一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂及其应用

摘要

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂及其应用，所述的RNA抑制剂由正义链和反义链通过碱基配对形成，正义链和反义链彼此之间至少85％碱基互补，且部分或全部核苷酸糖基2’位的‑OH被氟或甲氧基取代，末端至少有连续3个核苷酸之间的磷酸酯被硫代。本发明的RNA抑制剂的结构中还含有5’MVIP和3'MVIP，使所述RNA抑制剂具有特异性的肝靶向。本发明提供的RNA抑制剂具有当前临床一线乙型肝炎治疗药物所不具有的功效，可以持续高效抑制HBV表面抗原HBsAg的合成，并有表面抗体HBsAb产生。本发明的RNA抑制剂对HBV最常见的A、B、C和D型都具有显著的抑制作用。本发明的RNA抑制剂与核苷类似物或干扰素联合使用，可以功能性治愈乙型肝炎。

权利要求

1.一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述RNA抑制剂由链长为19‑23的正义链和反义链通过碱基配对形成，所述正义链为SEQ IDNO.1，且所述反义链为SEQ ID NO.58：正义链：5'ggguuuuucucguugacaa 3'SEQ ID NO.:1反义链：5'uugucaacgagaaaaacccuu 3'SEQ ID NO.:58其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。

2.根据权利要求1所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述正义链或反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位的‑OH可以被取代，其中，所述取代基团为氟或甲氧基；所述正义链或反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代；所述RNA抑制剂还含有5’MVIP和3’MVIP的组合，其中，所述5’MVIP和3’MVIP为带有肝靶向特异性配体X的配体结构，其还包含支链L、接头B和连接链D；

所述5’MVIP偶联在所述正义链和/或反义链5’末端，其还包含与所述正义链或反义链

5’末端连接的转接点R1；

所述3’MVIP偶联在所述反义链和/或正义链3’末端，其包含与所述正义链或反义链3’末端连接的转接点R2；

所述5’MVIP的结构如通式I所示，所述3’MVIP结构如通式II所示，其中，

n和m分别为1‑3的整数，且n+m＝2、3或4；

所述转接点R1和R2结构中带有‑NH‑、硫原子或氧原子，其结构中至少有一个‑NH‑、硫原子或氧原子，R1和R2通过结构中‑NH‑、硫原子或氧原子分别与5'MVIP和3'MVIP的连接链D以及正义链和/或反义链5’末端和3'末端相连；

R1为‑NH(CH2)xCH2O‑，其中x为3‑12的整数，或者R1为‑O(CH2)6O、‑S(CH2)6O‑或‑NH(CH2)

6S‑；

R2为‑NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O‑，其中x1为1‑4的整数，x2为0‑4的整数，或者R2为所述肝靶向特异性配体X选自半乳糖、半乳糖胺、N‑乙酰半乳糖胺，并且所述肝靶向特异性配体X在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间为相同的或不同的；

所述支链L是含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、C4‑C10脂肪族碳环基、苯基或者这些基团的组合的C4‑C18直链，并且所述支链L在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或

5’MVIP与3’MVIP之间为相同的或不同的；

所述接头B选自以下结构：

其中，A1和A2各自独立地是C、O、S、‑NH‑、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0‑4的整数，并且所述接头B在5’MVIP与3’MVIP之间为相同的或不同的；

所述连接链D是含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、芳香烃基、C4‑C10脂肪族碳环基、含1‑3个氮的五元或六元杂环基或者这些基团的组合的C3‑C18直链。

3.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述肝靶向特异性配体X为N‑乙酰半乳糖胺。

4.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述支链L中的C4‑C18直链还带有乙基醇或羧酸类的侧链。

5.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述支链L为含酰胺基或六元脂肪族碳环基的C7‑C18直链。

6.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述接链D中的C3‑C18直链还带有甲基醇、甲基叔丁基、甲基苯酚基或C5‑C6脂肪环基的侧链。

7.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述连接链D为含两个C＝O、六元脂肪族碳环基或苯基的C3‑C10直链。

8.根据权利要求7所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述连接链D为含两个C＝O的C3‑C10直链。

9.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，R1为‑NH(CH2)xCH2O‑，其中x为4‑6的整数。

10.根据权利要求9所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，R1为‑NH(CH2)6O‑。

11.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，R2为

12.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述5’MVIP为如下所示的5’MVIP01或5’MVIP09，所述3’MVIP为如下所示的3’MVIP01、3’MVIP09或3’MVIP17：

13.根据权利要求12所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述正义链5’MVIP和反义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP01、5’MVIP01/3’MVIP17或5’MVIP09/3’MVIP09，或者所述正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3'MVIP09或5’MVIP09/

3'MVIP01。

14.如权利要求1‑13中任一项所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗乙型肝炎的药物中的应用。

15.一种药物组合物，该药物组合物包括权利要求1‑13中任一项所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料，其剂型为口服剂、静脉注射剂或者皮下或肌内注射剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其剂型为皮下注射剂。

17.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1‑13中任一项所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐和治疗慢性乙型肝炎的药物核苷类似物或干扰素。

说明书

一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂及其应用

[0001] 本分案申请是基于申请号为202110394458.X，申请日为2021年4月13日，发明名称为“一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂及其应用”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂及其应用，所述的RNA抑制剂由正义链和反义链通过碱基配对形成，正义链和反义链彼此之间至少85％碱基互补，且部分或全部核苷酸糖基2’位的‑OH被氟或甲氧基取代，末端至少有连续3个核苷酸之间的磷酸酯被硫代。本发明的RNA抑制剂的结构中还含有使所述RNA抑制剂具有肝靶向特异性的结构5’MVIP和3'MVIP，其中5’MVIP偶联在所述RNA抑制剂正义链和/或反义链5’末端，3’MVIP偶联在所述RNA抑制剂反义链和/或正义链3’末端，5’MVIP和3’MVIP都包含有肝靶向特异性配体X、支链L、接头B和连接链D，5’MVIP还包含与所述RNA抑制剂正义链或反义链5’末端连接的转接点R1，3’MVIP还包含与所述RNA抑制剂正义链或反义链3’末端连接的转接点R2，所述肝靶向特异性配体X、支链L或接头B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同。本发明提供的RNA抑制剂具有当前临床一线乙型肝炎治疗药物所不具有的功效，可以直接破坏HBV mRNA作为翻译模板的功能，阻止HBV表面抗原HBsAg的合成。另外，本发明的RNA抑制剂对HBV最常见的A、B、C和D型都有显著的抑制作用；可以与核苷类似物及干扰素联合使用；可以持续高效地使HBV小鼠的
HBsAg的表达水平减少，并产生表面抗体HBsAb，可以功能性治愈乙型肝炎。

背景技术

[0003] RNAi

[0004] RNAi(RNA干扰)于1998年由安德鲁·法厄(Andrew Z.Fire)等在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时发现，并将这一过程称为RNAi。这一发现被《Science》杂志评为
2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。自此以后，以RNAi为作用机理的RNA抑制剂作为潜在的基因治疗药物得到人们广泛的关注，2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(Craig C.Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得了诺贝尔生理或医学奖。
RNAi在许多生物(包括动物、植物和真菌)中都可由双链RNA(dsRNA)触发，在RNAi过程中，一种称为“Dicer”的核酸内切酶将长链dsRNA切割或“切丁”成21～25个核苷酸长的小片段。这些小片段，被称为小干扰RNA(RNA抑制剂)，其中的反义链(Guide strand)被加载到
Argonaute蛋白(AGO2)上。AGO2加载发生在RISC‑loading复合物中，这是一个三元复合物，由Argonaute蛋白、Dicer和dsRNA结合蛋白(简称为TRBP)组成。在装载过程中，正义链
(Passenger strand)链被AGO2裂解并排出。然后，AGO2使用反义链与包含完全互补序列的mRNA结合，然后催化这些mRNA的切割，致使mRNA分裂丧失翻译模板的作用，进而阻止相关蛋白质的合成。切割后，被切割的mRNA被释放，加载着反义链的RISC‑loading复合物被循环用于另一轮的切割。

[0005] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒持续感染超过6个月以上，肝脏发生不同程度炎症坏死(或)纤维化的疾病。据世界卫生组织估计全世界已大约有20亿人感染，其中每年约4百万人急性感染，约3.5‑4亿乙型肝炎感染者，非洲区和西太平洋占68％。全球每年约有1百万人死于乙型肝炎感染相关疾病，其中肝硬化占30％，原发性肝细胞癌占45％。我国肝硬化和原发性肝细胞癌患者中，由乙型肝炎病毒所致者分别为77％和84％。目前临床一线用药包括核苷类(NUC)和干扰素类药物，最主要药物仍是核苷类药物如拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦、替比夫定等。丙酚替诺福韦是最新上市的一款新的NUC类药物但因有可能造成肾功能损害，所以一定程度上限制了它的使用。核苷类药物具有生物利用度高、口服较安全的优势。
然而，核苷类药物虽然能有效地控制病情，但长期使用均可出现耐药性，另外停药后出现HBV DNA、ALT及肝组织学的不同程度的反弹；且在长期使用核苷类药物后出现的较为明显的副作用，例如肾脏损伤、婴儿致畸等。病毒耐药株的出现是长期使用核苷类药物必须要面对的另一个副作用，耐药株的出现大大降低治愈率，甚至无效。因为核苷类药物对病毒复制是可逆的，所以对大部分患者若欲达到最大疗效，疗程必须在一年以上，如此其耐药性随之出现，就达不到预期之效果。核苷类(NUC)药物需要天天服用，患者用药依从性差。

[0006] 乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒(HBV)的外壳蛋白，是作为第一可检测病毒的标志物。HBsAg阳性是判断HBV感染的金标准。对于乙肝患者，如在肝硬化前获HBsAg清除，则其肝硬化和肝细胞癌发生率将降低60倍。美国肝病研究协会AASLD、亚太肝脏研究协会APASL和欧洲肝脏研究协会EASL的指南中均将HBsAg血清清除作为治疗终点判定标准之一。另外，高水平抗原诱导免疫耐受，抗原HBsAg水平的减少可以恢复HBV感染的免疫学控制。目前，临床一线用药包括核苷类(NUC)和干扰素类药物都不具有降低抗原HBsAg水平效果，更谈不上清除HBsAg。

[0007] 乙型肝炎的治疗目前仍然是个全球性的健康挑战。因此，本领域急需开发出新的治疗机理的抗HBV药物，通过高效持久降低抗原HBsAg水平，使乙型肝炎患者重新产生HBsAb抗体，最终可以被功能性治愈。

发明内容

[0008] 本发明涉及一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂及其应用，所述的RNA抑制剂由正义链和反义链通过碱基配对形成，正义链和反义链彼此之间至少85％碱基互补，且部分或全部核苷酸糖基2’位的‑OH被氟或甲氧基取代，末端至少有连续3个核苷酸之间的磷酸酯被硫代，以增强其在体内的稳定性。本发明所述的RNA抑制剂的结构中还含有的5’MVIP和3'MVIP，使所述RNA抑制剂具有肝靶向特异性的结构，其中5’MVIP偶联在所述RNA抑制剂正义链和/或反义链5’末端，3’MVIP偶联在所述RNA抑制剂反义链和/或正义链3’末端，5’MVIP和3’MVIP都包含有肝靶向特异性配体X、支链L、接头B和连接链D，5’MVIP还包含与所述RNA抑制剂正义链或反义链5’末端连接的转接点R1，3’MVIP还包含与所述RNA抑制剂正义链或反义链3’末端连接的转接点R2，所述肝靶向特异性配体X、支链L或接头B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同。本发明提供的RNA抑制剂具有当前临床一线乙型肝炎治疗药物所不具有的功效，可以直接破坏HBV mRNA作为翻译模板的功能，阻止HBV表面抗原HBsAg的形成。另外，本发明的RNA抑制剂对HBV最常见的A、B、C和D型都有显著的抑制作用，可以与核苷类似物及干扰素联合使用；可以持续高效使HBV小鼠的HBsAg的表达水平减少，并产生表面抗体HBsAb，可以功能性治愈乙型肝炎。与已有公开的同类技术相比较，本发明所述的RNA抑制剂最主要的特征是在体内可以产生表面抗体HBsAb，激发体内重新对HBV产生免疫力，实现功能性治愈乙型肝炎。

[0009] 一方面，本发明提供了一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，

[0010] 所述RNA抑制剂由链长为15‑30的正义链和反义链通过碱基配对形成，其中链长优选为19‑23。

[0011] 在上述技术方案中，优选地，所述正义链和反义链之间至少有85％的碱基互补；

[0012] 所述正义链或反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位的‑OH可以被取代，其中，所述取代基团为氟或甲氧基；

[0013] 且所述正义链或反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代。

[0014] 更优选地，所述正义链为如下所示的SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1相差一个、两个或三个核苷酸的序列，所述反义链为如下所示的SEQ ID NO.58或与SEQ ID NO.58相差一个、两个或三个核苷酸的序列：

[0015] 正义链：5'ggguuuuucucguugacaa 3'SEQ ID NO.:1

[0016] 反义链：5'uugucaacgagaaaaacccuu 3'SEQ ID NO.:58

[0017] 其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。

[0018] 或者，更优选地，所述正义链为如下所示的SEQ ID NO.140或与SEQ ID NO.140相差一个、两个或三个核苷酸的序列，所述反义链为如下所示的SEQ ID NO.141或与SEQ ID NO.141相差一个、两个或三个核苷酸的序列：

[0019] 正义链：5'ggguuuuucuuguugacaa 3'SEQ ID NO.:140

[0020] 反义链：5'uugucaacaagaaaaacccuu 3'SEQ ID NO.:141

[0021] 其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。

[0022] 为了增强上述RNA抑制剂在体内的稳定性，在不影响其活性甚至增强其活性的情况下，可以对上述RNA抑制剂的正义链和反义链进行修饰，其中的核苷酸可以有修饰基团，可以整条链或者部分修饰。

[0023] 在一个优选的技术方案中，所述RNA抑制剂修饰后的正义链为如下所示的SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2相差一个、两个或三个核苷酸的序列，其修饰后的反义链为如下所示的SEQ ID NO.59或与SEQ ID NO.59相差一个、两个或三个核苷酸的序列：

[0024] 正义链：5'Gs fGs G U fU U fU fU fC U C G U U G A Cs As A 3'SEQ ID NO.:2

[0025] 反义链：5'Us Us G U C A fA C G A G fA A fA fA A C C Cs Us U 3'SEQ ID NO.:59

[0026] 其中，G＝2'‑O‑甲基鸟苷酸，A＝2'‑O‑甲基腺苷酸，U＝2'‑O‑甲基尿苷酸，C＝2'‑O‑甲基胞苷酸；Gs＝2'‑O‑甲基‑3’‑硫代鸟苷酸，As＝2'‑O‑甲基‑3'‑硫代腺苷酸，Us＝2'‑O‑甲基‑3'‑硫代尿苷酸，Cs＝2'‑O‑甲基‑3'‑硫代胞苷酸；fG＝2'‑氟鸟苷酸，fA＝2'‑氟腺苷酸，fU＝2'‑氟尿苷酸，fC＝2'‑氟胞苷酸；fGs＝2'‑氟‑3'‑硫代鸟苷酸，fAs＝2'‑氟‑3'‑硫代腺苷酸，fUs＝2'‑氟‑3'‑硫代尿苷酸，fCs＝2'‑氟‑3'‑硫代胞苷酸。

[0027] 在另一个优选的技术方案中，所述RNA抑制剂修饰后的正义链为如下所示的SEQ ID NO.142或与SEQ ID NO.142相差一个、两个或三个核苷酸的序列，其修饰后的反义链为如下所示的SEQ ID NO.143或与SEQ ID NO.143相差一个、两个或三个核苷酸的序列：

[0028] 正义链：5'Gs Gs G U fU U fU fU fC U U G U U G A Cs As A 3'SEQ ID NO.:142

[0029] 反义链：5'Us Us G U C A fA C A A G fA A fA A A C C Cs Us U 3'SEQ ID NO.:143

[0030] 其中，G＝2'‑O‑甲基鸟苷酸，A＝2'‑O‑甲基腺苷酸，U＝2'‑O‑甲基尿苷酸，C＝2'‑O‑甲基胞苷酸；Gs＝2'‑O‑甲基‑3’‑硫代鸟苷酸，As＝2'‑O‑甲基‑3'‑硫代腺苷酸，Us＝2'‑O‑甲基‑3'‑硫代尿苷酸，Cs＝2'‑O‑甲基‑3'‑硫代胞苷酸；fG＝2'‑氟鸟苷酸，fA＝2'‑氟腺苷酸，fU＝2'‑氟尿苷酸，fC＝2'‑氟胞苷酸；fGs＝2'‑氟‑3'‑硫代鸟苷酸，fAs＝2'‑氟‑3'‑硫代腺苷酸，fUs＝2'‑氟‑3'‑硫代尿苷酸，fCs＝2'‑氟‑3'‑硫代胞苷酸。

[0031] 在上述技术方案中，优选地，所述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐还含有5’MVIP和3’MVIP的组合，其中，

[0032] 所述5’MVIP和3’MVIP为带有肝靶向特异性配体X的配体结构，其还包含支链L、接头B和连接链D；

[0033] 所述5’MVIP偶联在所述正义链和/或反义链5’末端，其还包含与所述正义链或反义链5’末端连接的转接点R1；

[0034] 所述3’MVIP偶联在所述反义链和/或正义链3’末端，其包含与所述正义链或反义链3’末端连接的转接点R2；

[0035] 所述5’MVIP的结构如通式I所示，所述3’MVIP结构如通式II所示，

[0036]

[0037] 其中，

[0038] n和m分别为0‑4的整数，优选为1‑3的整数，且n+m＝2‑6的整数，优选n+m＝2、3或4；

[0039] 所述转接点R1和R2结构中带有‑NH‑、硫原子或氧原子，一般结构中至少有一个‑NH‑、硫原子或氧原子，R1和R2通过结构中‑NH‑、硫原子或氧原子分别与5'MVIP和3'MVIP的连接链D以及正义链和/或反义链5’末端和3'末端相连，从而引入肝靶向特异性配体X，所述转接点R1和R2可以是直链；带有支链的直链或者各种环状结构，环状结构如饱和或不饱和的脂肪族碳环基，或者含有硫、氧或氮原子的五元或六元杂环基或芳香烃基等等；

[0040] R1优选为‑NH(CH2)xCH2O‑，其中x为3‑12的整数，优选为4‑6的整数；

[0041] R2优选为‑NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O‑，其中x1为1‑4的整数，x2为0‑4的整数；

[0042] 所述肝靶向特异性配体X，选自半乳糖、半乳糖胺、N‑乙酰半乳糖胺及其衍生物，优选选自N‑乙酰半乳糖胺及其衍生物，并且所述肝靶向特异性配体X在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同；

[0043] 所述支链L是含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、C4‑C10脂肪族碳环基、苯基或者这些基团的组合的C4‑C18直链，所述直链可以带有乙基醇或羧酸类的侧链，所述支链L优选为含酰胺基或六元脂肪族碳环基的C7‑C18直链，并且所述支链L在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同；

[0044] 所述接头B选自以下结构：

[0045]

[0046] 其中，A1和A2各自独立地是C、O、S、‑NH‑、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0‑4的整数，并且所述接头B在5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同；

[0047] 所述连接链D是含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、芳香烃基、C4‑C10脂肪族碳环基、含1‑3个氮的五元或六元杂环基或者这些基团的组合的C3‑C18直链，所述C3‑C18直链也可以带有甲基醇、甲基叔丁基、甲基苯酚基、C5‑C6脂肪环基的侧链，所述连接链D优选为含两个C＝O、六元脂肪族碳环基或苯基的C3‑C10直链。

[0048] 具体地，在一些实施方案中，当n＝0(即不存在5’MVIP)时，所述MVIP的结构可以为：

[0049]

[0050] 在一些实施方案中，当n＝1时，所述MVIP的结构可以为：

[0051]

[0052] 在一些实施方案中，当n＝2时，所述MVIP的结构可以为：

[0053]

[0054] 在一些实施方案中，当n＝3时，所述MVIP的结构可以为：

[0055]

[0056] 在一些实施方案中，当n＝4时，所述MVIP的结构可以为：

[0057]

[0058] 在一些实施方案中，所述的n是指同时放在所述RNA抑制剂的正义链和反义链5’末端5'MVIP中n之和，所述的m是指同时放在所述RNA抑制剂的正义链和反义链3’末端3'MVIP中m之和。

[0059] 所述肝靶向特异性配体X选自用于增强肝细胞对RNA抑制剂的摄取的结构，可以是脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺及肽模拟结构。在本发明提供的RNA抑制剂中，引入所述RNA抑制剂正义链或反义链末端的肝靶向特异性配体配体X可以相同，也可以不同，例如在特性上，有些可以是增强肝靶向性，有些可以是所述RNA抑制剂在体内药代动力学的调节结构，有些可以是具有体内溶解活性的结构。在一些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X选自以下结构中的一种或多种单糖及其衍生物。

[0060] 所述单糖选自以下结构中的一种或多种：甘露糖、半乳糖、D‑阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、木糖、葡糖胺、核糖。甘露糖选自以下结构中的一种或多种：D‑吡喃甘露糖、L‑吡喃甘露糖、α‑D‑呋喃甘露糖、β‑D‑呋喃甘露糖、α‑D‑吡喃甘露糖、β‑D‑吡喃甘露糖。半乳糖选自以下结构中的一种或多种：L‑半乳糖、D‑半乳糖、α‑D‑吡喃半乳糖、β‑D‑吡喃半乳糖、α‑D‑呋喃半乳糖、β‑D‑呋喃半乳糖。葡萄糖选自以下结构中的一种或多种：D‑葡萄糖、L‑葡萄糖、α‑D‑吡喃葡萄糖、β‑D‑吡喃葡萄糖、α‑D‑呋喃葡萄糖、β‑D‑呋喃葡萄糖。果糖选自以下结构中的一种或多种：α‑D‑呋喃果糖、α‑D‑吡喃果糖。木糖选自以下结构中的一种或多种：D‑呋喃木糖、L‑呋喃木糖。核糖选自以下结构中的一种或多种：核糖、D‑核糖、L‑核糖。单糖衍生物选自甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、葡萄糖衍生物、核糖衍生物以及其他衍生物。半乳糖衍生物选自α‑D‑半乳糖胺、N‑乙酰基半乳糖胺、4‑硫代‑β‑D‑吡喃半乳糖。葡萄糖衍生物可以选自2‑氨基‑3‑O‑[(R)‑1‑羧乙基]‑2‑脱氧‑β‑D‑吡喃葡萄糖、2‑脱氧‑2‑甲基氨基‑L‑吡喃葡萄糖、2‑脱氧‑2‑磺氨基‑D‑吡喃葡萄糖、5‑硫代‑β‑D‑吡喃葡萄糖、2,3,4‑三‑O‑乙酰基‑1‑硫代‑
6‑O‑三苯甲基‑α‑D‑吡喃葡萄糖苷甲酯。核糖衍生物选自D‑4‑硫代核糖、L‑4‑硫代核糖的一种或多种。

[0061] 在一些优选实施方案中，所述肝靶向特异性配体X选自半乳糖、半乳糖胺、N‑乙酰半乳糖胺及其衍生物，其结构通式如下：

[0062]

[0063] 其中，W1为氢或羟基保护基，可以相同也可以不同；W为‑OH、‑NHCOOH或‑NHCO(CH2)qCH3，其中q为0‑4的整数；W2为‑NH‑、O、S或C。

[0064] 在一些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X优先选自以下结构中的一种或多种：

[0065]

[0066] 其中，W选自‑OH、‑NHCOOH或‑NHCO(CH2)qCH3中的一种或两种，其中q为0‑4的整数。

[0067] 在一些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X在同一个5'MVIP或3'MVIP结构中可以相同，也可以不同。

[0068] 在一些实施方案中，5'MVIP与3'MVIP彼此之间的X可以相同，也可以不同。

[0069] 所述支链L是含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、C4‑C10脂肪族碳环基、苯基或者这些基团的组合的C4‑C18的直链，所述直链可以带有乙基醇或羧酸类的侧链，所述支链L优选为含酰胺基或六元脂肪族碳环基的C7‑C18直链，其长短或结构会影响到本发明所述的RNA抑制剂的活性。

[0070] 在一些实施方案中，所述支链L在同一个5'MVIP或3'MVIP结构中可以相同，也可以不同。

[0071] 在一些实施方案中，5'MVIP与3'MVIP彼此之间的支链L可以相同，也可以不同。

[0072] 在一些实施方案中，所述支链L可以选自如下结构中的一种或多种：

[0073]

[0074] 其中，r1是1‑12的正整数，r2为0‑20的整数，Z为H或烷基或酰胺基，如C1‑C5烷基、C1‑C5的酰胺基，如甲酰胺等。

[0075] 所述接头B的结构与能引入的特异性配体X的数量有关，接头B中含‑NH‑、C、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基，当n或m为1时，其为一条直链，当n或m为2、3或4时，其分叉的次数分别为2、3或4。所述接头B可以选自以下结构式：

[0076]

[0077] 其中，A1和A2各自独立地是C、O、S、‑NH‑、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0‑4的整数。

[0078] 在一些实施方案中，当n或m为1、2、3或4时，所述接头B选自以下结构式：

[0079]

[0080]

[0081] 其中，r为0‑4的整数。

[0082] 在一些实施方案中，当n或m为1、2、3或4时，所述接头B选自以下结构式：

[0083]

[0084]

[0085]

[0086] 在一些实施例中，所述接头B优先选自以下结构中的一种或几种：

[0087]

[0088] 所述连接链D是含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、芳香烃基、C4‑C10脂肪族碳环基、含1‑3个氮的五元或六元杂环基或者这些基团的组合的C3‑C18直链，所述C3‑C18直链也可以带有甲基醇、甲基叔丁基、甲基苯酚基、C5‑C6脂肪环基的侧链，所述连接链D优选为含两个C＝O、六元脂肪族碳环基或苯基的C3‑C10直链。

[0089] 在一些实施方案中，所述连接链D选自以下结构中的一种或几种：

[0090]

[0091]

[0092]

[0093] 其中，每个n为1‑20的正整数，且每个n为相同或不同的整数；；s为2‑13的整数；Z1和Z2为相同或者不同的取代基团，如C3‑C10烷基。

[0094] 在一些实施方案中，所述连接链D优先选自以下结构中的一种：

[0095]

[0096]

[0097]

[0098] 在一些实施方案中，所述连接链D优先选自以下结构中的一种或几种：

[0099]

[0100] 在一些最优选实施方案中，所述连接链D为含两个C＝O的C3‑C10直链。

[0101] 在一些实施方案中，所述5’MVIP结构中的(X‑L)n‑B‑D‑和3’MVIP结构中的(X‑L)m‑B‑D‑选自以下结构中的一种或多种：

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108]

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116] 在一些优选实施方案中，所述5’MVIP结构中的(X‑L)n‑B‑D‑选自表1中所示的结构：

[0117] 表1：5’MVIP的(X‑L)n‑B‑D‑结构

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122] 在一些实施方案中，5’MVIP也可以不存在，这时候m可以为2‑4的整数。

[0123] 在一些优选实施方案中，所述3’MVIP结构中的(X‑L)m‑B‑D‑选自表2中所示的结构：

[0124] 表2：3’MVIP的(X‑L)m‑B‑D‑结构

[0125]

[0126]

[0127]

[0128]

[0129] 在本发明提供的RNA抑制剂中，所述5’MVIP还包含与所述正义链或反义链5’末端连接或偶联的转接点R1，所述转接点R1结构中带有‑NH‑、硫原子或氧原子，一般结构中至少有一个‑NH‑、硫原子或氧原子。R1通过其结构中‑NH‑、硫原子或氧原子与5'MVIP的连接链D及正义链或反义链5’末端相连，从而引入肝靶向特异性配体X。所述转接点R1可以是直链；带有酰胺基、羧基、烷基支链的直链或者各种环状结构，环状结构如饱和或不饱和的脂肪族碳环基，或者如含有硫、氧或氮原子的五元或六元杂环基或芳香烃基等等。

[0130] 在一些实施方案中，R1为‑B1(CH2)xCH2B2‑，其中x为3‑10的整数，优选为4‑6的整数，基团B1和B2可以分别为‑NH‑、硫原子或氧原子。

[0131] 在一些实施方案中，R1为‑B1(CH2)xCH(B3CH3)B2‑，其中x为3‑10的整数，B1和B2可以分别为‑NH‑、硫原子或氧原子，基团B3为含氮、硫、氧或羧基或甲基类烷基的官能团。

[0132] 在一些优选的实施方案中，R1为‑NH(CH2)xCH2O‑，其中x为3‑10的整数，优选为4‑6的整数，可以通过以下两种亚磷酰胺单体引入：

[0133] i.其中的一个氧原子或硫原子用于R1亚磷酰胺单体的合成，通过固相合成的方法接入RNA抑制剂单链的5’端。结构中‑NH‑、硫原子或氧原子用于与5'MVIP中的连接链D连接，从而在RNA抑制剂的5’端引入肝靶向特异性配体X。引入到RNA抑制剂5’端的单体示例性结构如下：

[0134]

[0135] 在一些实施方案中，优选以下结构：

[0136]

[0137] ii.R1结构中‑NH‑、硫原子或氧原子先与连接链D连接，另外一个‑NH‑、硫原子或氧原子用于5'MVIP亚磷酰胺单体的合成中与亚磷酰胺成酯，正义链或反义链5’MVIP亚磷酰胺单体结构示例如下：

[0138]

[0139] 在一些实施方案中，R1为含有氮、硫或氧原子的杂环或碳环结构：

[0140]

[0141] 在一些优选实施方案中，正义链或反义链5’MVIP亚磷酰胺单体优选以下结构：

[0142]

[0143] 当通式中n为1‑4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的单体化合物，借助上述的单体化合物，肝靶向特异性配体X通过固相合成被引入到正义链或反义链5’末端。

[0144] 在一些优选实施方案中，转接点R1优选为‑NH(CH2)xCH2O‑，其中x可以是3‑10的整数，优选为4‑6的整数，5'MVIP亚磷酰胺单体结构选自如下结构中：

[0145]

[0146]

[0147]

[0148] 在本发明提供的RNA抑制剂中，所述3’MVIP还包含与所述正义链或反义链3’末端连接或偶联的转接点R2，所述转接点R2结构中带有‑NH‑、硫原子或氧原子，一般结构中至少有一个‑NH‑、硫原子或氧原子。R2通过结构中‑NH‑、硫原子或氧原子与3'MVIP的连接链D及正义链或反义链3’末端相连，从而引入肝靶向特异性配体X。所述转接点R2可以是直链；带有酰胺基、羧基或烷基的支链的直链或各种环状结构，环状结构如饱和或不饱和的脂肪族碳环基，或者如含有硫、氧或氮原子的五元或六元杂环基或芳香烃基等等。

[0149] 在一些实施方案中，含杂环结构如哌啶基、吡咯基、噻唑基或者苯环的转接点R2结构如下：

[0150]

[0151] 本发明所述的R2是通过丁二酸酐与R2结构中‑NH‑、硫原子或氧原子成酯或酰胺的同时，又与空白Solid Support中‑NH‑进行偶联，形成3'MVIP solid spport，再通过亚磷酰胺固相合成法，将3’MVIP引入到正义链或反义链的3’末端。

[0152] 在一些实施方案中，R2结构中的杂环为吡咯环或哌啶环，其通过环中的氮杂原子与3'MVIP的连接链D连接，3'MVIP solid spport示例性结构如下：

[0153]

[0154] 当通式中m为1‑4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。

[0155] 在一些实施方案中，R2为‑B4(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2B5‑，其中x1为1‑4的整数，x2为0‑4的整数，B4和B5分别为‑NH‑、硫原子或氧原子。

[0156]

[0157] 当通式中m为1‑4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。

[0158] 在一些优选实施方案中，R2为‑NHCH2CH(OH)CH2O‑。引入3’MVIP solid spport示例性结构如下：

[0159]

[0160] 当通式中m为1‑4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。

[0161] 在一些实施方案中，3’MVIP solid support结构如下：

[0162]

[0163]

[0164]

[0165]

[0166] 在一些优选实施方案中，5’MVIP配体结构中的(X‑L)n‑B‑D‑与R1的组合如表3所示。

[0167] 表3：5’MVIP中(X‑L)n‑B‑D‑与R1的组合

[0168]

[0169]

[0170] 在一些实施方案中，3’MVIP可以不存在，这时候n可以是2‑4。

[0171] 在一些实施方案中，3’MVIP配体结构中的(X‑L)m‑B‑D‑与R2组合如表4所示。

[0172] 表4：3’MVIP的(XL)m‑B‑D‑与R2组合

[0173]

[0174]

[0175] 本发明提供的RNA抑制剂结构中的正义链和反义链链长为15‑30，优选19‑23，彼此之间至少85％碱基互补。为了增强正义链和反义链在体内的稳定性，RNA抑制剂的正义链和反义链可以在没有影响活性甚至增强活性的情况下进行修饰，其中的核苷酸可以有修饰基团，可以整条链或者部分修饰，优选全部修饰。所述修饰为本领域的研究者易于理解的技术，可以在糖基部分，选至如下任一种或多种：脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2’‑修饰核苷酸、3’至3’连接(倒置)核苷酸、含非天然碱基的核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸(PNA)、解锁的核碱基类似物、锁定核苷酸、3’‑O‑甲氧基(2’核苷间连接)核苷酸、2’‑F‑阿拉伯糖核苷酸、5’‑Me/2’‑氟带核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含乙烯基膦酸酯的核苷酸和含环丙基膦酸酯的核苷酸。其中，2’‑修饰核苷酸包括但不限于：2’‑O‑甲基核苷酸、2’‑脱氧‑2’‑氟核苷酸、2’‑脱氧核苷酸、2’‑甲氧基乙基核苷酸、2’‑氨基核苷酸和2’‑烷基核苷酸。在本发明提供的RNA抑制剂中，所述RNA抑制剂的正义链和反义链均不需要均匀修饰，可在其单个核苷酸中掺入一种以上的修饰。所述的修饰也可在碱基部分发生，经修饰的核碱基包括合成和天然的核碱基，诸如5‑取代嘧啶，6‑氮杂嘧啶和N‑2/N‑6和O‑6取代嘌呤，5‑甲基胞嘧啶，5‑羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2‑氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6‑烷基，腺嘌呤和鸟嘌呤的2‑烷基和其他烷基衍生物，2‑硫代尿嘧啶，2‑硫代胸腺嘧啶，2‑硫代胞嘧啶，5‑卤代尿嘧啶，胞嘧啶，5‑丙炔基尿嘧啶，5‑丙炔基胞嘧啶，6‑偶氮尿嘧啶，6‑偶氮胞嘧啶，6‑偶氮胸腺嘧啶，5‑尿嘧啶，4‑硫尿嘧啶，8‑卤素、8‑氨基、8‑巯基、8‑硫代烷基、8‑羟基和其他8‑取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5‑卤、5‑三氟甲基和其他5‑取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7‑甲基鸟嘌呤和7‑甲基腺嘌呤，8‑氮鸟嘌呤和8‑氮杂腺嘌呤，7‑脱氮鸟嘌呤，7‑脱氮腺嘌呤，3‑脱氮鸟嘌呤和3‑脱氮腺嘌呤。

[0176] 本发明所述的RNA抑制剂的正义链和反义链的部分或全部是2’‑O‑甲基核苷酸和/或2’‑脱氧‑2’‑氟核苷酸，且至少连续两个硫代磷酸酯键存在其正义链5’端和反义链3’端的核苷酸之间，优选末端3个连续的核苷酸之间磷酸酯键被硫代。

[0177] 在本发明提供的RNA抑制剂中，当其一条单链上有3’MVIP时，与这条单链相互补的另外一条单链相应的有5’MVIP或3’MVIP或者没有；当所述RNA抑制剂的一条单链上有5’MVIP时，与其相互补的另外一条单链相应的有3’MVIP或5’MVIP或者没有。5’MVIP和3’MVIP也可以同时连接在正义链或反义链的对应末端，即正义链的5’末端有5’MVIP时，其3'末端也可以有3'MVIP；反义链的5’末端有5’MVIP时，其3'末端也可以有3'MVIP。或者，5’MVIP同时放在正义链和反义链的5’末端。或者，3’MVIP同时放在正义链和反义链的3’末端。

[0178] 在一些实施方案中，优选下表5中不同5'MVIP和3'MVIP组合接入RNA抑制剂的正义链和或反义链的不同位置，考察对HBV的HBsAg水平的影响。

[0179] 表5：5'MVIP与3'MVIP的组合

[0180]

[0181]

[0182] 在一些实施方案中，本发明所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐优选以羧酸盐、钠盐、三乙胺盐或其它可药用盐的形式制备或合成。

[0183] 在一些实施方案中，所述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐更优选为其钠盐或三乙胺盐。

[0184] 在一些实施方案中，所述RNA抑制剂的正义链选自下表6：

[0185] 表6：RNA抑制剂的正义链

[0186]

[0187]

[0188] 在一些实施方案中，本发明所述的RNA抑制剂的正义链与表6中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸。

[0189] 在一些实施方案中，所述RNA抑制剂的反义链选自下表7：

[0190] 表7：RNA抑制剂的反义链

[0191]

[0192]

[0193] 在一些实施方案中，本发明所述的RNA抑制剂的反义链与表7中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸。

[0194] 在一些体内外效果考察实施方案中，所述RNA抑制剂的正义链或反义链选自下表8：

[0195] 表8：RNA抑制剂的正义链或反义链

[0196]

[0197]

[0198] 在一些实施方案中，本发明所述的RNA抑制剂的正义链或反义链与表8中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸。

[0199] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15评估将5'MVIP和3'MVIP放在正义链(SEQ ID NO:2)和/或反义链(SEQ ID NO:59)对应末端，评估所得RNA抑制剂对HBV的HBsAg水平降低效果影响。RNA抑制剂代码、所含的单链及SEQ ID NO.如下表9：

[0200] 表9

[0201]

[0202]

[0203]

[0204]

[0205] 在一些实施方案中，优选出组合5’MVIP01/3'MVIP01、5’MVIP01/3'MVIP17、5’MVIP09/3'MVIP09放在正义链的5’末端和反义链的3’末端。

[0206] 在一些实施方案中，优选出5’MVIP01/3'MVIP09、5’MVIP09/3'MVIP01放在正义链的5’末端和3’末端。

[0207] 另一方面，本发明还提供了一种上述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗肝源性疾病的药物中的应用，其中，所述肝源性疾病包括但不限于肝炎、肝肿瘤、肝硬化、黄疸、二型糖尿病、脂肪肝、血液系统的凝血性疾病、血液白蛋白及球蛋白相关的疾病、高血脂、动脉粥样硬化、原发性高血压。

[0208] 再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括上述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料，其剂型为口服剂、静脉注射剂或者皮下或肌内注射剂，优选为皮下注射剂。

[0209] 又一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐和其他治疗乙型肝炎的药物。其他治疗乙型肝炎药物，包括但不限于已在临床上使用的核苷类似物或干扰素类，也包括在研当中的一些候选乙肝治疗药物，如免疫调节剂在一个实施方案中，在转基因小鼠模型上比对了本发明所述的RNA抑制剂与当前慢性乙肝治疗所用的一线用药替诺福韦对HBV的HBsAg的抑制效果。试验结果证实了，抗乙肝药物核苷类似物对HBV HBsAg没有抑制效果，联合使用时，也不影响本发明所述的RNA抑制剂对HBsAg的抑制效果。

[0210] 在一些实施方案中，本发明所述的RNA抑制剂与当前慢性乙肝治疗所用的一线用药恩替卡韦或干扰素进行联合使用，考察对HBV的抑制效果及是否有相互干扰作用。试验在广泛使用的HepG2.2.15细胞株中评估了本发明所述的RNA抑制剂与不同浓度的恩替卡韦或干扰素联合用给药对HBV的抑制效果。

[0211] 在一些实施方案中，使用阴性对照siRNA，正义链为SEQ ID NO.:146，反义链为SEQ ID NO.:147，考察本发明的RNA抑制剂对HBV 4种常见的亚型A、B、C和D型的抑制效果。

[0212] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了5'MVIP和/或3'MVIP结构中X、L、B、D、R1和R2不同对所述RNA抑制剂正义链(SEQ ID NO:2)、反义链(SEQ ID NO:59)对应末端，评估所得RNA抑制剂对HBV的HBsAg水平降低效果影响，当X、L、B、D、R1和R2之一不同时，相应的5'MVIP和/或3'MVIP中其它部分与5’MVIP09/3’MVIP09的相同。

[0213] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了不同肝靶向特异性配体X对所述的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响：

[0214] 表10

[0215]

[0216] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了不同支链L对所述的RNA抑制剂作用效果的影响：

[0217] 表11

[0218]

[0219]

[0220] 备注：标有*的RNA抑制剂，表示在同一个5'MVIP或3'MVIP结构中或5'MVIP与3'MVIP彼此L结构不同。

[0221] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了接头B对所述的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响：

[0222] 表12

[0223]

[0224]

[0225]

[0226]

[0227]

[0228]

[0229]

[0230] 备注：标有*的RNA抑制剂，表示5'MVIP与3'MVIP彼此之间的接头B结构不同。

[0231] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了连接链D对所述的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响：

[0232] 表13

[0233]

[0234]

[0235] 备注：标有*的RNA抑制剂，表示5'MVIP与3'MVIP彼此之间的连接链D结构不同。

[0236] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了不同转接点R1对所述的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响：

[0237] 表14

[0238]R1代码 RNA抑制剂代码 R1结构
R1‑1 Ky‑22 ‑NH(CH2)6O‑
R1‑2 Ky‑22‑R1‑1 ‑O(CH2)6O‑
R1‑3 Ky‑22‑R1‑2 ‑S(CH2)6O‑
R1‑4 Ky‑22‑R1‑3 ‑NH(CH2)8O‑
R1‑5 Ky‑22‑R1‑4 ‑NH(CH2)5CH(CH2CH3)O‑
R1‑6 Ky‑22‑R1‑5 ‑S(CH2)4CH(CH3)O‑

[0239] 在一些实施方案中，使用细胞株HepG2.2.15考察了不同转接点R2对所述的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响：

[0240] 表15

[0241]

[0242]

[0243] 在一些实施方案中，对本发明所述的RNA抑制剂Ky‑22的序列进行了进一步优化调整，包括序列mer数、容许的核苷酸可相差个数、氟代及末端硫代个数的考察，这些调整对所述的RNA抑制剂在降低HBsAg水平效果及效果持续性的影响，序列见表16。

[0244] 表16：Ky‑22的序列调整表

[0245]

[0246] 实施方案结果显示，与Ky‑22相比较，正义链长度为21‑mer的Ky‑2201在降低HBsAg水平及效果持续性上并没有显著提高，甚至稍微降低了一些，所以本发明提供的RNA抑制剂正义链长最优选19‑mer；与Ky‑22相比较，正义链和反义链中各有一个核苷酸变化的Ky‑2203，其降低HBsAg水平及效果持续性上并没有明显影响；在Ky‑2203设计的基础上，正义链长度为21‑mer的Ky‑2204与Ky‑2203的作用效果无显著差异；在Ky‑2203基础上调整氟代个数，氟代个数相对少的Ky‑2208的作用效果稍稍优于Ky‑2203；改变Ky‑2204正义链3'末端的两个悬垂核苷酸得到的RNA抑制剂Ky‑2205和改变Ky‑22反义链3'末端的两个核苷酸得到的RNA抑制剂Ky‑2206以及改变Ky‑2201正义链3'末端的两个悬垂核苷酸得到的RNA抑制剂Ky‑
2202与变换前作用效果无显著差异，说明本发明的RNA抑制剂容许正义链或反义链各出现1至3个的核苷酸的相差。与Ky‑22相比较，正义链的5'末端和反义链3'末端的连续三个核苷酸之间的磷酸酯键的硫代被取消所得的Ky‑2207在降低HBsAg水平效果及效果持续时间上影响显著。

[0247] 本发明优选正义链的链长为19‑mer、反义链的链长为21‑mer的序列，允许其中有1至3个核苷酸的差异。

[0248] 在一些实施方案中，将所述的RNA抑制剂Ky‑2208与核苷类似物替诺福韦(TDF)在转基因小鼠模型中进行了抗乙肝病毒药效比对及联合用药的研究，实施结果显示替诺福韦(TDF)不具有减少HBsAg的功效，Ky‑2208可以高效地降低HBsAg的水平，最高可以降低99.98％，与替诺福韦(TDF)合用，本发明的RNA抑制剂的效果不受影响。

[0249] 在一些实施方案中，考察了本发明提供的RNA抑制剂中的Ky‑08、Ky‑10、Ky‑19、Ky‑13、Ky‑21、Ky‑22、Ky‑23、Ky‑26、Ky‑27、Ky‑29、Ky‑37及Ky‑39对HBV转基因小鼠模型的HBsAg的抑制效果。实施结果显示，其中RNA抑制剂Ky‑19、Ky‑26、Ky‑37和Ky‑39在HBV转基因小鼠体内可以至少连续4周使HBsAg的表达水平减少93.0％‑99.5％以上。

[0250] 在一些实施方案中，本发明所提供的RNA抑制剂Ky‑2208在AAV‑HBV小鼠体内可以持续140天左右使HBsAg水平减少98.2‑99.6％，并使其体内产生表面抗体HBsAb，显示功能性治愈乙型肝炎的可能。

附图说明

[0251] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0252] 图1为实施例一1.1.5中合成的ERCd‑01‑c2的高分辨质谱图；

[0253] 图2为实施例一1.2.6中合成的3’MVIP17‑c1的高分辨质谱图；

[0254] 图3为实施例一2.1.2中合成的5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c2的高分辨质谱图；

[0255] 图4为实施例二实施例1中的Ky‑00～Ky‑26对细胞株HepG2.2.15中HBsAg水平抑制效果图；

[0256] 图5为实施例二实施例2中的Ky‑27～Ky‑44对细胞株HepG2.2.15中HBsAg水平抑制效果图；

[0257] 图6为实施例二实施例3、4和6中不同X/L/D对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响；

[0258] 图7为实施例二实施例5中接头B对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响图；

[0259] 图8为实施例二实施例7和8中不同转接点R1/R2对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响图；

[0260] 图9为实施例二实施例9中Ky‑22与恩替卡韦或干扰素联用对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制效果图；

[0261] 图10为实施例二实施例9中Ky‑22与恩替卡韦或干扰素联用对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制效果图；

[0262] 图11为实施例二实施例9中Ky‑22与恩替卡韦或干扰素联用对HepG2.2.15细胞中HBV DNA抑制效果图；

[0263] 图12为实施例二实施例10中Ky‑22对4种不同基因型(A、B、C、D)HBV细胞株的抑制效果图；

[0264] 图13为实施例三实施例1中的RNA抑制剂对HBV转基因小鼠模型的HBsAg抑制效果图；

[0265] 图14为实施例三实施例2中的Ky‑22序列调整对HBV转基因小鼠HBsAg的抑制效果图；

[0266] 图15为实施例三实施例3中的Ky‑2208在AAV‑HBV小鼠模型上的剂效考察的结果图；

[0267] 图16为实施例三实施例3中的Ky‑2208在AAV‑HBV小鼠模型上产生的HBsAb柱状图；

[0268] 图17为实施例三实施例4中的Ky‑2208与TDF在HBV‑Tg小鼠上比对及联合用药研究的结果图。

具体实施方式

[0269] 以下实施例说明了本发明公开的一些实施方案，但并不局限于这些。此外，在提供具体实施方案时，本发明人预期了那些具体实施方案的应用。例如具有具体同类或类似化学结构的RNA抑制剂，用于不同的肝源性疾病的治疗。

[0270] 说明：

[0271] DMSO的中文名称为二甲基亚砜；

[0272] DMF的中文名称为N,N‑二甲基甲酰胺；

[0273] HOBt的中文名称为1‑羟基苯并三氮唑；

[0274] HBTU的中文名称为O‑苯并三氮唑‑四甲基脲六氟磷酸酯；

[0275] DIPEA(DIEA)的中文名称为N,N‑二异丙基乙胺；

[0276] DCM的中文名称为二氯甲烷；

[0277] DMAP的中文名称为4‑二甲氨基吡啶；

[0278] DMT‑CL的中文名称为4,4'‑二甲氧基三苯基氯甲烷；

[0279] MEOH的中文名称为甲醇；

[0280] TBTU的中文名称为O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸；

[0281] 的名称为固相载体，如大孔氨甲基树脂(Resin)。

[0282] 实施例一、RNA抑制剂Ky‑19、Ky‑22、Ky‑2208、Ky‑26、Ky‑37和Ky‑39的合成[0283] 本发明所述的RNA抑制剂是通过固相亚磷酰胺法得到各自的正义链和反义链，正义链与对应的反义链互补退火得到终产品。固相亚磷酰胺法基本步骤包括：1)脱保护：脱掉起始单体Solid Support羟基保护基(DMTr)；2)偶联：加上第一个亚磷酰胺单体，通过3’至
5’方向发生偶联反应；3)氧化：将所得的核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即三价磷氧化成五价磷)；4)封闭：将没有反应的前一步核苷酸单体5’‑OH加冒封死，使其不再进一步参与反应；重复上述步骤，直至最后一个亚磷酰胺单体的接入。然后用甲胺水溶液和氨水裂解Solid Support与起始单体之间酯键，并将所得寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基氰乙基(P)、苯甲酰基(mA、fA)、乙酰基(mC)脱掉。经HPLC分离纯化后，过滤除菌，冻干得到相应的正义链或反义链。

[0284] 退火精确测定正义链和反义链复溶溶液的浓度，按等摩尔浓度进行混合后，加入该体积1/20体积的1M PBS溶液再次混匀，将混合体系加热至95℃，持续5min，然后自然降温3h至40℃或者室温时，进行HPLC检测，若单链残余＜5％即可认为反应完成。

[0285] 当本发明的RNA抑制剂的正义链或反义链的3'端有3'MVIP时，3'MVIP的solid support作为固相合成的起始单体，3’MVIP的solid spport通式如下：

[0286]

[0287] m为1‑4时，通式中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的3’MVIP的Solid Support。

[0288] 当m为1时，所得的Solid Support作为RNA抑制剂Ky‑26的反义链和Ky‑39正义链固相合成的起始单体；当m为2时，所得的Solid Support作为RNA抑制剂Ky‑37的正义链和Ky‑22和Ky‑2208的反义链的固相合成起始单体；当m为3时，所得的Solid Support作为RNA抑制剂Ky‑19的反义链的固相合成起始单体。

[0289] 当本发明的RNA抑制剂的正义链或反义链的5'端有5’MVIP时，5’MVIP亚磷酰胺单体是作为正义链或反义链固相合成的最后一个亚磷酰胺单体。5’MVIP亚磷酰胺单体通式如下：

[0290]

[0291] n为1‑4时，通式中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的5’MVIP亚磷酰胺单体。

[0292] 当n为1时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为RNA抑制剂Ky‑19、Ky‑26和Ky‑37的正义链固相合成的最后一个单体；当n等于2时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Ky‑39、Ky‑22和Ky‑2208的正义链固相合成的最后一个单体。

[0293] 本发明所述的这些RNA抑制剂的正义链和反义链在进行亚磷酰胺固相合成之前，需要先化学合成相应的3’MVIP的Solid Support和5’MVIP亚磷酰胺单体。化学合成过程叙述如下：

[0294] 1. 3’MVIP的Solid Support的合成

[0295] 1.1 RNA抑制剂Ky‑37的正义链、Ky‑22和Ky‑2208的反义链的3'MVIP09的Solid Support的合成

[0296]

[0297] 3'MVIP09的Solid Support

[0298] 合成过程描述：

[0299] 1.1.1.ERC‑01‑c1的合成

[0300]

[0301] 称取2‑氨基‑1,3‑丙二醇(5.0g，54.9mmol)加入DMSO 50mL，氢氧化钠溶液(1g/mL)5mL，降温到0℃，滴加丙烯酸叔丁酯(20mL，137.8mol)2小时加完，室温反应48h，加石油醚(100mL)，饱和食盐水洗2次，有机层干燥。过层析柱(洗脱液：乙酸乙酯:石油醚＝25％‑
75％)，上柱加0.05％的三乙胺，得无色油状物6.2g。

[0302] 1.1.2.ERC‑01‑c2的合成

[0303]

[0304] 称取ERC‑01‑c1(6.2g，17.9mmol)，加二氯甲烷50mL，碳酸钠溶液(25％)23mL，室温滴加氯甲酸苄酯(8.2mL，57.4mmol)，2小时滴加完，室温反应过夜，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，过层析柱(乙酸乙酯:石油醚＝5％‑30％)得油状物4.0g。

[0305] 1.1.3.ERC‑01‑c3的合成

[0306]

[0307] 取ERC‑01‑c2(4.0g，8.3mmol)加甲酸12mL，室温反应过夜，减压蒸干溶剂，得产品2.8g。

[0308] 1.1.4.ERCd‑01‑c1的合成

[0309]

[0310] 将化合物ERC‑01‑c3(1.11g，3.0mmol)和dlSANC‑c4(3.6g，8.04mmol)加到DMF(60mL)中，然后加入HOBt(2.24g)和HBTU(3.36g)，然后缓慢加入DIEA(4.16mL)。反应液室温下搅拌反应3小时。然后加入水，水层用二氯甲烷萃取(2x10mL)。合并有机层，然后依次用饱和碳酸氢钠(80mL)、水(2x60mL)、饱和食盐水(60mL)洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析纯化(洗脱液：3‑15％MeOH in DCM)。得淡黄色固3.24g。

[0311] 1.1.5.ERCd‑01‑c2的合成

[0312]

[0313] ERCd‑01‑c1(3.24g，2.6mmol)用甲醇(60mL)溶解，加入10％钯碳(0.3g)，乙酸(2.0mL)。然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干，得油状物ERCd‑01‑c22.9g，其高分辨质谱图见图1。

[0314] 1.1.6. 3’MVIP09‑c1的合成

[0315]

[0316] 向反应瓶内依次加入SANCd‑01‑c0(0.824g，1.5mmol)和ERCd‑01‑c2(1.09g，1.0mmol)，再加入10mL的DCM，搅拌溶解，再依次加入TBTU(0.963g)和DIPEA(0.517g)，反应过夜，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和食盐水洗涤，干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得产品1.3g。

[0317] 1.1.7. 3’MVIP09‑c2的合成

[0318]

[0319] 向反应瓶内依次加入3’MVIP09‑c1(1.62g，1μmol)和10mL的DCM，室温搅拌溶解，再依次加入DMAP(0.366g)和丁二酸酐(0.2g，3μmol)，室温搅拌反应，TLC分析，反应合格浓缩掉DCM，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到产品为1.55g。

[0320] 1.1.8. 3’MVIP09的Solid Support合成

[0321]

[0322] 向反应瓶内依次加入3’MVIP09‑c2(0.86g，0.5μmol)和10mL DMF，溶解，再依次加入HBTU(0.19g)、DIPEA(0.194g)和大孔氨甲基树脂(2.0g)，摇床24h，过滤，树脂用10％甲醇/DCM洗涤，再用25％醋酸/吡啶进行封端，取代度150μmol/g。

[0323] 1.2 RNA抑制剂Ky‑19的反义链的3'MVIP17的Solid Support的合成

[0324]

[0325] 3'MVIP17 Solid Support

[0326] 1.2.1.SANC‑01‑c1的合成

[0327]

[0328] 合成步骤参照实施例1中1.1.1.ERC‑01‑c1的合成。

[0329] 1.2.2.SANC‑01‑c2的合成

[0330]

[0331] 合成步骤参照实施例1中1.1.2.ERC‑01‑c2的合成。

[0332] 1.2.3.SANC‑01‑c3的合成

[0333]

[0334] 合成步骤参照实施例1中1.1.3.ERC‑01‑c3的合成。

[0335] 1.2.4.SANCd‑01‑c1的合成

[0336]

[0337] 合成步骤参照实施例1中1.1.4.ERCd‑01‑c1的合成。

[0338] 1.2.5.SANCd‑01‑c2的合成

[0339]

[0340] 合成步骤参照实施例1中1.1.5.ERCd‑01‑c2的合成。

[0341] 1.2.6. 3’MVIP17‑c1的合成

[0342]

[0343] 合成步骤参照实施例1中1.1.6.3’MVIP09‑c1的合成，合成所得3’MVIP17‑c1的高分辨质谱图见图2。

[0344] 1.2.7. 3’MVIP17‑c2的合成

[0345]

[0346] 合成步骤参照实施例1中1.1.7.3’MVIP09‑c2的合成。

[0347] 1.2.8. 3’MVIP17的Solid Support合成

[0348]

[0349] 合成步骤参照实施例1中1.1.8 3’MVIP09的Solid Support合成。

[0350] 1.3RNA抑制剂Ky‑26的反义链和Ky‑39正义链的3'MVIP01的Solid Support的合成：

[0351]

[0352] 3'MVIP01 Solid Support

[0353] 合成过程描述：

[0354] 1.3.1. 3’MVIP01‑c1的合成

[0355]

[0356] 合成步骤参照实施例1中1.1.6.3’MVIP09‑c1的合成。

[0357] 1.3.2. 3’MVIP01‑c2的合成

[0358]

[0359] 合成步骤参照实施例1中1.1.7.3’MVIP09‑c2的合成。

[0360] 1.3.3. 3’MVIP01的Solid Support合成

[0361]

[0362] 合成步骤参照实施例1中1.1.8.3’MVIP09的Solid Support合成。

[0363] 2. 5’MVIP亚磷酰胺单体的合成

[0364] 2.1当n为2时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Ky‑22、Ky‑2208、Ky‑39正义链固相合成的最后一个单体5’MVIP09亚磷酰胺单体的合成：

[0365]

[0366] 5'MVIP09亚磷酰胺单体

[0367] 2.1.1. 5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c1的合成

[0368]

[0369] 称量ERCd‑01‑c2(2.18g，2.0mmol)溶于DMF(50mL)，加戊二酸单苄酯(0.53g，2.4mmol)、DIPEA(0.78g)与TBTU(0.84g)，室温搅拌过夜，加水淬灭(50mL)，DCM(30mL*3)萃取，10％柠檬酸(50mL*3)、饱和碳酸氢钠50mL和吡啶100mL洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸，过柱纯化得产品5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c1(2.15g)。

[0370] 2.1.2. 5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c2的合成

[0371]

[0372] 称量5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c1(2.15g，1.66mmol)和10％钯碳(0.21g)，加甲醇(50mL)，室温搅拌加氢过夜，反应结束后硅藻土过滤钯碳，旋蒸得5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c2粗品(1.9g)，其高分辨率质谱图如图3所示。

[0373] 2.1.3. 5’MVIP09‑ERCd‑PFP的合成

[0374]

[0375] 称量5’MVIP09‑ERCd‑PFP‑c2粗品(1.9g，1.58mmol)溶于DCM(60mL)，加DIPEA(1.33g)，冷却，加三氟乙酸五氟苯酚酯(2.21g，7.9mmol)，室温搅拌反应2h后旋蒸，再溶于DCM(60mL)，饱和碳酸氢钠(30mL*3)、10％柠檬酸(30mL*1)、饱和食盐水(50mL*1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得5’MVIP09‑ERCd‑PFP粗品(2.35g)，抽干后无纯化直接用于下一步反应。

[0376] 2.1.4. 5’MVIP09亚磷酰胺单体‑c1的合成

[0377]

[0378] 5’MVIP09‑ERCd‑PFP粗品(2.35g，1.58mmol)溶于DCM(60mL)，加DIPEA(0.82g，6.32mmol)、6‑氨基‑1‑己醇(0.37g，3.16mmol)，室温搅拌反应过夜。加10％柠檬酸(30mL)，DCM(30mL*3)萃取，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、旋蒸，过柱纯化得产品
5’MVIP09单体‑c1(1.73g)。

[0379] 2.1.5. 5’MVIP09亚磷酰胺单体

[0380]

[0381] 称量5’MVIP09亚磷酰胺单体‑c1(1.3g、1.0mmol)溶于乙腈(30mL)，加入二异丙胺三氮唑(0.22g)，冰浴下滴加双‑(二异丙基氨基)(2‑氰基乙氧基)膦(0.36g，1.2mmol)，室温反应4h，HPLC中控，反应合格后，浓缩过柱纯化得到产品5’MVIP09单体(1.2g)。

[0382] 2.2当n为1时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Ky‑19、Ky‑26、Ky‑37的正义链固相合成的最后一个单体5'MVIP01的亚磷酰胺单体的合成：

[0383]

[0384] 5'MVIP01亚磷酰胺单体

[0385] 5'MVIP01的亚磷酰胺单体称量YICd‑01‑c2(1.12g，2.0mmol)，剩余操作参照2.1.1.～2.1.5.。

[0386] 实施例二：体外试验

[0387] 实施例1：使用细胞株HepG2.2.15评估5'MVIP和3'MVIP与正义链和反义链不同末端偶联所得的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果。

[0388] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂Ky‑00～Ky‑26，配制含10％胎牛血清的DMEM培养基。用培养液配制含0.05、0.5、5nM RNA抑制剂样品的培养基。5
以10细胞密度接种HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加不同浓度的上述RNA抑制剂样品干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0389] 所得试验数据见图4。如图4所示，其中Ky‑19、Ky‑22和Ky‑26对HBsAg的抑制效果优于其它化合物。

[0390] 实施例2：使用细胞株HepG2.2.15评估5'MVIP和3'MVIP同时放在RNA抑制剂的正义链或反义链的两个末端上或5'MVIP或3'MVIP同时放在反义链和正义链的同一个末端，如3’末端或5’末端，考察所得的RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果。

[0391] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂Ky‑27～Ky‑44，配制含10％胎牛血清的DMEM培养基。用培养液配制含0.05、0.5、5nM RNA抑制剂样品的培养基。5
以10细胞密度接种HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加不同浓度的上述RNA抑制剂样品干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。所得试验数据见图5。

[0392] 如图5所示，其中Ky‑37和Ky‑39对HBsAg的抑制效果优于其它化合物。

[0393] 实施例3使用细胞株HepG2.2.15评估不同肝靶向特异性配体X对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响

[0394] 考察不同肝靶向特异性配体X对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响，所得的RNA抑制剂中Ky‑22、Ky‑22‑X2～Ky‑22‑X6除X结构改变外，L、B、D及R1/R2与组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致。

[0395] 试验所涉及的RNA抑制剂中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0396] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂，配制含10％胎牛血5
清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑制剂样品的培养基。以10 细胞密度接种
HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0397] 所得试验数据见图6。结果表明，当X分别为半乳糖、半乳糖胺、N‑乙酰半乳糖胺及其衍生物时，所得RNA抑制剂优选N‑乙酰半乳糖胺及其衍生物作为配体。

[0398] 实施例4使用细胞株HepG2.2.15评估不同支链L对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响

[0399] 考察不同支链L对RNA抑制剂降低HBV HBsAg水平效果的影响，所得RNA抑制剂中Ky‑22、Ky‑22‑L2～Ky‑22‑L14除L结构改变外，X、B、D及R1/R2与组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致。

[0400] 试验所涉及的RNA抑制剂中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0401] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂，配制含10％胎牛血5
清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑制剂样品的培养基。以10 细胞密度接种
HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0402] 所得试验数据见图6。结果表明，L的长短对RNA抑制剂的作用效果影响较大，L链不能太短也不能太长；当含有‑NH‑、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、脂肪族碳环基如环己烷或者这些基团的组合时，或者在同一个5'MVIP、3'MVIP结构中或5'MVIP与3'MVIP彼此L结构不同、在链长为C7‑C18这个范围，所得RNA抑制剂对HBV的HBsAg水平降低效果相差不大。

[0403] 实施例5使用细胞株HepG2.2.15评估接头B对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响

[0404] 考察不同接头B对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响，所得RNA抑制剂Ky‑22、Ky‑22‑B2～Ky‑22‑B7、Ky‑19、Ky‑19‑B2～Ky‑19‑B12、Ky‑26、Ky‑26‑B2～Ky‑26‑B7、Ky‑
37、Ky‑37‑B2～Ky‑37‑B6、Ky‑39、Ky‑39‑B2～Ky‑39‑B6，除B结构改变外，X、L、D及R1/R2与组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致。

[0405] 试验所涉及的RNA抑制剂中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0406] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂，配制含10％胎牛血5
清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑制剂样品的培养基。以10 细胞密度接种
HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0407] 所得试验数据见图7。结果表明，除接头B结构改变外，而X、L、D及R1/R2与组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致时，接头B中通式中的A1和A2各自独立地是C、O、S、‑NH‑、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0‑4的整数，并且接头B在5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同时，对HBsAg水平降低效果相差不大。

[0408] 实施例6使用细胞株HepG2.2.15评估连接链D对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响

[0409] 考察不同连接链D对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响，所得RNA抑制剂Ky‑22、Ky‑22‑D2～Ky‑22‑D5除D结构改变外，X、L、B及R1/R2与最优选MVIP组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致。

[0410] 试验所涉及的RNA抑制剂中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0411] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂，配制含10％胎牛血5
清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑制剂样品的培养基。以10 细胞密度接种
HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0412] 所得试验数据见图6。结果表明，在MVIP结构及RNA抑制剂相同的情况下，不同的连接链D会对RNA抑制剂抑制HBsAg的效果有影响，其中D1、D2、D4的效果接近且优于D3。

[0413] 实施例7：使用细胞株HepG2.2.15评估不同R1对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响

[0414] 考察不同转接点R1对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响，所得RNA抑制剂Ky‑22、Ky‑22‑R1‑1～Ky‑22‑R1‑5除R1结构改变外，X、L、B、D及R2与最优选MVIP组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致。

[0415] 试验所涉及的RNA抑制剂中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0416] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂，配制含10％胎牛血5
清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑制剂样品的培养基。以10 细胞密度接种
HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0417] 所得试验数据见图8。结果表明，不同的转接点R1会对RNA抑制剂抑制HBsAg的效果有影响，其中R1‑1作为转接点的降低HBsAg水平效果最佳。

[0418] 实施例8：使用细胞株HepG2.2.15评估不同R2对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响

[0419] 考察不同转接点R2对RNA抑制剂降低HBV的HBsAg水平效果的影响，所得RNA抑制剂Ky‑22、Ky‑22‑R2‑1～Ky‑22‑R2‑11除R2结构改变外，X、L、B、D及R1与最优选MVIP组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致。按实施例一所述的方法制备得到相应的RNA抑制剂。

[0420] 试验所涉及的RNA抑制剂中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0421] 试验过程描述：按实施例一所述的方法制备相应的RNA抑制剂，配制含10％胎牛血5
清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑制剂样品的培养基。以10 细胞密度接种
HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清，用HBsAg检测试剂盒(上海科华，ELISA法)，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg相对百分率。

[0422] 所得试验数据见图8。结果表明，不同的转接点R2会对RNA抑制剂降低HBsAg水平的效果有影响，其中R2‑1作为转接点时的降低HBsAg水平效果最佳。

[0423] 实施例9 Ky‑22与当前慢性乙肝治疗所用的一线用药恩替卡韦或干扰素联合使用，考察对HBV的抑制效果是否有相互干扰作用

[0424] 试验在广泛使用的HepG2.2.15细胞株中评估了本发明所述的RNA与不同浓度的恩替卡韦(ETV)或干扰素(IFN‑a)联合用给药对HBV的抑制效果。

[0425] 试验所涉及的RNA抑制剂Ky‑22中的正义链为SEQ ID NO:2，反义链为SEQ ID NO:59，正义链5'末端偶联5'MVIP，反义链3'末端偶联3'MVIP。

[0426] 试验过程描述：配制含10％胎牛血清的DMEM培养基。用培养液配制含10nM RNA抑5
制剂Ky‑22样品的培养基。以10 细胞密度接种HepG2.2.15细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，
37℃，5％CO2，培养24h后，加药干预，孵育72h后，取上清检测HBsAg、HBeAg、HBV DNA，与未干预HepG2.2.15细胞上清对比，标定样品干预组的HBsAg、HBeAg、HBV DNA相对百分率。

[0427] 加药浓度为：

[0428] ETV：10μM、1μM、0.1μM；

[0429] IFN‑a：1000IU/mL、100IU/mL、10IU/mL；

[0430] Ky‑22：0.125μg/mL；

[0431] ETV+Ky‑22：10μM+0.125μg/mL、1μM+0.125μg/mL、0.1μM+0.125μg/mL；

[0432] IFN‑a+Ky‑22：1000IU/mL+0.125μg/mL、100IU/mL+0.125μg/mL、10IU/mL+0.125μg/mL

[0433] RNA抑制剂Ky‑22对HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg水平的影响分别如图9和图10所示。结果表明，单独使用恩替卡韦或干扰素对HBsAg和HBeAg无显著抑制效果，恩替卡韦或干扰素联合使用Ky‑22则对HBsAg和HBeAg表现出显著抑制效果，且抑制程度与恩替卡韦或干扰素的浓度没有相关性。恩替卡韦或干扰素不会影响本发明的RNA抑制剂的对HBsAg和HBeAg的效果；RNA抑制剂Ky‑22与恩替卡韦或干扰素联合使用，也不影响恩替卡韦或干扰素对HBV DNA的抑制效果，甚至会强化干扰素对HBV DNA的作用效果，数据结果见图11。本发明的RNA抑制剂可以和恩替卡韦和干扰素联合使用。

[0434] 实施例10 Ky‑22对4种不同基因型(A、B、C、D)HBV细胞株的抑制效果研究

[0435] 试验过程描述：

[0436] 细胞株构建：选择在HepG2细胞的基础上，用sleeping beauty的转座子系统进行HBV基因的整合；细胞培养条件：DMEM+10％FBS，37℃、5％CO2。4种不同基因型(A、B、C、D)的HBV1.3倍体基因通过Gibson Master Mix连接到PT2/HB载体上，同时连接红色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因，作为细胞株筛选时的标记；构建好的质粒分别与pCMV(CAT)T7‑SB100用转染试剂X‑tremeGENE HP DNA Transfection Reagent共转染到HepG2细胞中，转染方法为：按说明书配制好一块10cm培养皿的细胞转染所需的转染体系，静止20min，将汇合度达到70％的HepG2细胞消化成细胞悬液，加入配制好的转染体系，混合均匀后放入培养箱培养。转染后48h用2μg/mL嘌呤霉素抗性进行筛选，不表达嘌呤霉素抗性的细胞即不整合HBV的细胞死亡，扩增整合HBV的细胞，并通过流式细胞仪分选出红色荧光强度高的细胞，即HBV整合拷贝数高的细胞，获得4种不同基因型的HBV稳定整合细胞株。

[0437] 将对数生长期的A、B、C、D 4种基因型的HBV稳定整合细胞消化成细胞悬液，加入48孔板中(300μl/孔)，每孔约300000个细胞，待细胞汇合度达到70％(约铺板24h后)，加入以下浓度的Ky‑22或者阴性对照siRNA(正义链SEQ ID NO.:146，反义链为SEQ ID NO.:147)：

[0438] 4.1μg/mL、2.2μg/mL、1.1μg/mL、0.6μg/mL、0.3μg/mL、0.15μg/mL、0.0725μg/mL、0.03625μg/mL、0.018125μg/mL、0.0090625μg/mL、0.00453125μg/mL、0.00226563μg/mL、
0.00113281μg/mL、0.000566406μg/mL、0.000283203μg/mL

[0439] 或不加药，分别于24h，48h，72h将上清收集后保存至‑20℃，并更换新鲜不加药的培养基。检测细胞上清中HBsAg的含量。

[0440] 试验数据见图12。结果有显示与阴性对照siRNA处理组(Control)相比，Ky‑22对于A、B、C和D基因型的HBV均具有显著的抑制效果，EC50(ng/mL)分别为22.72、25.45、29.06和23.35。

[0441] 实施例三 体内药效研究

[0442] 实施例1：RNA抑制剂对HBV转基因小鼠模型的HBsAg的降低效果研究

[0443] 按实施例一所述的方法制备得到相应的RNA抑制剂Ky‑08、Ky‑10、Ky‑13、Ky‑19、Ky‑21、Ky‑22、Ky‑23、Ky‑26、Ky‑27、Ky‑29、Ky‑37及Ky‑39，选取65只、雄性、体重25～35g、周龄为8‑10w的HBV转基因小鼠，饲养于符合SPF级标准动物房，湿度16～26℃，温度40～70％，循环光照(明暗各12小时)，自由摄食饮水。

[0444] 动物分组前检测HBV HBsAg，按HBV HBsAg表达量进行随机分组，尽量保持各组HBV HBsAg的平均水平一致。将小鼠分为13组，每组5只，对照组(生理盐水)、给药组1‑给药组12。给药剂量均为3mg/kg，单次给药，给药当天设置为d0，各组小鼠d0按0.04mL/10g皮下注射给予相应受试品液。动物观察时间4‑6周不等，采血时间点d0、d7、d14、d21、d28、d35和d42。各组各采血时间通过小鼠眼眶静脉丛采集全血，3000×g离心5min，取上清，检测HBV HBsAg表达量。

[0445] 将各给药组动物的HBsAg水平归一至给药前和对照组，试验数据如图13所示。

[0446] 研究结果显示，本发明所述的RNA抑制剂在前三周均呈现出对HBV HBsAg水平显著的减少效果，其中最佳的降低率可达99.8％。因与5'MVIP和或3'MVIP偶联的位置不同，各RNA抑制剂对HBsAg的降低效果的持续时间不一致，其中Ky‑19、Ky‑22、Ky‑26、Ky‑29、Ky‑37及Ky‑39在d28仍维持在HBV HBsAg水平减少93％以上的效果，且Ky‑22效果的持续性最好，在d35还维持在HBV HBsAg水平减少91％以上的效果。

[0447] 实施例2：考察Ky‑22序列调整对HBV转基因小鼠HBsAg抑制效果影响

[0448] 按实施例一所述的方法制备得到相应的RNA抑制剂Ky‑22、Ky‑2201～Ky‑2208，选取50只、雄性、体重25～35g、周龄为8‑13w的HBV转基因小鼠，饲养于符合SPF级标准动物房，湿度16～26℃，温度40～70％，循环光照(明暗各12小时)，自由摄食饮水。

[0449] 动物分组前检测HBV HBsAg，按HBV HBsAg表达量进行随机分组，尽量保持各组HBV HBsAg的平均水平一致。将小鼠分为10组，每组5只，对照组(生理盐水)、给药组(9组)。给药剂量均为3mg/kg，单次给药，给药当天设为d0，各组小鼠d0按0.04mL/10g皮下注射给予相应受试品液。动物观察时间6周，采血时间点d0、d7、d14、d21、d28、d35和d42。各组各采血时间通过小鼠眼眶静脉丛采集全血，3000×g离心5min，取上清，检测HBV HBsAg表达量。

[0450]

[0451] 将各给药组动物的HBsAg水平归一至给药前和对照组。

[0452] 试验数据见图14，实施结果显示，与Ky‑22相比较，正义链长度为21‑mer的Ky‑2201在降低HBsAg水平及效果持续性上并没有显著提高，甚至稍微降低了一些，所以本发明提供的RNA抑制剂正义链长最优选19‑mer；与Ky‑22相比较，正义链和反义链中各有一个核苷酸变化的Ky‑2203的，其降低HBsAg水平及效果持续性上并没有明显影响；在Ky‑2203设计的基础上，正义链长度为21‑mer的Ky‑2204与Ky‑2203的作用效果无显著差异；在Ky‑2203基础上调整氟代个数，氟代个数相对少的Ky‑2208的作用效果稍稍优于Ky‑2203；变换正义链或反义链3'末端的两个悬垂核苷酸得到的RNA抑制剂Ky‑2205和Ky‑2206与变换前作用效果无显著差异；说明本发明的RNA抑制剂容许正义链和反义链各出现1至3个的核苷酸的相差。与Ky‑22相比较，正义链的5'末端和反义链3'末端的连续三个核苷酸之间的磷酸酯键的硫代被取消所得的Ky‑2207在降低HBsAg水平效果及效果持续时间上影响显著。

[0453] 本发明优选正义链的链长为19‑mer、反义链的链长为21‑mer的序列，允许其中有1至3个核苷酸的差异。

[0454] 实施例3：AAV‑HBV小鼠模型中，考察Ky‑2208的剂效响应、单剂量重复给药对HBsAg的降低效果及是否能产生表面抗体HBsAb

[0455] 试验过程描述：取36只适龄小鼠，屏障设施内饲养约7天，日常观察，无明显异常后进行实验。先将HBV病毒4℃依次解冻，用胰岛素注射器在小鼠尾静脉注射rAAV8‑1.3HBV(五11
加和公司，ayw，病毒批号：A2020051801)，每只小鼠注射1×10 v.g.。在造模后于第4周对动物进行采血、离心和收集血清并检测HBsAg指标。造模后第6周采血检测血清中HBsAg，根据HBsAg的检测结果，挑选30只小鼠随机分5组，尽量保持各组HBsAg的平均水平一致。分组后的第2周开始给药，给药当天采血检测HBsAg，设为d0天。各组给药信息和采血点如下表：

[0456]

[0457] 将各给药组动物的HBsAg水平归一至给药前和对照组，所得试验数据HBsAg和HBsAb分别见图15和图16。

[0458] 试验结果显示，在整个140天的考察期内，Ky‑2208的9mg/kg组可以使AAV‑HBV小鼠模型体内HBsAg水平降低范围在93.1％‑99.6％，重复给药组考察至112天，抑制效果仍保持在95％以上；至98天，单剂量已在HBV模型鼠体内测出表面抗体HBsAb，使小鼠体内产生新的抗HBV免疫力。

[0459] 实施例4：Ky‑2208与当前慢性乙肝治疗所用的一线用药替诺福韦(TDF)比对研究和联合使用，在HBV转基因小鼠模型中考察对HBV的HBsAg抑制效果及是否有干扰作用

[0460] 试验过程描述：HBV‑Tg雄性小鼠，48只，体重25～35g，周龄8‑13w，饲养于符合SPF级标准动物房，湿度16～26℃，温度40～70％，循环光照(明暗各12小时)，自由摄食饮水。化合物配制的溶剂为生理盐水，工作液浓度为0.75mg/mL。动物分组前检测HBV HBsAg，按HBV HBsAg表达量将48只雄性小鼠随机分为6组，每组8只，尽量保持各组HBV HBsAg的平均水平一致。实验共设6个组，分为1个对照组(0.9％生理盐水)和5个给药组。d0天单次给药，各组小鼠d0按0.04mL/10g皮下注射给予相应受试品液。分别在给药前d0，给药后d7、d14、d21、d28通过小鼠眼眶静脉丛采集全血，3000×g离心5min，取上清，d0、d7、d14、d21、d28送样检测HBV HBsAg。

[0461] 具体给药方案见下表：

[0462]

[0463] 备注：sc为皮下注射，po为灌胃。

[0464] 所得试验数据见图17。试验结果证实了核苷类似物抗乙肝药物TDF对HBV HBsAg没有抑制效果，联合使用时，也不影响本发明所述的RNA抑制剂对HBsAg的抑制效果。单用Ky‑2208或Ky‑2208与TDF联合使用，最高分别可以使HBsAg的水平降低99.95％和99.98％。