一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法

摘要

本发明提供了一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法，属于生物工程技术领域。本发明以景观型苔藓孢子为材料，利用EMS诱变剂溶液浸泡处理苔藓孢子的方式进行诱变，通过对其突变体表型的观察及数据化比较，来筛选景观型苔藓突变体。在实验室中4个月就能获得稳定遗传的景观型新品种，极大地缩短育种时间，更适用于苔藓造景及具有复杂图案的立体绿化造景，对景观型苔藓植物的新性状培育具有重要的指导意义。经本发明方法获得的突变体株型优美，有较高欣赏价值，有景观型苔藓应用潜力，且突变体生长发育正常，能正常完成生活史。另外，本发明方法操作简单，鉴定结果准确、稳定可靠，可以实现突变体批量筛选、快速检测，突变效率高。

权利要求

1.一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：采用浓度为

2％‑4％的EMS诱变剂溶液浸泡处理苔藓孢子，进行诱变；待诱变后的孢子发育出原丝体后，进行单独培养，对培养获得的突变体进行表型观察及数据化比较，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料；

所述EMS诱变剂溶液浸泡处理的时间为60min‑90min；

所述苔藓为小立碗藓；

所述表型观察及数据化比较包括株高、叶夹角、叶伸展距、叶片长度；

所述苔藓孢子的获得方法包括如下步骤：将苔藓配子体移至基质培养，光周期8h昼/‑2 ‑1

16h夜，光强60‑80μmol photons m s ，培养温度16℃，60d‑90d诱导出苔藓孢子；

还包括如下步骤：筛选获得与野生型在表型方面有明显差异性的材料后，对所述材料进行继代处理，获得继代突变体，对继代突变体进行表型观察及数据化比较，包括株高、叶夹角、叶伸展距、叶片长度，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料；

所述继代处理的方法包括如下步骤：将新长出的原丝体与无菌水混合，打磨粉碎原丝体，获得苔藓悬浮液，接种至培养基，进行培养；

所述培养所用的培养基为BCDAT培养基；

‑2 ‑1

所述培养的温度为25℃，光强为60‑80μmol photons m s ，光周期为16h光照/8h黑暗。

2.权利要求1方法所得的苔藓在绿化造景中的应用。

说明书

一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法。

背景技术

[0002] 在世界范围内苔藓植物的种类繁多，约有23000种，其中包括约15000种藓类，8000余种苔类和100余种角苔类。苔藓植物大部分个体微小，结构较为简单，其形态各异，利用苔藓的生长特性结合园林园艺造景艺术，能够创造极富有自然美的新型苔藓景观。此外，苔藓适应性较强，基本无病虫害，青翠常绿，生长整齐且无需修剪，造景后的景观能保持较长时间。苔藓植物作为新兴的景观植物，由于其独特的形态特征，带来新的观赏感受的同时也有区别于其他植物的特有的应用前景。但目前苔藓植物市场上缺少良好的景观苔藓新品种，并且缺乏完善的种植培养体系，在经济利益的驱使下，大量野生苔藓被过度利用，这使苔藓植物生存与苔藓植物资源的可持续利用受到严重威胁。而适合于商业苔藓只有极少的一部分，深入挖掘苔藓资源，对现有苔藓品种进行改造，选育更加适合商业应用的苔藓新品种对野生苔藓种质资源多样性的保护以及苔藓产业的健康快速发展具有重要的意义。

[0003] 小立碗藓(Physcomitrellapatens)属于葫芦藓科，小立碗藓属，分布于欧洲、亚洲、非洲及大洋洲，中国湖南省张家界地区有分布。小立碗藓植物体矮小，黄绿色，有光泽，稀疏丛集。其茎细而短。叶片呈卵形或披针形，茎基部的叶较小，中肋单一、细长。小立碗藓目前苔藓市场上已有应用，常作为种植在苔藓墙的“山石”、“平原”、“瀑布”等周围，作为主景或点缀。

[0004] 甲基磺酸乙酯(EMS)是一种应用十分广泛的化学诱变剂，它的诱变效率高、诱变效果好。EMS诱变在植物育种上的应用，不仅可以打破传统的植物育种方式，获得的突变群体对培育植物新品种和丰富植物种质资源具有重要意义。目前本领域主要以EMS诱变植物种子为主，尚未有采用EMS诱变苔藓孢子的有关研究，而且苔藓是园艺、景观植物，如何快速、规模化获得性状优良的苔藓突变体材料，以满足市场需求，目前还有没有一种合适的方法。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法，能够极大的缩短育种时间，规模化获得性状优良的更适用于苔藓造景及具有复杂图案的立体绿化造景的苔藓突变体材料。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法，包括如下步骤：采用浓度为2％‑4％的EMS诱变剂溶液浸泡处理苔藓孢子，进行诱变；待诱变后的孢子发育出原丝体后，进行单独培养，对培养获得的突变体进行表型观察及数据化比较，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料。

[0008] 优选的，所述EMS诱变剂溶液浸泡处理的时间为60min‑90min。

[0009] 优选的，所述苔藓包括小立碗藓。

[0010] 优选的，所述苔藓孢子的获得方法包括如下步骤：将苔藓配子体移至基质培养，光‑2 ‑1周期8h昼/16h夜，光强60‑80μmol photons m s ，培养温度16℃，60d‑90d诱导出苔藓孢子。

[0011] 优选的，还包括如下步骤：筛选获得与野生型在表型方面有明显差异性的材料后，对所述材料进行继代处理，获得继代突变体，对继代突变体进行表型观察及数据化比较，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料。

[0012] 优选的，所述继代处理的方法包括如下步骤：将新长出的原丝体与无菌水混合，打磨粉碎原丝体，获得苔藓悬浮液，接种至培养基，进行培养。

[0013] 优选的，所述表型观察及数据化比较包括株高、叶夹角、叶伸展距(指叶尖到植物茎的垂直距离)、叶片长度。

[0014] 优选的，所述培养所用的培养基为BCDAT培养基。

[0015] 优选的，所述培养的温度为25℃，光强为60‑80μmol photons m‑2s‑1，光周期为16h光照/8h黑暗。

[0016] 本发明还提供了一种上述方法所得的苔藓在绿化造景中的应用。

[0017] 本发明的有益效果：

[0018] 本发明提供了一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法，将EMS诱变技术首次应用于苔藓这种新兴园艺观赏植物的育种中，结合小立碗藓组织培养技术，在实验室中4个月就能获得稳定遗传的景观型新品种，极大地缩短育种时间，提高了育种效率。相比于野生型小立碗藓，采用本发明方法获得的突变体在株高、叶夹角、叶伸展距、叶片长度等性状上有明显差异，选育出的突变体株型优美，有较高欣赏价值，有景观型苔藓应用潜力，且突变体生长发育正常，能正常完成生活史。

[0019] 另外，本发明方法操作简单，突变效率高，所得到的突变体性状遗传稳定可靠，并且可以实现突变体批量筛选、快速检测。

附图说明

[0020] 图1为突变体植株Pp73、Pp23与野生型植株(WT)在株高、叶夹角、叶伸展距、叶片长度方面的数据比较结果，其中A为三者在叶伸展距方面显著性分析，B为株高显著性分析，C为叶夹角显著性分析，D为叶片长度显著性分析，ns代表P>0.05无显著差异，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001；

[0021] 图2为突变体植株Pp73、Pp23与野生型植株在外观性状方面的观察结果，其中A为野生型，B为突变体Pp73，C为突变体Pp23；

[0022] 图3不同实施例筛选获得的突变体植株的外观性状观察结果，其中A为野生型，B为突变体Pp73，C为突变体Pp23，D为突变体Pp38，E为突变体Pp59，F为突变体Pp72，G为突变体Pp76，H为突变体Pp87；

[0023] 图4为1％浓度EMS诱变剂诱变处理不同时间的诱变发芽率结果；

[0024] 图5为4％浓度EMS诱变剂诱变处理不同时间的诱变发芽率结果。

具体实施方式

[0025] 本发明提供了一种景观型苔藓孢子规模化诱变筛选方法，包括如下步骤：采用浓度为2％‑4％的EMS诱变剂溶液浸泡处理苔藓孢子，进行诱变；待诱变后的孢子发育出原丝体后，进行单独培养，对培养获得的突变体进行表型观察及数据化比较，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料。

[0026] 本发明对于EMS诱变剂的具体来源没有特殊限定，所述EMS诱变剂溶液的浓度优选为3％‑4％，更优选为4％，采用EMS诱变剂溶液浸泡处理的时间优选为60min‑90min，更优选为70min‑80min。在本发明中，所述EMS诱变剂溶液优选的为用磷酸缓冲液稀释EMS诱变剂所得，所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.1mol/ml。

[0027] 在本发明中，所述苔藓优选的包括小立碗藓。本发明采用EMS诱变剂溶液浸泡处理苔藓孢子，进行诱变，所述苔藓孢子的获得方法优选的包括如下步骤：将苔藓配子体移至基‑2 ‑1质培养，光周期8h昼/16h夜，光强60‑80μmol photons m s ，培养温度16℃，60d‑90d诱导‑2 ‑1
出苔藓孢子。其中光强优选为65‑75μmolphotons m s 。获得苔藓孢子后，优选的选择大小基本一致、孢子形状较好的作为诱变材料。

[0028] 在孢子诱变后，进行苔藓孢子外植体消毒，然后加入双蒸水中，在液体环境中戳破孢子，将混合溶液吸至培养基进行培养。本发明对于苔藓孢子外植体消毒的具体方法没有特殊限定，优选的采用NaCl溶液进行消毒，所述NaCl溶液的浓度优选为10％，所述消毒的时间优选为4‑6min，更优选为5min。待诱变后的孢子发育出原丝体后，进行单独培养，对培养获得的突变体进行表型观察及数据化比较，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料。

[0029] 在本发明中，所述表型观察及数据化比较优选的包括株高、叶夹角、叶伸展距和叶片长度。在本发明中，所述叶伸展距指的是叶尖到植物茎的垂直距离。将上述性状与野生型苔藓植物进行对比，只要有一项性状与野生型差异显著，那么即可表明诱变成功。

[0030] 在本发明中，为了获得性状更加能够稳定遗传的突变体材料，优选的还包括如下步骤：筛选获得与野生型在表型方面有明显差异性的材料后，对所述材料进行继代处理，获得继代突变体，对继代突变体进行表型观察及数据化比较，筛选与野生型在表型方面有明显差异性的材料。此处对继代突变体进行表型观察及数据化比较的具体性状同上，在此不再赘述。

[0031] 本发明对于继代处理的次数没有特殊限定，所述两次继代处理的间隔优选为6‑8天，更优选为7天。所述继代处理的方法优选的包括如下步骤：将新长出的原丝体与无菌水混合，打磨粉碎原丝体，获得苔藓悬浮液，接种至培养基，进行培养。

[0032] 在本发明所述方法中，将孢子培育长出原丝体后，将原丝体单独培养，上述步骤中所用的培养基均优选为BCDAT培养基，本发明对于BCDAT培养基的具体配比没有特殊限定，优选的包括Stock B、Stock C、Stock D、Alternative TES、琼脂、水和CaCl2·2H2O。上述培‑2 ‑1养步骤中的培养条件优选为25℃，60‑80μmol photons m s 光强，16h光照/8h黑暗光周‑2 ‑1
期，所述光强优选为65‑75μmol photons m s 。

[0033] 本发明还提供了一种采用上述方法所得的苔藓在绿化造景中的应用。

[0034] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0035] 实施例1

[0036] 将小立碗藓配子体移至基质(挪威进口捷菲jiffy压缩基质块)培养，光周期8h昼/‑2 ‑116h夜，光强为60‑80μmol photons m s ，培养温度为16℃，60d‑90d诱导出小立碗藓孢子，收取大小基本一致、孢子形状较好的作为诱变材料。用0.2mol/ml磷酸缓冲液(pH为7.0)稀释EMS诱变剂(SIGMA M0880‑25G Ethyl Methanesulfonate)至EMS诱变剂浓度为4％，得EMS诱变剂溶液，将小立碗藓孢子放入4％EMS诱变剂溶液中25℃浸泡诱变，浸泡时间为90min。

[0037] 诱变结束后，用浓度为10％的NaCl溶液(双蒸水稀释)对苔藓孢子进行外植体消毒5min，再用双蒸水冲洗孢子6‑8次，后加入1ml双蒸水，并在液体环境中戳破孢子，将混合溶液吸至BCDAT培养基(BCDAT培养基的配比如表1和表2所示)培养。培养7天后统计诱变发芽率。

[0038] 在孢子发育出原丝体后，进行挑苗，将其单独培养，获得突变体植株Pp73和Pp23。‑2 ‑1
上述步骤中的培养条件均为：温度25℃，光强60‑80μmol photons m s ，光周期16h光照8h黑暗。

[0039] 表1 BCDAT培养基配方

[0040]

[0041]

[0042] 表2 BCDAT培养基母液配置配方

[0043]

[0044] 观察突变体植株与野生型植株(WT)(野生型植株指的是重复上述实验过程，区别仅为将EMS诱变剂溶液替换为ddH2O)的株高、叶夹角、叶伸展距、叶片长度，并将上述性状的数值进行比较，结果如图1所示，上述突变体植株与野生型植株的整体外观如图2所示。

[0045] 由图1可以看出，突变体Pp73与WT在叶伸展距、叶片长度上差异性是极显著的，株高方面是有差异性的，在叶夹角上无明显差异。突变体Pp23与WT在叶伸展距、株高、叶片长度上差异性是极显著的，叶夹角也有差异性。由图2可以看出，突变体Pp73和Pp23与WT的外观特征相差甚大。

[0046] 实施例2

[0047] 将实施例1筛选所得的突变体材料每隔7天打磨继代一次，共进行三次打磨继代，每次打磨继代具体步骤为：用无菌镊子刮取培养皿上新长出的原丝体，将原丝体混合10mL无菌水，用研磨仪打磨粉碎原丝体，将原丝体制成苔藓悬浮液后接种到BCDAT培养基上培养，接种后的培养皿放置在光照培养箱中进行培养。上述步骤中的培养条件均为：培养温度‑2 ‑125℃，光强60‑80μmol photons m s ，光周期16h光照8h黑暗。经连续打磨继代，获得性状可以稳定遗传的突变体材料。

[0048] 对可以稳定遗传的突变体进行表型观察，观察突变体植株与野生型植株(WT)的株高、叶夹角、叶伸展距、叶片长度，并将上述性状的数值进行比较，筛选表型具有新颖性(与WT相比，无论是上述哪种性状有明显差异，均认为是具有新颖性)的景观型小立碗藓突变体作为小立碗藓景观应用新品系。

[0049] 实施例3

[0050] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，EMS诱变剂溶液诱变浸泡时间为60min，其余均同实施例1。

[0051] 实施例4

[0052] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，所用的EMS诱变剂溶液的浓度为3％，诱变浸泡时间为60min，其余均同实施例1。

[0053] 实施例5

[0054] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，所用的EMS诱变剂溶液的浓度为2％，诱变浸泡时间为90min，其余均同实施例1。

[0055] 实施例1、3‑5筛选获得的突变体植株的外观性状如图3所示。

[0056] 对比例1

[0057] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，所用的EMS诱变剂溶液的浓度为1％，诱变浸泡时间分别为10min、1h、2h，其余均同实施例1。培养7天后统计诱变发芽率。与野生型小立碗藓(WT)进行对比，WT组为采用ddH2O浸泡处理，其余均同实施例1。结果如图4所示。虽然低浓度的EMS诱变剂诱变处理能够获得较高的诱变发芽率，但是突变效率低，最终无法获得较理想的突变体植株。

[0058] 对比例2

[0059] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，EMS诱变剂溶液诱变浸泡时间为10min，其余均同实施例1。

[0060] 对比例3

[0061] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，EMS诱变剂溶液诱变浸泡时间为30min，其余均同实施例1。

[0062] 对比例4

[0063] 与实施例1的区别在于EMS诱变处理时，EMS诱变剂溶液诱变浸泡时间为120min，其余均同实施例1。

[0064] 将实施例1、3和对比例2‑4的诱变发芽率结果进行比较，其中WT组为采用ddH2O浸泡处理，其余均同实施例1。结果如图5所示。虽然浓度为4％的EMS诱变剂溶液短时间(10min、30min)诱变处理能够获得较高的诱变发芽率，但是最终无法获得较理想的突变体植株。

[0065] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。