四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法

摘要

本发明提供了一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，通过重组表达发酵生产复筛，获得能利用天冬氨酸稳定高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌。突变之前的基因簇同等发酵条件产量高了近30%，经过突变，效率进一步得到提升约20%。

权利要求

1.一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，其特征在于：至少包括如下3个基因，分别为：ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇，其特征在于：所述基因簇来源于盐单胞菌株（Halomonas sp.）YL01，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年

4月24日，保藏编号为GDMCC No: 62420。

3.权利要求1或2所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇形成的突变体，其特征在于，包括如SEQ ID NO.4所示、SEQ ID NO.5所示和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

4.权利要求3所述突变体的构建方法，其特征在于，包括：第一步，如权利要求1或2所述的基因簇提取；

第二步，表达载体骨架及上述提取的基因簇PCR扩增；

第三步，重组表达质粒构建；

第四步，突变体构建。

5.包含权利要求1或2所述基因簇或者包含权利要求3所述突变体的表达载体或重组微生物工程菌。

6.权利要求1或2所述基因簇，或者权利要求3所述突变体，或者权利要求5所述表达载体或重组微生物工程菌，在合成四氢嘧啶过程中的应用。

7.采用权利要求5所述重组微生物工程菌生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，利用所述重组微生物工程菌通过全细胞转化葡萄糖生成四氢嘧啶。

说明书

四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及合成生物技术领域，具体涉及一种四氢嘧啶生物合成基因簇及制备四氢嘧啶的方法。

背景技术

[0002] 嗜盐菌属于一种极端微生物，根据其对NaCl的耐受程度可以分为轻度嗜盐菌（最适 NaCl 浓度为10‑30 g/L）、中度嗜盐菌（最适 NaCl 浓度为50‑100 g/L）和极端嗜盐菌（最适NaCl 浓度为130‑150 g/L）。为了维持细胞内外的渗透压平衡，在嗜盐菌细胞中会积累一些物质以抵抗外界的高渗环境，这类物质主要包括氨基酸及其衍生物、多元醇、糖类以及四氢嘧啶(Ectoine,1,4,5,6‑tetrahydro‑2‑methyl‑4‑pyrimidinecarboxylic acid)类，其中四氢嘧啶具有重要的应用价值。

[0003] 1985年，Galinski等首次在极端嗜盐的Halorhodospira halochlors中发现四氢嘧啶，并鉴定其结构，Ectoine 分子量为142.16，极具亲水性，属于两性离子特征的有机小分子，结构式如下所示。

[0004]

[0005] 四氢嘧啶在胞内大量积聚，可抵抗高渗透压的冲击，同时可以稳定蛋白的水化层结构（尤其在冷冻、干燥与高温条件下）。近年来的研究表明四氢嘧啶对体内和体外的酶、DNA和膜等大分子具有稳定作用；能够防止皮肤失水和干燥同时降低紫外线对皮肤的损伤度，另外四氢嘧啶可以抑制类淀粉蛋白的形成，能够降低类淀粉蛋白形成的起始和伸长阶段，因而具有潜在的预防老年痴呆症的功能。

[0006] 由于四氢嘧啶分子中具有一个手性碳原子，因此很难用化学方法合成，现有的生产方法主要为微生物发酵法。目前，广泛应用于 Ectoine工业规模生产的模式菌株主要集中在γ‑变形菌纲盐单胞菌科（Halomonadaceae），尤以盐单胞菌属（Halomonas）居多。经过几十年的研究，四氢嘧啶的合成途径已在基因水平、酶水平和调控水平上有了较为深入的发展。Halomonas作为四氢嘧啶合成研究的模式种群，报道了H.elongate DSM  2581、H.elongate DSM 3043、H. elongate ATCC33174中Ectoine的合成代谢途径。在上述四氢嘧啶的合成代谢途径中，以L‑lysine 生物合成途径中的天冬氨酸半醛(L‑aspartate‑B‑semialdehyde)为前体，依赖于进化高度保守的连锁ectABC基因簇操纵子(ect‑operon)。结构基因ectB、ectA和 ectC分别编码L‑二氨基丁酸转氨酶（ectB）、L‑二氨基丁酸乙酰转移酶（ectA）和四氢密啶合酶（ectC）经3步催化合成四氢嘧啶。

[0007] 采用现有的代谢途径合成四氢嘧啶存在产量低的缺陷，从而限制了四氢嘧啶的大规模产业化应用，如何提高天冬氨酸高产四氢嘧啶的方法成为行业研究的重点。

[0008] 发明人利用在进行盐湖淤泥采样后进行宏基因组测序分析，并通过序列比对筛选获得若干全新序列的ectABC基因簇，经基于NCBI数据库的BLAST比对搜索，ectABC核苷酸序列与其他盐单胞菌有明显差异，通过重组表达发酵生产复筛，获得能利用天冬氨酸稳定高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌，随后对ectABC基因簇进行突变设计，增强了活性，进一步提高了四氢嘧啶的转化效率。

发明内容

[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于合成四氢嘧啶的基因簇ectABC，其能够用于高效合成四氢嘧啶，大幅提高其产量。

[0010] 基于此，本发明提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，至少包括3个基因，分别为：

[0011] ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0012] ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

[0013] ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0014] 所述基因簇来源于盐单胞菌株Halomonas sp. YL01，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心 （GDMCC），地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070， 保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC No: 62420。

[0015] 本发明还提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇的获取方法，

[0016] 第一步，菌株筛分，对盐湖淤泥所含有的菌株筛分；

[0017] 第二步，PCR扩增验证；

[0018] 第三步，基因组测序，获得基因簇。

[0019] 本发明还提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇突变体，其ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第39位氨基酸由N替换成S，且第132位氨基酸由A替换成T，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0020] 其ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第59位氨基酸由I替换成L，第71位氨基酸由N替换成G，第179位氨基酸由A替换成T，且第381位氨基酸由V替换成I，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0021] 其ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第62位氨基酸由F替换成Y，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0022] 上述合成基因簇突变体的构建方法，包括：

[0023] 第一步，底盘菌基因簇提取；

[0024] 第二步，表达载体骨架及上述提取的基因簇PCR扩增；

[0025] 第三步，重组表达质粒构建；

[0026] 第四步，突变体构建。

[0027] 含上述合成基因簇或基因簇突变体的表达载体或重组微生物工程菌。

[0028] 上述基因簇、基因簇突变体、表达载体、重组微生物工程菌在合成四氢嘧啶过程中的应用。

[0029] 本发明还提供采用上述重组微生物工程菌生产四氢嘧啶的方法，通过全细胞转化葡萄糖生成四氢嘧啶。

[0030] 所述方法进一步包括：

[0031] 第一步，种子液制备；

[0032] 第二步，四氢嘧啶发酵；

[0033] 第三步，四氢嘧啶的制备。

[0034] 本发明具有以下有益技术效果：本发明提供一种用于合成四氢嘧啶的基因簇ectABC及其突变体，其能够用于高效合成四氢嘧啶，经研究发现，基因簇ectABC编码的酶催化效率更好，同等发酵条件产量高了近30%，同时在这个基因簇上做了突变，效率进一步得到提升约20%。

附图说明

[0035] 图1为重组大肠杆菌产四氢嘧啶的液相质谱分析；

[0036] 图2 为本发明中ectA基因与Halomonas aestuarii Hb3、Halomonas sp. THAF5a、Halomonas sp. JS92‑SW72、Halomonas sp. BM‑2019、Halomonas elongata中ectA基因序列比对结果；

[0037] 图3和图 4 为本发明中ectB基因与Halomonas aestuarii Hb3、Halomonas sp. THAF5a、Halomonas sp. JS92‑SW72、Halomonas sp. BM‑2019、Halomonas elongata中ectB基因序列比对结果，其中，图4为图3的接续；

[0038] 图5为本发明中ectC基因与Halomonas aestuarii Hb3、Halomonas sp. THAF5a、Halomonas sp. JS92‑SW72、Halomonas sp. BM‑2019、Halomonas elongata中ectC基因序列比对结果。

[0039] 图6为高活性四氢嘧啶合成关键酶编码基因簇ectABC的重组表达图谱示意图。

[0040] 图7为ectABC基因簇的pcr产物。

具体实施方式

[0041] 本发明提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，至少包括3个基因，分别为：

[0042] ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0043] ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

[0044] ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0045] 所述基因簇来源于盐单胞菌株Halomonas sp. YL01，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心 （GDMCC），地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070， 保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC No: 62420。

[0046] 本发明还提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇的获取方法，

[0047] 第一步，菌株筛分，对盐湖淤泥所含有的菌株筛分；

[0048] 第二步，PCR扩增验证；

[0049] 第三步，基因组测序，获得基因簇。

[0050] 本发明还提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇突变体，其ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第39位氨基酸由N替换成S，且第132位氨基酸由A替换成T，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0051] 其ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第59位氨基酸由I替换成L，第71位氨基酸由N替换成G，第179位氨基酸由A替换成T，且第381位氨基酸由V替换成I，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0052] 其ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第62位氨基酸由F替换成Y，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0053] SEQ ID NO.1：ectA (如序列表中序列1所示)

[0054] ATGACAATGAACGCAACCACCGAGCCCTTCACACCCTCCGCCGACCTGGCACGCCCCACCGTGGCGGACGCCGTGGTCGGTCACGAGGCCTATCCGCTGTTCATCCGCAAGCCCAACCCCGATGACGGCTGGGGCATCTACGAGCTGGTCAAGTCCTGCCCCCCGCTGGACGTCAACTCCGCCTATGCCTACCTGCTGCTGGCGACCCAGTTCCGCGACAGTTGTGCCGTGGCCACCAACGAGGAGGGCGAGATCGTCGGTTTCGTCTCCGGCTACGTGAAGAGCAACGCCCCGGACACCTACTTCCTGTGGCAGGTGGCGGTCGGCGAGAAGGCGCGCGGCACCGGCCTGGCCCGGCGCCTGGTGGAAGCCGTGATGACCCGCCCGGAGATGGCCGAGGTCCACCACCTCGAGACCACCATCACCCCCGACAACCAGGCCTCCTGGGGCCTGTTCCGGCGGCTTGCCGAACGCTGGCAGGCGCCGCTCAACAGCCGCGAGTACTTCTCCACCGACCAGCTCGGTGGCGAGCACGACCCGGAAAACCTCGTGCGCATCGGCCCCTTCCAGACCGATCGCATCTGA

[0055] SEQ ID NO.2：ectB  (如序列表中序列2所示)

[0056] ATGCAGACCCAGATCCTCGAACGCATGGAGTCCGAAGTTCGGACCTATTCCCGCTCCTTTCCGGTGGTCTTCACCAAGGCCCGGAATGCCCGTCTGACCGACGAGGACGGCCGCGAGTACATCGACTTCCTGGCCGGTGCCGGCACCCTGAACTACGGCCACAACAACCCGCACATCAAGCAGGCGCTGCTCGACTACCTGGCCGAGGACAACATCATCCATGGCCTGGACTTCTGGACCGCCGCCAAGCGTGACTACCTCGAGGCCCTCGACGAGGTGATCCTCAAGCCGCGCGGCCTGGACTACAAGGTCCAGTTCCCTGGACCGACCGGCACCAATGCCGTCGAGGCGGCCATCCGCCTGGCCCGCAACGCCAAGGGCCGCCACAACATCGTCACCTTCACCAACGGCTTCCACGGCGTGACCATGGGGGCGCTGGCCACCACCGGTAACCGCAAGTTCCGCGAGGCCACGGGCGGCGTGCCCACGGTCGGCGGGAGCTTCATGCCCTTCGACGGCTACCTGGGCGAGGGCGCCGACACCCTGGATTACTTCGAGAAGCTGCTCGGCGACAAGTCCGGCGGCCTGGACATCCCGGCGGGGGTGATCGTCGAGACCGTGCAGGGCGAGGGCGGTATCAACGTCGCTGGCCTCGACTGGCTCAAGCGCCTCGAGGGCATCTGCCGCGCCCATGACATCCTGCTGATCGTCGACGACATCCAGGCCGGCTGCGGCCGCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCGAACACGCCGACGTCGTTCCCGATATCGTCACCAACTCCAAGTCGCTCTCCGGCCTCGGCCTGCCGTTCTCCCAGGTGCTGATGCGTCCTGAACTCGATGTCTGGAAGCCGGGCCAGTACAACGGCACCTTCCGCGGCTTCGCGCTTGCCTTCACCACCGCGGCCGCCGCCTTGCGCCACTATTGGAGCGACGACGCCCTGGCCCAGGACGTGGCGCGCAAGGGCGAGGTGGTCGCCAAGCGCTTCCAGAAGATCGCCGGCATGCTCGGCGAACTGGGCATCGAGGCCTCCGAGCGTGGCCGCGGCCTGATGCGCGGGATCGACGTGGGTAGCGGTGACATCGCCGACAAGATCACCCACAAGGCCTTTGAGAACGGGCTGGTCATCGAGACCAGCGGTCAGGACGGCGAGGTAGTCAAGTGCCTCTGCCCGCTGACCATCACCGATGAGGAGCTGGACATGGGCCTCGATATTCTCGAGACCAGCACCAAGCAGGCGCTTAGCTGA

[0057] SEQ ID NO.3：ectC  (如序列表中序列3所示)

[0058] ATGATCGTTCGCAATCTCGATGACGCCCGCAAGACCGACCGCCTGGTCAAGGCCGAAAACGGCAACTGGGACAGCACCCGCCTGAGTCTGGCCGATGATGGCGGCAACTGCTCCTTCCATATCACGCGTATCTACGAAGGCACCGAGACCCACATCCACTACAAGCATCACTTCGAGGCCGTTTTCTGCATCGAAGGCGAGGGCGAGGTGGAAACCCTGGCCGACGGCAAGATCTGGCCGATCAAGCCGGGTGACATCTACATCCTCGACCAGCACGACGAGCACCTGCTGCGCGCCAGCAAGACCATGCACCTGGCCTGCGTGTTCACGCCGGGCCTGACCGGCAACGAGGTGCACCGCGAGGATGGCTCCTACGCGCCGGCCGAGGCCGACGACAAGAAGCCGCTCTGA

[0059] SEQ ID NO.4：(如序列表中序列4所示)

[0060] MTMNATTEPFTPSADLARPTVADAVVGHEAYPLFIRKPSPDDGWGIYELVKSCPPLDVNSAYAYLLLATQFRDSCAVATNEEGEIVGFVSGYVKSNAPDTYFLWQVAVGEKARGTGLARRLVEAVMTRPEMTEVHHLETTITPDNQASWGLFRRLAERWQAPLNSREYFSTDQLGGEHDPENLVRIGPFQTDRI

[0061] SEQ ID NO.5 ：(如序列表中序列5所示)

[0062] MQTQILERMESEVRTYSRSFPVVFTKARNARLTDEDGREYIDFLAGAGTLNYGHNNPHLKQALLDYLAEDGIIHGLDFWTAAKRDYLEALDEVILKPRGLDYKVQFPGPTGTNAVEAAIRLARNAKGRHNIVTFTNGFHGVTMGALATTGNRKFREATGGVPTVGGSFMPFDGYLGEGTDTLDYFEKLLGDKSGGLDIPAGVIVETVQGEGGINVAGLDWLKRLEGICRAHDILLIVDDIQAGCGRTGKFFSFEHADVVPDIVTNSKSLSGLGLPFSQVLMRPELDVWKPGQYNGTFRGFALAFTTAAAALRHYWSDDALAQDVARKGEVVAKRFQKIAGMLGELGIEASERGRGLMRGIDVGSGDIADKITHKAFENGLIIETSGQDGEVVKCLCPLTITDEELDMGLDILETSTKQALS

[0063] SEQ ID NO.6：(如序列表中序列6所示)

[0064] MIVRNLDDARKTDRLVKAENGNWDSTRLSLADDGGNCSFHITRIYEGTETHIHYKHHFEAVYCIEGEGEVETLADGKIWPIKPGDIYILDQHDEHLLRASKTMHLACVFTPGLTGNEVHREDGSYAPAEADDKKPL

[0065] 上述合成基因簇突变体的构建方法，包括：

[0066] 第一步，底盘菌基因簇提取，从底盘菌株Halomonas sp. YL01中挑选单克隆，放入培养液中培养，提取基因组；

[0067] 第二步，表达载体骨架及上述提取的基因簇PCR扩增；

[0068] 第三步，重组表达质粒构建，将载体骨架和ectABC基因簇连接构建重组表达质粒，连接到大肠感受态细胞中培养；

[0069] 第四步，突变体构建，对ectA、ectB、ectC基因突变设计引物，构建突变质粒。

[0070] 含上述合成基因簇或基因簇突变体的表达载体或重组微生物工程菌。

[0071] 上述基因簇、基因簇突变体、表达载体、重组微生物工程菌在合成四氢嘧啶过程中的应用。

[0072] 本发明还提供采用上述重组微生物工程菌生产四氢嘧啶的方法，通过全细胞转化葡萄糖生成四氢嘧啶。

[0073] 所述方法进一步包括：

[0074] 第一步，种子液制备，基于表达载体构建ectABC基因簇及其突变体的重组表达质粒，转入大肠杆菌表达，将获得的单克隆培养，获得种子液；

[0075] 第二步，四氢嘧啶发酵培养，在培养基中接入种子液，发酵培养，生产四氢嘧啶；

[0076] 第三步，四氢嘧啶的制备，离心回收菌体，菌体破壁，膜过滤制取四氢嘧啶上清液进行产物浓度等检测分析。

[0077] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0078] 下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写。

[0079] 下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

[0080] 其他需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

[0081] 实验材料和试剂

[0082] 1. 菌株：本发明筛选的ectABC基因簇来源于青海省盐湖的菌群测序。同时，通菌株筛分，PCR扩增验证，基因组测序，发酵生产等方法，确认该基因簇的来源菌株，对其进行菌种鉴定后，命名为Halomonas sp. YL01，生物保藏号为：GDMCC No: 62420。

[0083] 2. 重组大肠杆菌JM109 的培养基及批次补料发酵营养物组分：

[0084] （1）LB培养基（g/L）：蛋白胨5‑20，酵母粉3‑10，氯化钠10‑30，pH调制6‑10，用于重组大肠杆菌JM109的培养；配置平板即需加入1.5‑2%的琼脂糖。

[0085] （2）MM培养基（g/L）：葡萄糖 10‑30，尿素0.5‑10，天冬氨酸 0‑10，酵母粉1‑20，无水硫酸镁0.05‑0.6，磷酸二氢钾1.5‑5.5，氯化钠5‑30，Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05‑0.1，CaCl2·2H2O 0.02‑0.2，ZnSO4·7H2O 0.1‑0.2，MnCl2·4H2O 0.03‑0.09，H3BO3 0.3‑1，CoCl2·6H2O 0.2‑0.8， CuSO4·5H2O 0.01‑0.08，NiCl2·6H2O 0.02‑0.1，NaMoO4·2H2O 0.03‑0.12，用于重组大肠杆菌JM109的发酵。

[0086] （3）补料Ⅰ（g/L）：葡萄糖 300‑1000，尿素 20‑100，天冬氨酸 0‑15；补料Ⅱ（g/L）：葡萄糖 500‑1000，尿素 2‑20。

[0087] 3. Halomonas sp. YL01的培养基

[0088] （1）60LB培养基（g/L）：蛋白胨5‑20，酵母粉3‑10，氯化钠60‑80，pH调制8‑10，用于Halomonas sp. YL01的筛分和培养；配置平板即需加入1.5‑2%的琼脂糖。

[0089] 实施例1 四氢嘧啶合成基因簇ectABC序列的获取

[0090] 选择青海省盐湖淤泥的菌群，将淤泥用无菌培养基重悬稀释10‑1000倍，并通过平板涂布法进行菌株的单克隆筛分。筛分获得的不同单克隆进行PCR扩增验证，选取能扩增片段大小与ectABC基因簇片段一致的克隆进行测序验证分析，验证正确后，即获得本发明的四氢嘧啶合成基因簇ectABC序列。

[0091] 随后对将该菌株进行全基因组测序，确认该基因簇的来源菌株，对其进行菌种鉴定和全基因组注释后，命名为Halomonas sp. YL01，生物保藏号为：GDMCC No: 62420。

[0092] 实施例2四氢嘧啶合成基因簇ectABC序列比对

[0093] 通过NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具分析ectABC的核酸序列：

[0094] ectA与来自Halomonas aestuarii strain  Hb3（NCBI登录号：CP018139.1）、Halomonas sp. THAF5a (NCBI登录号: CP045417.1)、 Halomonas sp. JS92‑SW72（NCBI登录号: CP032147.1）、Halomonas sp.  BM‑2019(NCBI登录号: CP071922.1)、Halomonas elongata  (NCBI登录号: D88359.1)的ectA分别具有94.17%，93.83%，91.27%，90.19%和88.36%的相似性，具体比对结果如图2所示；

[0095] ectB与来自Halomonas aestuarii strain  Hb3（NCBI登录号：CP018139.1）、Halomonas sp. THAF5a (NCBI登录号: CP045417.1)、 Halomonas sp. JS92‑SW72（NCBI登录号: CP032147.1）、Halomonas sp.  BM‑2019(NCBI登录号: CP071922.1)、Halomonas elongata  (NCBI登录号: D88359.1)的ectB分别具有91.4%，91.09%，88.35%，87.62%和85.28%的相似性，具体比对结果如图3和图4所示；

[0096] ectC与来自Halomonas sp. JS92‑SW72（NCBI登录号: CP032147.1）、 Halomonas elongata  (NCBI登录号: D88359.1)、 Halomonas aestuarii strain Hb3（NCBI登录号：CP018139.1）、Halomonas sp. THAF5a (NCBI登录号: CP045417.1)、Halomonas sp. BM‑
2019(NCBI登录号: CP071922.1)、的ectC分别具有91.99%，91.71%，91.3%，90.7.62%和
88.35%的相似性，具体比对结果如图5所示。

[0097] 因此，四氢嘧啶合成基因簇ectABC中ectA与来自Halomonas elongata  (NCBI登录号: D88359.1)等众多盐单胞菌的ectA至少有88.36%的DNA序列同源性；四氢嘧啶合成基因簇ectABC中ectB与来自Halomonas elongata  (NCBI登录号: D88359.1)等众多盐单胞菌的ectB至少有85.28%的DNA序列同源性；四氢嘧啶合成基因簇ectABC中ectC与来自Halomonas sp. BM‑2019(NCBI登录号: CP071922.1)等众多盐单胞菌的ectC至少有88.35%的DNA序列同源性。

[0098] 实施例3 四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组及突变

[0099] 图6给出了基因簇ectABC的重组表达图谱示意图，具体如下：

[0100] Halomonas sp. YL01基因组提取

[0101] 将Halomonas sp. YL01接种于60 LB无抗平板上，37℃，倒置培养24 h后，挑选单克隆至5 mL 60 LB培养液的摇菌管中，37ºC、180 rpm振荡培养12 h；取2 mL菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）提取Halomonas sp. YL01基因组。

[0102] 表达载体pSEVA321骨架及基因簇ectABC序列的PCR扩增

[0103] 根据表达载体pSEVA321以及基因簇ectABC序列信息，利用Snapgene软件（Version 8.02）设计引物，引物序列如下：

[0104] 表达载体‑F：TGATAAGCCAGGCATCAAATAAAACG (如序列表中序列7所示)

[0105] 表达载体‑R：CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAAC (如序列表中序列8所示)[0106] ectABC基因簇‑F：

[0107] GAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGTACGCCAATAACACCTTTTACCCC (如序列表中序列9所示)

[0108] ectABC基因簇‑R：TTTGATGCCTGGCTTATCATTACTCACCCGCGGGTGCTG (如序列表中序列10所示)

[0109] 以载体pSEVA321以及上述1得到的Halomonas sp. YL01基因组分别作为模板，反应总体积为 50 µL，在 0.2 mL PCR 管中依次加入表1所示下列成分：

[0110] 表1

[0111]

[0112] 混匀后瞬时离心，反应参数为：98 ℃变性30 sec； 98 ℃变性10 sec，65 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1.5 min，35个循环后72 ℃终延伸2 min。使用通用性DNA纯化试剂盒（购自天根生化科技有限公司）回收上述pSEVA321骨架及基因簇ectABC，操作按产品说明书提供的步骤进行。

[0113] 重组表达质粒的构建

[0114] ① 将上述2得到的pSEVA321骨架及基因簇ectABC连接构建重组表达质粒：通过 T4 DNA Ligase（购自New England Biolabs）进行连接，反应总体积为20 µL，在 0.2 mL PCR 管中依次加入表2所示下列成分：

[0115] 表2

[0116]

[0117] 混匀后，瞬时离心，16 ℃下过夜连接，获得连接产物。

[0118] ② 大肠杆菌JM109化学转化感受态细胞的制备

[0119] 1）使用LB平板培养基，用接种环挑取大肠杆菌（‑20℃甘油保藏菌株），在平板上分级划线，于37 ℃倒置培养14‑16 h；

[0120] 2）从LB平板上挑取活化的E. coli JM109单菌落，接种于5 mL LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养12 h；

[0121] 3）将上述培养物以1：100的比例接种于100 mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.5左右，放置冰上停止培养；

[0122] 4）取上述菌液1mL转入1.5 mL离心管中，4000 rpm，4℃离心10 min，弃去上清；之后按Competent Cell Preparation Kit（Takara公司制备大肠感受态的试剂盒）说明书进行；

[0123] 5）冰上将感受态细胞分装成50 μL /管，‑80 ℃保存，获得感受态细胞JM109。

[0124] ③ 连接产物转化大肠感受态细胞JM109

[0125] 从‑80 ℃冰箱中取上述②的感受态细胞JM109，迅速冰浴解冻。取上述步骤①获得连接产物加入大肠杆菌感受态细胞JM109中，轻轻混匀，冰浴30 min，42 ℃水浴热击90 s后，立即冰浴2 min，加入0.75 mL LB液体培养基，37℃复苏2 h。取100 µL菌液涂布于含有Cm抗性（终浓度为100 µg/mL）的LB平板上，37℃倒置培养12 16 h。~

[0126] 挑取阳性单菌落接种到含有Cm抗性（终浓度为100 µg/mL）的5 mL LB液体培养基中，37℃、180 rpm 过夜培养，通过菌液PCR验证阳性单菌落和测序分析表明重组质粒构建成功。

[0127] 突变体的构建

[0128] ① ectA基因突变的引物设计：据基因簇ectABC序列比对结果，设计N39S、A132T双突变点，利用Snap gene软件（Version 8.02）设计突变引物，引物序列如下（突变的碱基由下划线标出）：

[0129] 39‑F：AGCCCCGATGACGGCTGGGGCATCTACG (如序列表中序列11所示)

[0130] 39‑R：GGGCTTGCGGATGAACAGCGGATAGGC (如序列表中序列12所示)

[0131] 132‑F：ACGGAGGTCCACCACCTCGAGACCACC (如序列表中序列13所示)

[0132] 132‑R：CATCTCCGGGCGGGTCATCACGGCTTCCA (如序列表中序列14所示)

[0133] 提取上述3中构建的质粒，使用引物39‑F、39‑R扩增得到线性化质粒，步骤同上述2，再将线性化质粒连接，步骤同上述3，得到39号位氨基酸突变质粒；提取39号位氨基酸突变质粒，使用引物132‑F、132‑R扩增得到线性化质粒，步骤同上述2，再将线性化质粒连接，步骤同上述3，得到132号位氨基酸突变质粒，39、132号位氨基酸突变质粒即为ectA基因突变质粒，突变后的氨基酸序列

[0134] ② ectB基因突变的引物设计：据基因簇ectABC序列比对结果，设计I59L、N71G、A179T、V381I多突变点，利用Snap gene软件（Version 8.02）设计突变引物，引物序列如下（突变的碱基由下划线标出）：

[0135] 59‑F：CTAAAGCAGGCGCTGCTCGACTACCT (如序列表中序列15所示)

[0136] 59‑R：GTGCGGGTTGTTGTGGCCGTAGTTC (如序列表中序列16所示)

[0137] 71‑F：GGAATCATCCATGGCCTGGACTTCTGGA (如序列表中序列17所示)

[0138] 71‑R：GTCCTCGGCCAGGTAGTCGAGCAGC (如序列表中序列18所示)

[0139] 179‑F：ACCGACACCCTGGATTACTTCGAGAAGCTG (如序列表中序列19所示)

[0140] 179‑R：GCCCTCGCCCAGGTAGCCGTCGAAGGGCAT (如序列表中序列20所示)

[0141] 381‑F：ATAATCGAGACCAGCGGTCAGGACGG (如序列表中序列21所示)

[0142] 381‑R：CAGCCCGTTCTCAAAGGCCTTGTGGGTGATCT (如序列表中序列22所示)

[0143] 突变质粒构建实验步骤同ectA基因突变的引物设计

[0144] 提取上述①中构建的ectA基因突变质粒，使用引物59‑F、59‑R扩增得到线性化质粒，步骤同上述2，再将线性化质粒连接，步骤同上述3，得到59号位氨基酸突变质粒；提取32号位氨基酸突变质粒，使用引物71‑F、71‑R扩增得到线性化质粒，步骤同上述2，再将线性化质粒连接，步骤同上述3，得到71号位氨基酸突变质粒，179、381号位氨基酸突变质粒的构建方法同上，最终59、71、179、381号位氨基酸突变质粒即为ectB基因突变质粒。

[0145] ③ectC基因突变的引物设计：根据基因簇ectABC序列比对结果，设计F62Y突变点，利用Snap gene软件（Version 8.02）设计突变引物，引物序列如下（突变的碱基由下划线标出）：

[0146] 62‑F：TACTGCATCGAAGGCGAGGGCGAGGTGGAAAC (如序列表中序列23所示)

[0147] 62‑R：GGGCTTGCGGATGAACAGCGGATAGGC (如序列表中序列24所示)

[0148] 提取上述②中构建的ectB基因突变质粒，使用引物62‑F、62‑R扩增得到线性化质粒，步骤同上述2，再将线性化质粒连接，步骤同上述3，得到62号位氨基酸突变质粒，该位点突变质粒即为ectC基因突变质粒。

[0149] 实施例4 发酵生产四氢嘧啶

[0150] 1. 种子液制备

[0151] ①基于pSEVA321表达载体，构建ectABC基因簇及其突变体的重组表达质粒，并转入至大肠杆菌JM109中表达；取接种环在超净工作台上将重组大肠杆菌JM109菌株划线至无抗LB平板上，37 ℃活化24 h，待其长出单克隆；

[0152] ②挑选上述1中单克隆接种于装有5 mL种子培养基（LB）的摇菌管中，37 ℃，200 rpm培养12 h；

[0153] ③取上述2中200 μL菌液，接种于装有20 mL种子培养基（LB）的 150mL锥形瓶中，37 ℃，200 rpm培养12 h；

[0154] ④取上述3中1 mL菌液，接种于装有100 mL种子培养基（LB）的 500mL锥形瓶中，37 ℃，200 rpm培养12 h；

[0155] 2. 四氢嘧啶发酵生产

[0156] I）摇瓶发酵：500 mL加入50 mL发酵培养基（MM），用NaOH调整pH为7‑10，按2.5‑5%体积比接入种子液，发酵过程中温度控制在35‑38 ℃，转速控制不高于220 rpm，发酵培养36‑48 h。

[0157] II）发酵罐发酵：7.5 L发酵罐加入3.6 L发酵培养基（MM），用NaOH调整pH为6‑10，按5‑10%体积比接入种子液，发酵过程中温度控制在35‑38 ℃，转速控制不高于1000 rpm，溶氧控制在5‑35%。发酵过程中每隔1 h取样进行OD检测及残糖检测：

[0158] 发酵开始6‑10小时起开始添加补料Ⅰ，使葡萄糖浓度维持在5‑10 g/L；

[0159] ②发酵开始16‑20小时起开始添加补料II，使葡萄糖浓度维持在5‑10 g/L；

[0160] ③发酵24‑28小时后结束发酵。

[0161] 3. 四氢嘧啶的检测

[0162] 取稀释合适倍数的菌破壁处理，菌液在12000 rpm转速下离心 10 min，取上清经 0.22 µm 微孔滤膜过滤后，进行 HPLC 分析。液相条件如下：C18色谱柱。流动相为 乙腈（A 液）和纯水（B 液）、A:B=70:30；进样量 10 μL；流速 1 mL/min；检测波长 210 nm，经HPLC检测的四氢嘧啶见图1。

[0163] 4. 四氢嘧啶的制备

[0164] 培养结束后通过离心回收菌体，酒精提取释放胞内四氢嘧啶产物，然后浓缩，膜过滤，结晶得到四氢嘧啶。

[0165] 比较例

[0166] 种子液制备：

[0167] 采用与实施例4相同的方法进行种子液制备和四氢嘧啶发酵制备，区别采用所采用的基因簇为表3提供的文献方法获得的。

[0168] 表3实施例和比较例的发酵产率比较

[0169]

[0170] a 本案例中突变前ectABC基因簇与H. bluephagenesis TD来源ectABC基因簇的异源表达产量比较，摇瓶发酵方法与实施例4相同；

[0171] b 本案例中突变后ectABC基因簇与H. bluephagenesis TD来源ectABC基因簇的异源表达产量比较，摇瓶发酵方法相同；

[0172] c 本案例中突变后ectABC基因簇与H. bluephagenesis TD、H. elongata DSM2581来源ectABC基因簇的异源表达产量比较，7‑L发酵罐发酵方法。

[0173] Ma等利用H. bluephagenesis TD菌株来源的ectABC基因簇，通过基因工程的大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶方法，在500 mL摇瓶中生长48 h，四氢嘧啶产量达到3.4 g/L；通过基因工程的H. bluephagenesis TD菌株发酵生产四氢嘧啶方法，在500 mL摇瓶中生长48 h，以及在7 L生物反应器中分批补料培养28 h，四氢嘧啶的含量分别达到6.3和28 g/L（Ma H, Zhao Y, Huang W, et al. Rational flux‑tuning of Halomonas bluephagenesis for co‑production of bioplastic PHB and ectoine[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1‑12；Ning等利用H. elongata DSM 2581菌株来源的ectABC基因簇，通过代谢改造的大肠杆菌方法，摇瓶发酵的得四氢嘧啶未提供，其7‑L发酵罐发酵的方式产量最高达25.1g/L（Ning Y, Wu X, Zhang C, et al. Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli, Metabolic Engineering, 2016, 36: 10‑18.）

[0174] 通过表3的对比可以看出，采用本发明提供的基因簇编码的酶催化效率更好，突变之后，转化为四氢嘧啶的效率较传统方法提升超30%，而突变之后效率进一步提升了20%。

[0175] 所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

[0176] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。