鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探针及其应用

摘要

本发明提供了一种鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探针及其应用。本发明的引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的引物和如SEQ ID NO.2所示序列的引物。本发明的探针包括如SEQ ID NO.5所示序列的探针。本发明的探针进一步包括如SEQ ID NO.6所示序列的探针。利用本发明的引物和探针，可通过PCR方法将新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系与其它毒株鉴别区分开。

权利要求

1.一种用于双重探针qPCR方法鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物和探针的组合物，其特征在于，该组合物包括两组分别用于双重探针qPCR方法的引物和探针的组合物，其中一组包括如SEQ ID NO.1所示序列的引物和如SEQ ID NO.2所示序列的引物以及如SEQ ID NO.5所示序列的探针和如SEQ ID NO.7所示序列的探针，用于鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系；另一组包括如SEQ ID NO.3所示序列的引物和如SEQ ID NO.4所示序列的引物以及如SEQ ID NO.6所示序列的探针和如SEQ ID NO.8所示序列的探针，用于将新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系阳性样品中的新型冠状病毒Omicron株BA.1与BA.3亚系鉴别区分开：SEQ ID NO.1：5’‑GTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATG‑3’；

SEQ ID NO.2：5’‑CTCTGAACTCACTTTCCATCC‑3’；

SEQ ID NO.3：5’‑TAAAATATATTCTAAGCACACGCC‑3’；

SEQ ID NO.4：5’‑CTACCAATGGTTCTAAAGCC‑3’；

SEQ ID NO.5：5’‑CCATTTTTGGACCACAAAAAC‑3’；

SEQ ID NO.6：5’‑GCGTGAGCCAGAAGATCTCC‑3’；

SEQ ID NO.7：5’‑CATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAAC‑3’；

SEQ ID NO.8：5’‑GTGCGTGATCTCCCTCAG‑3’。

2.根据权利要求1所述的用于双重探针qPCR方法鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物和探针的组合物，其特征在于，所述探针是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：探针序列5’端碱基采用荧光报告基团修饰，同时探针序列3’端碱基采用荧光淬灭基团修饰。

3.一种用于双重探针qPCR方法鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：权利要求1或2所述的引物和探针的组合物；

所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

4.一种非诊断目的的权利要求1或2所述的引物和探针的组合物或权利要求3所述的试剂盒在体外双重探针qPCR方法鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的应用，其中，如SEQ ID NO.1所示序列的引物和如SEQ ID NO.2所示序列的引物以及如SEQ ID NO.5所示序列的探针和如SEQ ID NO.7所示序列的探针用于鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系；如SEQ ID NO.3所示序列的引物和如SEQ ID NO.4所示序列的引物以及如SEQ ID NO.6所示序列的探针和如SEQ ID NO.8所示序列的探针用于将新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系阳性样品中的新型冠状病毒Omicron株BA.1与BA.3亚系鉴别区分开。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过PCR反应鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系，所述引物在PCR反应体系中的终浓度为0.1‑10μM，所述探针在PCR反应体系中的终浓度为0.1‑10μM。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，

其中如SEQ ID NO.5所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1或BA.3亚系阳性；其中如SEQ ID NO.6所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系阳性；或者，其中如SEQ ID NO.5所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，且如SEQ ID NO.6所示序列的探针的扩增曲线为非S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.3亚系阳性。

说明书

鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探

针及其应用

技术领域

[0001] 本发明是关于一种鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探针及其应用，更具体地说是关于一种鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探针、试剂盒和检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

[0002] 新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）感染可引起呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，严重者可导致新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）。随着新型冠状病毒在人群中的传播，病毒基因组发生了许多突变，其中发生在保护性抗原S蛋白关键氨基酸位点的突变，可能导致病毒的传播能力和致病性增强，并且降低现有疫苗的保护效果。同其他新冠毒株相比，Omicron变异株的传染性和传播能力显著增强。Omicron株有三个亚系，分别是BA.1、BA.2和BA.3，3种亚系的流行性和致病性不同。快速、准确地鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系具有重要意义。

发明内容

[0003] 本发明的一个目的在于提供一种用于鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物。

[0004] 本发明的另一目的在于提供一种用于鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的探针。

[0005] 本发明的另一目的在于提供一种用于鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的试剂盒。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述引物、探针或试剂盒用于鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的相关应用。

[0007] 一方面，本发明提供了鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的引物和如SEQ ID NO.2所示序列的引物：

[0008] SEQ ID NO.1：5’‑GTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATG‑3’；

[0009] SEQ ID NO.2：5’‑CTCTGAACTCACTTTCCATCC‑3’。

[0010] 根据本发明的具体实施方案，本发明所述引物进一步还可包括如SEQ ID NO.3所示序列的引物和如SEQ ID NO.4所示序列的引物：

[0011] SEQ ID NO.3：5’‑TAAAATATATTCTAAGCACACGCC‑3’；

[0012] SEQ ID NO.4：5’‑CTACCAATGGTTCTAAAGCC‑3’。

[0013] 本发明的鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物是针对新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系S蛋白而设计。相比于原型株，新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系的突变位点有：A67V，△69‑70，T95I，△142‑144，Y145D，N211‑，L212I，G339D，S371L，S373P，S375F，K417N，N440K，G446S，S447N，T478K，E484A，Q493R，G496S，Q498R，N501Y，Y505H，T547K，D614G，H655Y，N679K，P681H，N764K，D796Y，N856K，Q954H，N969K，L981F。其中Δ142‑144和Y145D突变位点是BA.1和BA.3亚系具有的突变位点，N211‑和L212I突变位点是BA.1亚系特有的突变位点。具体而言，本发明的鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物是基于Δ142‑144和Y145D和N211‑和L212I突变位点而设计。

[0014] 另一方面，本发明还提供了一种鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的探针，所述探针包括：

[0015] 如SEQ ID NO.5所示序列的探针：

[0016] SEQ ID NO.5：5’‑CCATTTTTGGACCACAAAAAC‑3’。

[0017] 根据本发明的具体实施方案，本发明所述探针进一步还可包括：

[0018] 如SEQ ID NO.6所示序列的探针：

[0019] SEQ ID NO.6：5’‑GCGTGAGCCAGAAGATCTCC‑3’。

[0020] 根据本发明的具体实施方案，其中，本发明所述探针还可包括如SEQ ID NO.7所示序列的探针和/或如SEQ ID NO.8所示序列的探针：

[0021] SEQ ID NO.7：5’‑CATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAAC‑3’。

[0022] SEQ ID NO.8：5’‑GTGCGTGATCTCCCTCAG‑3’。

[0023] 如SEQ ID NO.5所示序列的探针是基于新型冠状病毒Omicron株BA.1和BA.3亚系S基因Δ142‑144和Y145D突变位点设计的新型冠状病毒Omicron株BA.1和BA.3亚系共用探针。如SEQ ID NO.6所示序列的探针是基于新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系S基因N211‑和L212I突变位点设计的探针。如SEQ ID NO.7所示序列的探针是针对除Omicron株BA.1和BA.3亚系外其他新型冠状病毒设计的探针。如SEQ ID NO.8所示序列的探针是针对除Omicron株BA.1亚系外其他新型冠状病毒设计的探针。

[0024] 根据本发明的具体实施方案，所述探针可以是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：

[0025] 探针序列5’端碱基采用荧光报告基团修饰，同时探针序列3’端碱基采用荧光淬灭基团修饰。

[0026] 根据本发明的具体实施方案，如SEQ ID NO.7所示序列的探针的荧光报告基团与如SEQ ID NO.5所示序列的探针的荧光报告基团不同。如SEQ ID NO.8所示序列的探针的荧光报告基团与如SEQ ID NO.6所示序列的探针的荧光报告基团不同。

[0027] 根据本发明的具体实施方案，新型冠状病毒Omicron株BA.1和BA.3亚系共用探针（如SEQ ID NO.5所示序列的探针）序列5’端碱基采用荧光报告基团CY5修饰，探针序列3’端碱基用荧光淬灭基团修饰。除Omicron株BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒探针（如SEQ ID NO.7所示序列的探针）序列5’端碱基采用荧光报告基团VIC修饰，探针序列3’端碱基用荧光淬灭基团修饰。

[0028] 根据本发明的具体实施方案，新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系探针（如SEQ ID NO.6所示序列的探针）序列5’端碱基采用荧光报告基团CY5修饰，探针序列3’端碱基用荧光淬灭基团修饰。除BA.1亚系外其它新型冠状病毒探针（如SEQ ID NO.8所示序列的探针）序列5’端碱基采用荧光报告基团FAM修饰，探针序列3’端碱基用荧光淬灭基团修饰。

[0029] 另一方面，本发明还提供了一种鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的试剂盒，其包含：本发明所述的引物，和/或本发明所述的探针。

[0030] 根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒，其中还可包括PCR反应试剂和/或反应缓冲液。

[0031] 根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒，其中还包括阳性质控品和阴性质控品。优选地，所述阳性质控品包括新型冠状病毒Omicron株BA.1和BA.3亚系S基因标准质粒共用模板，所述阴性质控品包括除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒S基因标准质粒模板。

[0032] 根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒中，所述阳性质控品还可包括仅针对新型冠状病毒Omicron株BA.1和BA.3亚系S基因的标准质粒模板，所述阴性质控品还可包括除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒S基因标准质粒模板。

[0033] 另一方面，本发明还提供了所述的引物或所述的探针或所述的试剂盒在体外鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的应用。即，本发明还提供了一种体外鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的方法。

[0034] 根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，通过PCR反应鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系，所述引物在PCR反应体系中的终浓度为0.1‑10μM，所述探针在PCR反应体系中的终浓度为0.1‑10μM。

[0035] 根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，所述PCR可以为单重PCR、双重PCR、多重PCR、数字PCR或RT‑PCR。

[0036] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明的应用中，采用如SEQ ID NO.1所示序列的引物和如SEQ ID NO.2所示序列的引物、如SEQ ID NO.5所示序列的探针和如SEQ ID NO.7所示序列的探针鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系。如SEQ ID NO.5所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，可鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系阳性。进一步地，采用如SEQ ID NO.3所示序列的引物和如SEQ ID NO.4所示序列的引物、如SEQ ID NO.6所示序列的探针和如SEQ ID NO.8所示序列的探针，可将新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系阳性样品中的新型冠状病毒Omicron株BA.1与BA.3亚系鉴别区分开。所述两次PCR反应无先后顺序。

[0037] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明的应用中，所述应用是用于鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1或BA.3亚系，所述探针包括如SEQ ID NO.5所示序列的探针和如SEQ ID NO.6所示序列的探针；

[0038] 其中如SEQ ID NO.5所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1或BA.3亚系阳性；其中如SEQ ID NO.6所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系阳性；或者，

[0039] 其中如SEQ ID NO.5所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1或BA.3亚系阳性；其中如SEQ ID NO.6所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系阳性；其中如SEQ ID NO.5所示序列的探针的扩增曲线为S型曲线，且如SEQ ID NO.6所示序列的探针的扩增曲线为非S型曲线，可鉴定为新型冠状病毒Omicron株BA.3亚系阳性。

[0040] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明的鉴别应用方法包括以下步骤：

[0041] S1：提取待测样品RNA，将RNA反转录成cDNA；

[0042] S2：配制反应体系：将0.1‑10μM范围内的任何一个浓度的上游引物、下游引物和探针加入到体系中，加入1pg‑1μg范围内的任何一个浓度的样本cDNA，加入商业化qPCR预混酶，最后用ddH2O调节反应体系总体积到10‑20μl范围内的任何一个体积；

[0043] S3：设定反应条件：根据所使用qPCR预混酶设定反应条件；

[0044] S4：结果分析：根据Omicron株BA.1和BA.3亚系扩增通道、BA.1亚系扩增通道、除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒扩增通道、除BA.1亚系外其它新型冠状病毒扩增通道进行分析并记录结果。

[0045] 本发明针对Omicron株BA.1和BA.3亚系S蛋白Δ142‑144和Y145D位点及除BA.1和BA.3亚系外其他新型冠状病毒的对应区域设计了不同的探针；以及针对BA.1亚系S基因N211‑和L212I突变位点及除Omicron株BA.1亚系外其他新型冠状病毒设计了不同的探针。通过不同的荧光通道观察Omicron株BA.1和/或BA.3亚系、或除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒、或BA.1亚系、或除BA.1亚系外其它新型冠状病毒的扩增结果。扩增结果中扩增曲线为典型的“S型”曲线，则为阳性结果；扩增结果中扩增曲线不是典型的“S型”曲线，则为阴性结果。

[0046] 在本发明的一些具体实施方案中，当所测样品的Omicron株BA.1和BA.3亚系扩增通道的扩增曲线为典型的“S型”曲线，且同时BA.1亚系通道的扩增曲线不是典型的“S型”曲线时，所测样品为BA.3亚系。

[0047] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明分别选取BA.1和BA.3亚系或除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒S蛋白中的一段基因序列合成质粒作为标准品，验证了本发明的双重探针qPCR方法的线性、检测限和专属性（特异性）。由qPCR方法的专属性（特异性）验证实验可以看出，本发明提供的鉴别方法具有较好的线性，检测限为0.03pg/μl，能够有效地对Omicron株BA.1和/或BA.3亚系和除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒进行鉴别。

[0048] 本发明技术方案带来的有益效果：

[0049] 本发明具有成本低、操作简便、对仪器设备要求低、检测周期短、结果准确可靠的优点。本发明所述的鉴别应用可以为非诊断目的，或是诊断目的。非诊断目的的应用例如可包括应用于新型冠状灭活疫苗生产中对毒种的快速鉴别，同时适用于对灭活后的新型冠状病毒原液的鉴别。此外，本发明可应用于新型冠状病毒核酸筛查过程中对Omicron株BA.1和/或BA.3亚系和其它新型冠状毒株的鉴别，待鉴别的样品可以是来自人或动物的离体样品，也可以是来自非宿主的环境样品。本发明可快速、准确地将新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系与其它新型冠状病毒鉴别区分开。本发明的推广使用将会给疫苗生产过程中的检测人员、科研工作者以及医务工作者节约大量时间和经费。

附图说明

[0050] 图1为本鉴别Omicron株BA.1和/或BA.3亚系发明的引物和探针的实验设计方案示意图。

[0051] 图2为利用鉴别Omicron株BA.1和/或BA.3亚系发明的引物和探针进行PCR反应的Omicron株BA.1和BA.3亚系共用扩增通道的标准曲线。

[0052] 图3为利用鉴别Omicron株BA.1和/或BA.3亚系发明的引物和探针进行PCR反应的除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒扩增通道的标准曲线。

[0053] 图4显示利用鉴别Omicron株BA.1和/或BA.3亚系发明的引物和探针进行双重探针qPCR方法的专属性（特异性）验证实验结果。

[0054] 图5显示利用鉴别Omicron株BA.1和/或BA.3亚系发明的引物和探针进行双重探针qPCR方法对灭活后Omicron株BA.1亚系病毒原液的检测情况。

[0055] 图6显示鉴别Omicron株BA.1亚系发明的引物和探针的实验设计方案示意图。

[0056] 图7为利用鉴别Omicron株BA.1亚系发明的引物和探针进行PCR反应的Omicron株BA.1亚系扩增通道的标准曲线。

[0057] 图8为利用鉴别Omicron株BA.1亚系发明的引物和探针进行PCR反应的BA.1亚系外其它新型冠状病毒扩增通道的标准曲线。

[0058] 图9显示利用鉴别Omicron株BA.1亚系发明的引物和探针进行双重探针qPCR方法的专属性（特异性）验证实验结果。

[0059] 图10显示利用鉴别Omicron株BA.1亚系发明的引物和探针进行双重探针qPCR方法对灭活后Omicron株BA.1亚系病毒原液的检测情况。

具体实施方式

[0060] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。本发明对试实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。未详细注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。

[0061] 实施例1

[0062] 本实施例提供鉴别SARS‑CoV‑2除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒和Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的方法。所述的引物和探针、荧光标记的设计方案如图1所示。

[0063] 实验样品：待测样品cDNA、Omicron株BA.1和BA.3亚系S基因标准质粒共用模板（SEQ ID NO.9）、除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒S基因标准质粒模板（SEQ ID NO.10）。

[0064] 待测样品cDNA的获得：分别取200μl新型冠状病毒原型株、Omicron BA.1亚系毒株、Delta毒株、Beta毒株的细胞培养物，用商业化的RNA试剂盒提取RNA，并用商业化的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，提取后的RNA和cDNA可保存于‑60℃冰箱，使用前避免反复冻融。

[0065] 标准质粒的获得：Omicron株BA.1和BA.3亚系S基因标准质粒共用模板（SEQ ID NO.9）、除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒S基因标准质粒模板（SEQ ID NO.10）直接由擎科生物合成。标准质粒的序列如下：

[0066] SEQ ID NO.9：

[0067] ttaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgttatctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccattgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttggaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattatagtgcgtgagccagaagatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttgatgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataatctcgcaccatttttcacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaatattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaagcttgattctaaggttagtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtaacaaaccttgtaatggtgttgcaggttttaattgttactttcctttacgatcatatagtttccgacccacttatggtgttggtcaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaaaaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaatatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaagtctcatcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgctt；

[0068] SEQ ID NO.10：

[0069] TTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATT。

[0070] qPCR扩增：反应体系和反应条件见表1，其中反应体系中，上游引物、下游引物和探针的加入量可以是0.1‑10μM范围内的任何一个浓度，总的反应体系范围可以是10‑20μl范围内的任何一个体积，样本cDNA的加入量可以是1pg‑1μg范围内的任何一个浓度。本次所使用的qPCR预混酶为全式金生物公司的PerfectStart® II Probe qPCR SuperMix（货号：AQ711），其中退火温度可选择52‑60℃范围内的任何一个温度。

[0071] 上游引物（142/145‑F）的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物（142/145‑R）的序列如SEQ ID NO.2所示；Omicron株BA.1和/或BA.3亚系探针（142/145‑P‑Omicron株BA.1和/或BA.3亚系）的序列如SEQ ID NO.5所示；除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒探针（142/145‑P‑其它新型冠状病毒）的序列如SEQ ID NO.7所示。

[0072] SEQ ID NO.1（142/145‑F）：GTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATG；

[0073] SEQ ID NO.2（142/145‑R）：CTCTGAACTCACTTTCCATCC；

[0074] SEQ ID NO.5（142/145‑P‑Omicron株BA.1和BA.3亚系）：CCATTTTTGGACCACAAAAAC；

[0075] S E Q  I D  N O .7（1 4 2 / 1 4 5 ‑ P ‑ 其 它 新 型 冠 状 病 毒）：CATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAAC。

[0076] 表1. 反应体系和反应条件

[0077]

[0078] 结果分析：以Roche480仪器为例，实验结束后设置每个检测孔的样品类型（未知样本，标准品，阴性对照或阳性对照），其中标准品需设定浓度。打开分析界面，选择探针所使2
用的荧光通道，根据扩增图像，调整Noise band值，以确保生成的标准曲线的扩增效率、R值和斜率均在合格范围内。本发明为双重探针qPCR方法，在一次反应中分别对Omicron株BA.1和/或BA.3亚系扩增通道和除BA.1和BA.3亚系外其它新型冠状病毒扩增通道进行分析并记录结果。

[0079] 结果判定：扩增结果中扩增曲线为典型的“S型”曲线，则为阳性结果；扩增结果中扩增曲线不是典型的“S型”曲线，则为阴性结果。具体结果判读方法见表2。

[0080] 表2. 结果判定

[0081]

[0082] 将待检样本加入反应体系中进行上机检测，检测结果中若CY5通道出现阳性扩增而VIC通道未出现阳性扩增，则显示样本为Omicron株BA.1和/或BA.3亚系而非其它新型冠状病毒；若VIC通道出现阳性扩增而CY5通道未出现阳性扩增，则显示样本非Omicron株BA.1和/或BA.3亚系。所述方法可快速、准确的对Omicron株BA.1和/或BA.3亚系进行鉴别。

[0083] 本实施例对本发明中的双重探针法qPCR进行了方法验证。结果见图2‑图4。图2为2
Omicron株BA.1和/或BA.3亚系扩增通道的标准曲线，R 为0.99，扩增效率为0.92，斜率为‑
2
3.531。图3为其它新型冠状病毒扩增通道的标准曲线，R为1，扩增效率为0.955，斜率为‑
3.436。由图2和图3可以看出本发明的检测限为0.03pg/μl，且具有良好的线性。图4为双重探针qPCR方法的专属性（特异性）验证，结果显示Omicron株BA.1亚系样本在Omicron株BA.1和/或BA.3亚系扩增通道出现阳性扩增，在其他新型冠状病毒毒株扩增通道为阴性扩增；而原型株样本、Delta株样本和Beta株样本在Omicron株BA.1和/或BA.3亚系扩增通道出现阴性扩增，在其他新型冠状病毒毒株扩增通道为阳性扩增，说明本发明具有良好的特异性，能够准确的鉴别Omicron株BA.1和/或BA.3亚系。利用本发明的引物和探针进行双重探针qPCR方法对灭活后Omicron株BA.1亚系病毒原液的检测，检测结果见图5所示，可知该方法适用于对灭活后的Omicron株BA.1亚系疫苗原液进行鉴别。

[0084] 采用如SEQ ID NO.3所示序列的引物和如SEQ ID NO.4所示序列的引物、如SEQ ID NO.6所示序列的探针和如SEQ ID NO.8所示序列的探针，进一步鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系阳性样品中是否存在新型冠状病毒Omicron株BA.1亚系或是BA.3亚系。所述的引物和探针、荧光标记的设计方案如图6所示。具体操作包括：

[0085] 实验样品：待测新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系阳性样品。

[0086] 标准质粒的获得：Omicron株BA.1亚系S基因标准质粒（SEQ ID NO.9）、BA.1亚系外其它新型冠状病毒S基因标准质粒（SEQ ID NO.10）直接由擎科生物合成。

[0087] qPCR扩增：反应体系和反应条件见表3，其中反应体系中，上游引物、下游引物和探针的加入量可以是0.1‑10μM范围内的任何一个浓度，总的反应体系范围可以是10‑20μl范围内的任何一个体积，样本cDNA的加入量可以是1pg‑1μg范围内的任何一个浓度。本次所使用的qPCR预混酶为全式金生物公司的PerfectStart® II Probe qPCR SuperMix（货号：AQ711），其中退火温度可选择52‑60℃范围内的任何一个温度。

[0088] 上游引物（211/212‑F）的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物（211/212‑R）的序列如SEQ ID NO.4所示；Omicron株BA.1亚系探针（211/212‑P‑Omicron株BA.1亚系）的序列如SEQ ID NO.6所示；BA.1亚系外其它新型冠状病毒探针（211/212‑P‑其它新型冠状病毒）的序列如SEQ ID NO.8所示。

[0089] SEQ ID NO.3（211/212‑F）：TAAAATATATTCTAAGCACACGCC；

[0090] SEQ ID NO.4（211/212‑R）：CTACCAATGGTTCTAAAGCC；

[0091] SEQ ID NO.6（211/212‑P‑Omicron株BA.1亚系）：GCGTGAGCCAGAAGATCTCC；

[0092] SEQ ID NO.8（211/212‑P‑其它新型冠状病毒）：GTGCGTGATCTCCCTCAG。

[0093] 表3. 反应体系和反应条件

[0094]

[0095] 结果分析：以Roche480仪器为例，实验结束后设置每个检测孔的样品类型（待测样本，标准品，阴性对照或阳性对照），其中标准品需设定浓度。打开分析界面，选择探针所使2
用的荧光通道，根据扩增图像，调整Noise band值，以确保生成的标准曲线的扩增效率、R值和斜率均在合格范围内。本发明为双重探针qPCR方法，在一次反应中分别对Omicron株BA.1亚系扩增通道和BA.1亚系外其它新型冠状病毒扩增通道进行分析并记录结果。

[0096] 结果判定：扩增结果中扩增曲线为典型的“S型”曲线，则为阳性结果；扩增结果中扩增曲线不是典型的“S型”曲线，则为阴性结果。具体结果判读方法见表4。

[0097] 表4. 结果判定

[0098]

[0099] 将待检样本加入反应体系中进行上机检测，检测结果中若CY5通道出现阳性扩增而FAM通道未出现阳性扩增，则显示样本为Omicron株BA.1亚系而非其它新型冠状病毒；若FAM通道出现阳性扩增而CY5通道未出现阳性扩增，则显示样本非Omicron株BA.1亚系。所述方法在一次反应中可快速、准确的对Omicron株BA.1亚系进行鉴别。

[0100] 本实施例对本发明中的双重探针法qPCR进行了方法验证。结果见图7‑图9。图7为2
Omicron株BA.1亚系扩增通道的标准曲线，R为0.98，扩增效率为0.918，斜率为‑3.535。图8
2
为其它新型冠状病毒扩增通道的标准曲线，R为0.98，扩增效率为0.967，斜率为‑3.404。由图7和图8可以看出本发明的检测限为0.03pg/μl，且具有良好的线性。图9为双重探针qPCR方法的专属性（特异性）验证，结果显示Omicron株BA.1亚系样本在Omicron株BA.1亚系扩增通道出现阳性扩增，在其他新型冠状病毒扩增通道为阴性扩增；而原型株、Beta株和Delta株样本在Omicron株BA.1亚系扩增通道出现阴性扩增，在其他新型冠状病毒扩增通道为阳性扩增，说明本发明具有良好的特异性，能够准确的鉴别Omicron株BA.1亚系。利用本发明的引物和探针进行双重探针qPCR方法对灭活后Omicron株BA.1亚系病毒原液进行检测，结果见图10所示，可知所述方法适用于对灭活后的Omicron株BA.1亚系疫苗原液进行鉴别。