胞中；培养所述细胞产生外泌体。

18.一种分离的体细胞，所述分离的体细胞为以下任一项：

1）产生并分泌权利要求14‑16中任一项所述的外泌体；

2）导入了权利要求6‑13中任一项所述的RNA递送系统。

19.权利要求18所述的分离的体细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将权利要求6‑13中任一项所述的RNA递送系统引入到产生外泌体的体外培养的细胞中。

20.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求14‑16中任一项所述的外泌体、权利要求18所述的分离的体细胞。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

22.一种应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项：

1）权利要求1‑3中任一项所述的融合RNA、权利要求4所述的核酸分子在制备装载外源RNA的外泌体中的应用，所述装载为体外装载；

2）权利要求5所述的载体、权利要求6‑13中任一项所述的RNA递送系统在制备装载外源RNA的外泌体中的应用，所述装载为体外装载；

3）权利要求18所述的分离的体细胞在制备装载外源RNA的外泌体中的应用，所述装载为体外装载；

4）权利要求1‑3中任一项所述的融合RNA、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6‑13中任一项所述的RNA递送系统、权利要求14‑16中任一项所述的外泌体或权利要求18所述的分离的体细胞在制备治疗ALS的药物中的应用。

说明书

融合RNA及其外泌体递送系统

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及融合RNA及其外泌体递送系统。

背景技术

[0002] 外泌体(exosomes)是由细胞分泌的直径为30～150nm的囊泡，细胞质膜凹陷形成的细胞内小泡，具有与细胞膜相同的膜结构，可以携带诸如RNA、蛋白质等大量成分，与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系。因其特殊的结构，相较人工合成的药物载体，外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在外泌体的膜结构与细胞膜相同，可以提高药物进入细胞的效率，甚至可以透过血脑屏障，同时外泌体引起的有害免疫反应极低，有很好的渗透滞留(EPR)效应从而具有缓释效果等。目前已经尝试用外泌体携带miRNA、siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。但是如何将mRNA递送至外泌体从而产生携带RNA的外泌体是本申请需要解决的问题。

发明内容

[0003] 为了克服现有技术缺陷，本发明的目的在于提供一种RNA递送系统，所述递送系统能够将目的RNA序列导入外泌体。

[0004] 为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种融合RNA，所述融合RNA的序列包括RNA结合蛋白的RNA结合基序以及SEQ ID NO.1所示的RNA序列；RNA结合蛋白的RNA结合基序连接于SEQ ID NO.1所示的RNA序列的3’端；

[0006] 进一步，所述RNA结合蛋白包括但不限于L7AE、MS2、TAT、MS2等；

[0007] 进一步，所述L7AE的RNA结合基序包括SEQ ID NO.5所示的序列。

[0008] L7AE蛋白的RNA结合序列(识别序列)：

[0009] GGCCAGAGTGGGGGGCGTGATGCGAAAGCTGACCCACTCTGGCC(SEQ ID NO.5)。

[0010] 本发明还提供了编码前面所述的融合RNA的核酸分子。

[0011] 术语“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指线性或环状构型以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不应解释为对聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如硫代磷酸酯骨架)中修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。

[0012] 本发明还提供了包含前面所述的核酸分子的载体。

[0013] “载体”是指能够指导目的基因表达并可以转移基因序列到靶细胞的任何核酸构建体。该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

[0014] 可用于本发明的载体包括非病毒载体和病毒载体。非病毒载体包括DNA或RNA质粒，DNA MC，裸核酸以及与诸如脂质体，纳米颗粒或泊洛沙姆的递送运载体复合的核酸。病毒载体包括但不限于逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关病毒，牛痘和单纯疱疹病毒载体。

[0015] 本发明提供了一种RNA递送系统，所述RNA递送系统包括前面所述的载体、表达外泌体蛋白和RNA结合蛋白的载体。

[0016] 优选地，所述RNA结合蛋白连接于外泌体蛋白的C端；

[0017] 进一步，所述外泌体蛋白包括外泌体跨膜蛋白、外泌体表面蛋白。

[0018] 可用于本发明的外泌体蛋白可以包括但不限于：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、Syntenin‑1、Syntenin‑2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan‑1、syndecan‑2、syndecan‑3、syndecan‑4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC‑I或MHC‑II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA‑DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA‑1、LGALS3BP、Mac‑1α、Mac‑1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何组合组成的组。

[0019] 在本发明的具体实施方案中，所述外泌体膜蛋白是Lamp2b。

[0020] 进一步，所述表达外泌体蛋白和RNA结合蛋白的载体还表达靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞。

[0021] 优选地，所述靶向分子包括能够与细胞膜表面抗原相互作用的靶向肽、识别特定细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段、亲合体。

[0022] 细胞膜表面抗原包括但不限于ER、PR、P53、EGFR、IGFR、Her2、CD20、CD25、CD117、CD34、CD138、CD33、VEGFR、BCMA、Mesothelin、CEA、PSCA、MUC1、EpCAM、S100、CD22、CD19、CD70、CD30、ALK、RANK、GPC2、GPC3、Her3、EGFRvIII、GD2、PD‑L1、PD‑L2。

[0023] 作为靶向分子的实施例，所述靶向分子包括但不限于：GE11、T7、RVG，识别CD19的单链抗体、识别BCMA的单链抗体。

[0024] 进一步，所述RNA递送系统还包括促进外泌体生产或分泌的载体。

[0025] 更进一步，所述载体表达STEAP、syndevan‑4和NadB。

[0026] 本发明还提供了一种外泌体，所述外泌体包括前面所述的融合RNA。

[0027] 进一步，所述外泌体还包括靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞。

[0028] 进一步，所述靶向分子的限定同前。

[0029] 本发明还提供了前面所述的外泌体的制备方法，所述制备方法包括以下任一项：

[0030] 1)将前面所述的融合RNA、前面所述的核酸分子导入外泌体中；

[0031] 2)将前面所述的RNA递送系统导入产生外泌体的细胞中；培养所述细胞产生外泌体。

[0032] 本发明还提供了一种细胞，所述细胞为以下任一项：

[0033] 1)产生并分泌前面所述的外泌体；

[0034] 2)导入了前面所述的RNA递送系统。

[0035] 本发明还提供了前面所述的细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将前面所述的RNA递送系统引入到产生外泌体的细胞中。

[0036] 本发明细胞或后续提到的能够分泌外泌体的细胞包括但不限于原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物的细胞、或基本上任何其它类型的细胞来源。本发明的细胞包括体内产生外泌体的细胞。根据本发明的细胞可以选自广泛范围的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质(Wharton'sjelly)、围产期组织、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞且更具体地说是任选地表达各种早期标记物的羊膜上皮细胞、骨髓抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别关注的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系例如微血管内皮细胞或淋巴内皮细胞、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘获得的任何细胞、气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC)也在本发明的范围内，并且基本上能够产生细胞外囊泡的任何类型的细胞也包括在本文中。通常，外泌体基本上可以源自任何细胞来源，无论是原始细胞来源还是永生化细胞系。外泌体细胞可以是任何胚胎的、胎儿的和成年的体干细胞类型，包括诱导多能干细胞(iPSC)和通过任何方法衍生的其它干细胞。当治疗神经系统疾病时，可以考虑利用例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。对于待治疗的患者而言，细胞本质上可以是同种异体的、自体的、甚至异种的，即细胞可以来自患者本人或者来自无关的、匹配的或不匹配的供体。

[0037] 将外源性核酸分子引入外泌体或细胞的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)，电穿孔，直接注射，生物射弹，细胞融合，粒子轰击，磷酸钙共沉淀，DEAE‑葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。使用例如Sonitron 2000系统(Rich‑Mar)的超声操作也可以用于外源性核酸的递送。另外的示例性核酸递送系统包括由AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)，Maxcyte公司(Rockville，Maryland)，BTX分子递送系统(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics公司提供的那些(参见例如US6008336)。

[0038] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的外泌体、前面所述的细胞。

[0039] 进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

[0040] 术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成明显刺激并且不会消除组合物中所施用的细胞外囊泡的生物学活性和性质的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可以增强或稳定组合物，或者可以用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可以包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以选择载体以最小化受试者的不良副作用和/或最小化一种或多种活性成分的降解。这些配制品中的任何一种中也可以包含佐剂。

[0041] 术语“药学上可接受的赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。肠胃外施用的配制品可以例如含有赋形剂如无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物颗粒和表面活性剂(包括例如聚山梨酯20)。

[0042] 本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。给予的途径和/或方式可以根据所期望的结果而变化。在一些实施例中，施用是玻璃体内、静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施例中，包含至少一种外泌体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物可以处于适于肠胃外施用的形式。在一些实施例中，药物组合物可以是无菌可注射的水性或悬浮液的形式，其可以根据已知程序进行配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的缓冲液中的无菌可注射悬浮液。

[0043] 本发明还提供了一种应用，所述应用包括以下任一项：

[0044] 1)前面所述的融合RNA、前面所述的核酸分子在制备装载外源RNA的外泌体中的应用；

[0045] 2)前面所述的载体、前面所述的RNA递送系统在制备装载外源RNA的外泌体中的应用；

[0046] 3)前面所述的细胞在制备装载外源RNA的外泌体中的应用；

[0047] 4)前面所述的融合RNA、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的RNA递送系统、前面所述的外泌体或前面所述的细胞在制备治疗ALS的药物中的应用。

[0048] 本发明还提供了一种治疗或预防ALS的方法，所述方法包括将前面所述的外泌体或细胞给有需要的受试者施用。

[0049] 术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物，例如人类患者和非人类灵长类动物，以及实验动物，例如兔子，狗，猫，大鼠，小鼠和其他动物。因此，本文所用的术语“受试者”或“患者”是指可以对其施用本发明表达盒的任何哺乳动物患者或受试者。本发明的受试者包括患有疾病的受试者。

[0050] 如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻症状的严重性和/或频率，消除症状和/或根本原因，预防症状和/或其根本原因的发生，以及改善或补救损害。癌症和移植物抗宿主疾病是可以使用本文所述的组合物和方法治疗的病况的非限制性实例。因此，“治疗”和“治疗”包括：

[0051] (i)防止疾病或病况在哺乳动物中发生，特别是当这种哺乳动物易患该病况但尚未被诊断为患有该疾病或病况时；

[0052] (ii)抑制疾病或病况，即阻止其发展；

[0053] (iii)减轻疾病或病况，即导致疾病或病况消退；和/或

[0054] (iv)缓解或消除由疾病或病况引起的症状，即缓解疼痛并且处理或不处理潜在疾病或病况。

附图说明

[0055] 图1显示pLenti‑EF1α‑GFP‑L7AE(C/Dbox)Neo载体结构示意图；

[0056] 图2显示pLenti‑EF1α‑RVG‑Lamp2b‑L7Ae载体结构示意图；

[0057] 图3显示激光共聚焦显微镜的细胞荧光图。

具体实施方式

[0058] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0059] 实验例1构建相关载体

[0060] 1、实验材料

[0061] 293FT细胞(ATCC，CRL‑3249)，DMEM培养基(Hyclone，SH30022.01)，FBS(CellMax Fetal Bovine Serum，SA101.02)，常规载体pRSV‑Rev(Plasmid#12253)、pMDLg/pRRE(Plasmid#12251)、pMD2.G(Plasmid#12259)、pLenti‑EF1α‑GFP‑L7AE(C/Dbox)Neo(如图1所示)。

[0062] pLenti‑EF1α‑GFP‑L7AE(C/Dbox)Neo全序列如SEQ ID NO.6所示。

[0063] 2、实验方法

[0064] 1)表达经修饰的RNF112基因的重组载体构建

[0065] 将目的基因序列(经修饰的RNF112基因，pep RNF112，核酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2)通过BsiWI、XbaI酶切位点连入Plenti‑EF1α‑GFP‑L7AE(C/Dbox)Neo载体中。

[0066] 2)pLenti‑EF1α‑RVG‑Lamp2b‑L7Ae载体构建

[0067] pLenti‑EF1α‑RVG‑Lamp2b‑L7Ae载体全序列如SEQ ID NO.3所示(图2)。

[0068] 实施例2构建产生外泌体的工程细胞株以及分离外泌体

[0069] 1、利用pLenti‑EF1α‑RVG‑Lamp2b‑L7Ae载体包装慢病毒，感染HEK293T细胞株，并使用G418筛选，获得稳转细胞株，命名为293T‑RVG‑Lamp2b‑L7Ae；

[0070] 2、以pLenti‑EF1α‑pepRNF112‑L7AE(C/Dbox)Neo载体包装慢病毒并感染步骤1制备好的293T‑RVG‑Lamp2b‑L7Ae细胞株，重复感染3次，并使用puromycin筛选获得稳转细胞株；

[0071] 3、将步骤2获得的细胞株在T175培养瓶中扩增培养，收集上清，0.45μm滤膜过滤后，加入外泌体分离试剂4℃过夜，隔天10000g，1h离心，离心后弃去上清，用400μl DPBS重悬后置于‑80℃储藏。

[0072] 实施例3外泌体侵染293T‑TDP43‑EGFP细胞模型

[0073] 1、构建293T‑TDP43‑EGFP细胞模型

[0074] 1)包装TDP43‑EGFP慢病毒

[0075] 合成TDP43‑EGFP核酸序列后经BsiWI、PflFI酶切位点连入pLenti‑EF1a载体。TDP43‑EGFP核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0076] 慢病毒包装流程：

[0077] 通过胰酶消化收集293T细胞，用适当的完全培养基平铺细胞于10cm培养皿上(根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80％以上)。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8‑24h，当细胞贴壁完全后即可开始转染；

[0078] 混匀核心质粒和包装质粒：取无菌1.5ml EP管，加入400μl Opti‑MEM培养基，加入10μg核心质粒和15μg病毒包装质粒(包含PMD2G、VSVG、REV)，及75μl PEI转染试剂，充分混匀，静置15‑20min；

[0079] 孵育：将这400μl的混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO2的37℃温箱孵育；

[0080] 收取病毒上清：6‑10h后吸去培养基，加入10ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，40h左右可以收集含慢病毒的上清，经45μm滤膜过滤后，可用于感染或者分装后置于－80℃储存待用。

[0081] 2)使用步骤1)中慢病毒感染293T细胞，并使用puromycin进行筛选；

[0082] 3)步骤2)中细胞挑取单克隆培养作为细胞模型。

[0083] 2、使用实施例2收集到的外泌体侵染293T‑TDP43‑EGFP细胞，连续侵染数次；

[0084] 3、使用激光共聚焦显微镜观察293T‑TDP43‑EGFP细胞胞质荧光变化。

[0085] 4、结果

[0086] 如图3所示，对照组(ctrl)为293T细胞表达TDP43‑EGFP融合蛋白的单克隆细胞株，标记为293T‑EGFP，对照组左侧为PI染色，标记细胞核，右侧为EGFP成像，绿色为TDP43‑EGFP融合蛋白在细胞内的分布情况，EV‑HSP组为293T‑TDP43‑EGFP侵染携带经修饰的RNF112基因mRNA的外泌体，同样左侧为PI染色细胞核，右侧为TDP‑EGFP分布。显然可见，实验组较对照组，其细胞质中TDP‑EGFP蛋白积聚明显降低，说明外泌体递送经修饰的RNF112基因mRNA可减少细胞模型的细胞质中TDP43蛋白积聚。