稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的应用转让专利
申请号 : CN202011436740.1
文献号 : CN114621975B
文献日 : 2023-05-02
发明人 : 王加峰 , 谢华斌 , 林春资 , 满淼淼 , 陈淳 , 王慧 , 郭涛 , 黄明 , 杨瑰丽 , 刘永柱
申请人 : 华南农业大学
摘要 :
本发明公开了稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的应用，属于植物基因工程技术领域。稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。本发明发明人鉴定并证实了OsWRKY5参与了水稻对稻瘟病菌的防御反应，是一种重要的参与水稻抗病性的正调控基因。本发明有助于更好地了解OsWRKY5的作用机制，OsWRKY5的克隆为进一步了解水稻‑病原菌互作，抗病信号传导通路奠定基础，在育种中有较大的应用价值。
权利要求 :
1.稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。
3.稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的稻瘟病抗性相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35所示。
4.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。
5.根据权利要求1‑4任一项所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：上调所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在水稻中的表达。
6.根据权利要求1‑4任一项所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的稻瘟病病菌为稻瘟病菌（M.oryzae）GDYJ7。
7.权利要求1‑4任一项中所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的过表达载体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的过表达载体用于过表达OsWRKY5基因。
8.一种包含权利要求7中所述的过表达载体的宿主菌在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。
10.一种培育转基因水稻的方法，其特征在于：用植物表达载体构建含有权利要求1‑4任一项中所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的过表达载体；再用所述过表达载体转化水稻组织；将转化的水稻组织培育成水稻植株。
说明书 :
稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种水稻抗病相关基因的应用，具体涉及一种稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的应用。
背景技术
[0002] 水稻是人类最重要的食物之一，养活着全球半数以上的人口(Khush，2005)。水稻稻瘟病是由丝状真菌稻瘟菌(Magnaportheoryzae)引起的，是危害水稻最大的病害之一，常造成水稻严重减产。全球每年因稻瘟病造成的农作物损失估计为660亿美元，足以养活6000万人。
[0003] 稻瘟病的发生与寄主防御机制密切相关。在与病原物相互作用进化的过程中，植物相应的不断进化出一系列复杂的免疫应答反应以抵抗病原物的侵害(韩艺娟等，2018)。除几丁质、鞭毛蛋白flg22以及脂多糖等PAMPs(Pathogen associated moleculars，PAMPs)小分子物质被细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别后可以引发PTI(PAMP‑triggered immunity)免疫反应外(Zipfel et al.，2006；Chinchilla et al.，2006)，病原菌编码的一系列分泌蛋白即“激发子”也可以引发PTI免疫反应。当病原菌的无毒(Avr)基因被匹配的寄主抗性(R)基因识别时，就会触发过敏反应。但稻瘟病菌在有性繁殖过程中，能够通过活跃的转座子发生快速的遗传变化，导致无毒(Avr)基因的表达缺失，从而逃避寄主防御，从而导致稻瘟病的发生。到目前为止，已鉴定出100多个主要的稻瘟病R基因，其中30个已被分子克隆，已克隆成功的成对的抗性基因和无毒基因有Pik/Avr‑Pik、Pib/Avr‑Pib、Pi‑ta/Avr‑Pita、Piz‑t/Avr‑Pizt、Pi9/Avr‑Pi9、Pia/Avr‑Pia、Pi‑CO39/AvrPi‑CO39、Pii/Avr‑Pii及Pi54/Avr‑Pi54(曹妮等，2019)。
[0004] 转录因子是一类DNA结合蛋白，能够特异性结合在下游基因启动子区域中的顺势作用元件从而激活或抑制植物对于植物的生长、发育以及多种生物和非生物逆境的应答，以实现植物自身的抗逆性(Nakashimaet al.，2009)。目前通过转基因或多种分子试验方法已经证实有6种主要的转录因子家族与植物的生物和非生物胁迫有关，其分别是：AP2/ERF(APETALA2ethylene responsive factor)；bHLH(basic helix‑loop‑helix)；NAC(no apical meristem(NAM)，Arabidopsis transcriptionactivationfactor(ATAF1/2)and cup‑shaped cotyledon(CUC2)；WRKY and bZIP(basic leucine zipper)(Singh et al.，2002；Seoet al.，2015)。其中WRKY家族转录因子是植物中最大的一类转录因子之一，该家族转录因子通常含有一个或两个由60个氨基酸组成的WRKY保守结构域(Seoet al.，2015)，该结构域为DNA结合结构域(DNA binding domain)。WRKY结构域的N端有保守的氨基酸序列WRKYGQK；该结构域C端为锌指结构蛋白(C2H2或C2HC)，其在植物进化中有非常重要的作用(Ross et al.，2007)。WRKY转录因子参与PAMP信号引导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联下游反应(Asai et al.，2002)，植物MAPK级联反应在多种防御反应中起着至关重要的作用，特别是在感知PAMP或病原体效应蛋白以及下游信号传导过程中(Meng et al.，2013)。
[0005] 鉴定抗病相关基因有助于深入揭示水稻的抗病机理及水稻与病原菌的具体互作机制，进一步的选育或者培育相关的抗病品种，可以更好的更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害，增强植物的抗病性。这些研究对水稻基因功能研究及抗病水稻育种都具有重要的应用价值。
发明内容
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的应用。OsWRKY5属于WRKY家族转录因子，本发明发明人首次发现受稻瘟病菌诱导后，OsWRKY5会被稻瘟病菌侵染诱导而激活，过表达OsWRKY5会增强稻瘟病抗性，而敲除OsWRKY5植株表现为易感病，OsWRKY5过表达植株中病程相关基因PR1b、PR1a、PR10的表达量显著高于野生型，该基因正向调控水稻稻瘟病抗性。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 本发明提供一种稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。
[0009] 所述的应用优选为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。
[0010] 所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
[0011] 所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的cDNA全长序列如SEQ ID NO:34所示。
[0012] 所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的全长基因组序列如SEQ ID NO:35所示。
[0013] 所述的应用，是上调所述的稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5在水稻中的表达。
[0014] 所述的稻瘟病病菌为稻瘟病菌(M.oryzae)GDYJ7。
[0015] 一种针对上述稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的过表达载体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，所述的载体用于过表达OsWRKY5基因。
[0016] 一种包含上述过表达载体的宿主菌在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。
[0017] 所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。
[0018] 一种培育转基因水稻的方法，具体操作为：用植物表达载体构建含有上述稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的过表达载体；再用所述过表达载体转化水稻组织；将转化的水稻组织培育成水稻植株。
[0019] 所述的转化的方式为农杆菌转化法。
[0020] 所述的农杆菌转化法中所用的农杆菌为EHA105。
[0021] 本发明是前期通过免疫共沉淀(Co‑IP)技术鉴定到了与抗病蛋白Pik1‑H4互作的转录因子OsWRKY5。OsWRKY5属于WRKY家族中第二大类的a亚组：C‑Xm‑C‑Xn‑HXC/H，OsWRKY5具有转录激活特性，但WRKY结构域只负责与基因组DNA结合不具有转录激活特性。
[0022] 本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个提高水稻稻瘟病抗性的转录因子OsWRKY5。OsWRKY5基因组序列全长为5,421bp，CDS全长为1,425bp，包含有5个外显子和4个内含子，编码474aa。OsWRKY5蛋白结构中含有保守的WRKYGQK结构域，在WRKYGQK保守结构域后有一个C2H2型的锌指结构C‑X5‑C‑X23‑HXH，属于WRKY家族下第二大类的a亚组(C‑Xm‑C‑X n‑HXC/H)蛋白。
[0023] 本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。
[0024] 本发明稻瘟病抗性相关基因OsWRKY5的应用。表达模式分析发现，OsWRK Y5的表达受稻瘟病菌诱导。OsWRKY5的功能缺失会降低水稻的稻瘟病抗性，Os WRKY5正向调控稻瘟病抗性水稻稻瘟病抗性。在OsWRKY5过表达植株中病程相关基因PR1b、PR1a、PR10的表达量显著高于野生型，而在OsWRKY5基因编辑植株中表达量显著低于野生型。
[0025] OsWRKY5正向调控稻瘟病抗性。通过构建相应的载体转化水稻，对其所参与的抗病通路进行研究，将其整合进入复杂的抗病调控网络，为水稻抗稻瘟病育种提供一定的理论指导。
[0026] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0027] 本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个WRKY家族蛋白的基因OsWRKY5，证实OsWRKY5参与了水稻对稻瘟病菌的防御反应，是一种重要的参与水稻抗病性的正调控基因。本发明有助于更好地了解OsWRKY5的作用机制，OsWRKY5的克隆为进一步了解水稻‑病原菌互作，抗病信号传导通路奠定基础，在育种中有较大的应用价值。
附图说明
[0028] 图1是OsWRKY5全长基因结构示意图；其中，黑色区域为外显子，空白长方格区域为5'非翻译区与3'非翻译区。
[0029] 图2是OsWRKY5与其它WRKY家族蛋白氨基酸序列相似性比较结果图。
[0030] 图3是OsWRKY5在抗病材料中的表达受到稻瘟病菌的诱导的结果图。
[0031] 图4是OsWRKY5转录激活特性检测结果图。
[0032] 图5是接种稻瘟病菌8d后转基因植株的病情调查病程相关基因(PR10、PR1b、PR1a)相对表达量分析结果图；其中，图A为相对表达量分析结果，B为植株拍照图；WT为野生型植株，OX‑OsWRKY5为OsWRKY5过表达转化株，Cas‑oswrky5为基因编辑植株。
具体实施方式
[0033] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0034] 本发明所使用的各种原料及各项设备，如无特别说明，均为常规市售产品，能够通过市场购买直接获得。
[0035] 本发明实施例所用引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司和上海生工生物工程股份有限公司合成。
[0036] 所述的水稻高抗稻瘟病株系H4和感病品种中二软占(ZE)已在文献“水稻抗稻瘟病蛋白Pik2‑H4基因的克隆及互作蛋白的筛选[J].广东农业科学,2014,(04):156‑160.”中公开。
[0037] 所述的稻瘟病菌(M.oryzae)GDYJ7已在文献“吴澎志，响应稻瘟病菌侵染的水稻MicroRNA鉴定及初步功能研究(D)，2019”中公开。
[0038] 所述的过量表达载体pOX已在文献“水稻SDG711和SDG723的克隆与功能分析[D].华南农业大学,2012”中公开。
[0039] 所述的pGTR质粒和pRGEB32载体及农杆菌EHA105已在文献“Xie,K,Min kenbergB.,YangY.,Boosting CRISPR/Cas9 mμltiplex editing capability with the endogenous tRNA‑processing system.Proceedings of the National Academy of Sciences 2015,112(11),”中公开。
[0040] 实施例1 OsWRKY5的序列分析及克隆
[0041] 1)水稻叶片总RNA的提取与OsWRKY5的克隆
[0042] 取中二软占四叶期水稻幼苗，在研钵中用液氮研磨成粉状，转入1.5mL离心管，并按照每100mg材料加入1mL的比例加入Trizol试剂(Invitrogen公司)，混合均匀；按照每100mg材料加入200μL的比例加入氯仿，混合均匀10,000g，4℃离心15min，弃去下层有机相，收集水相转移至的离心管内；加入600μL异丙醇，混合均匀，室温静置20min，10,000g，4℃离心15min，收集沉淀，待异丙醇挥发后溶于无RNA酶的超纯水中。取出‑80℃保存的水稻叶片总RNA，加入2μL的Oligo(dT)16(10mM)，混匀后置于70℃中水浴5min；水浴5min后，在冰上向EP管中先后加入dNTP Mixture(10mM)2μL、5×RT Buffer 4μL、RNase抑制剂1μL(10U/μL)、RNase‑free ddH2O 8μL、ReverTraAce 1μL；将EP管置于PCR仪中，按30℃10min，42℃60min，
99℃5min，40℃5mi n反应后，得到第一链的单链cDNA，利用引物：OsWRKY5‑F：5'‑ATGGAGAT GATGGTGCAGAAGC‑3'(SEQ ID NO:1)、OsWRKY5‑R：5'‑TCAGGTGGGA GACGTGCCG‑3'(SEQ ID NO:2)进行PCR。PCR反应体系为：cDNA模板2μL、上下游引物(10μM)各1.5μL、dNTP(2mM)5μL、
10×KOD PCR buffer 5μL、MgSO4(25mM)2μL、KOD Plus 1μL，补ddH2O至50μL。扩增条件为：94℃变性3min、55℃30s、68℃2min 32个循环、72℃延伸10min，得到全长的OsWRKY5 cDNA，然后将其送往上海英俊公司进行测序分析。
99℃5min，40℃5mi n反应后，得到第一链的单链cDNA，利用引物：OsWRKY5‑F：5'‑ATGGAGAT GATGGTGCAGAAGC‑3'(SEQ ID NO:1)、OsWRKY5‑R：5'‑TCAGGTGGGA GACGTGCCG‑3'(SEQ ID NO:2)进行PCR。PCR反应体系为：cDNA模板2μL、上下游引物(10μM)各1.5μL、dNTP(2mM)5μL、
10×KOD PCR buffer 5μL、MgSO4(25mM)2μL、KOD Plus 1μL，补ddH2O至50μL。扩增条件为：94℃变性3min、55℃30s、68℃2min 32个循环、72℃延伸10min，得到全长的OsWRKY5 cDNA，然后将其送往上海英俊公司进行测序分析。
[0043] 2)OsWRKY5序列分析与同源比对分析
[0044] OsWRKY5基因组序列全长5,421bp，CDS全长为1,425bp，包含5个外显子和4个内含子，编码474aa(图1)。利用NCBI Blast Protein功能检测OsWRKY5蛋白结构中分别含有保守的WRKYGQK结构域。通过CLC sequence将OsWRKY5基因序列与同源家族基因序列比对发现，OsWRKY5蛋白WRKYGQK保守结构域后有一个C2H2型的锌指结构C‑X5‑C‑X23‑HXH，属于WRKY家族下第二大类的a亚组(C‑XM‑C‑XN‑HXC/H)蛋白(图2)。
[0045] 实施例2 OsWRKY5的表达模式分析
[0046] 将抗病品种H4以及感病品种ZE分别接种稻瘟病菌GDYJ7(ddH2O为对照)，并且在接种后不同时间点取样，利用实时荧光定量检测OsWRKY5的表达变化情况。所用的引物序列如下：
[0047] OsWRKY5‑qPCR‑F：5'‑GGCTCCAATGATCAGTGATGGA‑3'(SEQ ID NO:3)
[0048] OsWRKY5‑qPCR‑R：5'‑AGCCATTGTGCATCGGTAGT‑3'(SEQ ID NO:4)
[0049] Actin‑F：5'‑GAAGATCACTGCCTTGCTCC‑3'(SEQ ID NO:5)
[0050] Actin‑R：5'‑CGATAACAGCTCCTCTTGGC‑3'(SEQ ID NO:6)
[0051] 结果显示(图3)，稻瘟病菌侵染后，OsWRKY5的表达量在抗病材料H4中呈先上升后下降再上升的趋势，并且在接种后72h时达到峰值，而OsWRKY5的表达量在感病品种ZE中一直较低，变化趋势不明显，这一结果表明抗病反应发生后，OsWRKY5会被稻瘟病菌侵染诱导而激活。
[0052] 实施例3 OsWRKY5的转录激活活性分析
[0053] 将OsWRKY5蛋白按照结构域分成三段，N端(1‑200aa)、WRKY(201‑300aa)、C端(301‑474aa)。将这些分段与全长序列分别与pGBKT7质粒(Clontech公司)连接构建获得重组质粒，将它们分别转入酵母菌株Y2HGold(Clontech公司)中，在酵母表达系统中检测转录因子OsWRKY5的具体转录激活区域。所用的引物序列如下：
[0054] BD‑OsWRKY5‑F：
[0055] 5'‑atggccatggaggccgaattcATGGAGATGATGGTGCAGAAGC‑3'(SEQ ID NO:7)[0056] BD‑OsWRKY5‑R：
[0057] 5'‑ccgctgcaggtcgacggatccTCAGGTGGGAGACGTGCCG‑3'(SEQ ID NO:8)
[0058] BD‑OsWRKY5‑N‑F：
[0059] 5'‑atggccatggaggccgaattcATGGAGATGATGGTGCAGAAGC‑3'(SEQ ID NO:9)[0060] BD‑OsWRKY5‑N‑R：
[0061] 5'‑ccgctgcaggtcgacggatccCTCCGCCGCCGGCGCCTG‑3'(SEQ ID NO:10)
[0062] BD‑OsWRKY5‑WRKY‑F：
[0063] 5'‑atggccatggaggccgaattcATGGCGCCGTGCCGGAAG‑3'(SEQ ID NO:11)
[0064] BD‑OsWRKY5‑WRKY‑R：
[0065] 5'‑ccgctgcaggtcgacggatccGGAGAGGAGCATGGCGGC‑3'(SEQ ID NO:12)
[0066] BD‑OsWRKY5‑C‑F：
[0067] 5'‑atggccatggaggccgaattcGGCCCCGCCGTCAGCCGC‑3'(SEQ ID NO:13)
[0068] BD‑OsWRKY5‑C‑R：
[0069] 5'‑ccgctgcaggtcgacggatccGGTGGGAGACGTGCCGCA‑3'(SEQ ID NO:14)
[0070] 结果表明(图4)，只有全长的OsWRKY5蛋白及分段后OsWRKY5‑N具有转录激活特性。表明OsWRKY5蛋白的WRKY结构域只是负责与Pik1‑H4的螺旋卷曲结构域(CC结构域)相互作用或与下游基因组DNA序列结合而不负责转录因子自身的激活特性。
[0071] 实施例6 OsWRKY5的转基因植株稻瘟病抗性鉴定
[0072] 1)OsWRKY5过表达的转基因水稻的构建
[0073] 利用OsWRKY5‑pOX‑F与OsWRKY5‑pOX‑R扩增OsWRKY5cDNA片段，利用同源重组的方法将此cDNA连接到双元载体pOX载体上。得到OX‑OsWRKY5重组载体，转化大肠杆菌DH5α后通过测序鉴定阳性转化子用于后续农杆菌转化实验，所用农杆菌为EHA105，转化材料为H4。所用引物序列如下：
[0074] OsWRKY5‑pOX‑F：
[0075] 5'‑gggtaccggcgcgccaagcttATGGAGATGATGGTGCAGAAGC‑3'(SEQ ID NO:15)[0076] OsWRKY5‑pOX‑R：
[0077] 5'‑caattcacacttgtaggatccTCAGGTGGGAGACGTGCCG‑3'(SEQ ID NO:16)[0078] 2)OsWRKY5敲除的转基因水稻的构建
[0079] OsWRKY5敲除载体构建参考谢卡斌教授2015年发表文章中的方法(Xieet al.，2015)。利用OsWRKY5的CDS序列在CRISPR/Cas9在线靶点设计网站(http://
crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)寻找两个合适的靶点，根据靶点设计引物，以pGTR质粒为模板扩增构建gRNA‑靶点序列‑tRNA‑gRNA‑靶点序列‑tRNA片段。将Cas9蛋白表达载体pRGEB32用BsaI进行单酶切，将得到的带有靶点的片段与载体进行重组连接，将重组载体转化大肠杆菌DH5α后进行测序鉴定，阳性转化子将用于后续农杆菌转化实验，所用农杆菌为EHA105，转化材料为H4。所用引物序列如下：
crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)寻找两个合适的靶点，根据靶点设计引物，以pGTR质粒为模板扩增构建gRNA‑靶点序列‑tRNA‑gRNA‑靶点序列‑tRNA片段。将Cas9蛋白表达载体pRGEB32用BsaI进行单酶切，将得到的带有靶点的片段与载体进行重组连接，将重组载体转化大肠杆菌DH5α后进行测序鉴定，阳性转化子将用于后续农杆菌转化实验，所用农杆菌为EHA105，转化材料为H4。所用引物序列如下：
[0080] OsWRKY5‑pOX‑F：
[0081] 5'‑gggtaccggcgcgccaagcttATGGAGATGATGGTGCAGAAGC‑3'(SEQ ID NO:17)[0082] OsWRKY5‑pOX‑R：
[0083] 5'‑caattcacacttgtaggatccTCAGGTGGGAGACGTGCCG‑3'(SEQ ID NO:18)[0084] OsWRKY5‑bd1‑F：
[0085] 5'‑taGGTCTCCATCCCATCCGCAgttttagagctagaa‑3'(SEQ ID NO:19)
[0086] OsWRKY5‑bd1‑R：
[0087] 5'‑cgGGTCTCAGGATCAGCAGCAtgcaccagccgggaa‑3'(SEQ ID NO:20)
[0088] OsWRKY5‑bd2‑F：
[0089] 5'‑taGGTCTCCTGATGGTGGCGAgttttagagctagaa‑3'(SEQ ID NO:21)
[0090] OsWRKY5‑bd2‑R：
[0091] 5'‑cgGGTCTCAATCAGAGTCAGCtgcaccagccgggaa‑3'(SEQ ID NO:22)
[0092] Recom‑F：
[0093] 5'‑GTGCAGATGATCCGTGGCAACAAAGCACCAGTGGT‑3'(SEQ ID NO:23)
[0094] Recom‑R：
[0095] 5'‑CTATTTCTAGCTCTAAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG‑3'(SEQ ID NO:24)[0096] 3)转基因植株稻瘟病抗性鉴定
[0097] 上述转基因植株经潮霉素筛选鉴定及荧光定量PCR鉴定后，我们选取了过表达和功能完全缺失的基因编辑的纯合系植株(各3株)用于下一步实验。对过表达及基因编辑植株分别采用喷雾法和打孔法接种稻瘟病菌GDYJ7(ddH2O作为对照)，8d后调查病情。并进一步通过荧光定量检测病程相关基因PR1b、PR1a、PR10的表达量。所用引物序列如下：
[0098] PR10‑F：5'‑AAGTCGGATGTGCTCGAGG‑3'(SEQ ID NO:25)
[0099] PR10‑R：5'‑GATGTCCTTCTCCTTCTCC‑3'(SEQ ID NO:26)
[0100] PR1a‑F：5'‑AAGCTGGAGCACTCGGACT‑3'(SEQ ID NO:27)
[0101] PR1a‑R：5'‑ACACCACCTGCGTGTAGTG‑3'(SEQ ID NO:28)
[0102] PR1b‑F：5'‑ACTGGACGGCGGCGAGCGCG‑3'(SEQ ID NO:29)
[0103] PR1b‑R：5'‑CTTATAGTTGCATGTGATG‑3'(SEQ ID NO:30)
[0104] Actin‑F：5'‑GAAGATCACTGCCTTGCTCC‑3'(SEQ ID NO:31)
[0105] Actin‑R：5'‑CGATAACAGCTCCTCTTGGC‑3'(SEQ ID NO:32)
[0106] 结果表明(图5)：在抗病背景下(WT)，OsWRKY5基因编辑植株表现为感病，而OsWRKY5过表达植株未有显著的抗性变化，但在OsWRKY5过表达植株中荧光定量检测病程相关基因PR1b、PR1a、PR10的表达量显著高于野生型，而在OsWRKY5基因编辑植株中表达量显著低于野生型，推测OsWRKY5正调控稻瘟病抗性，可以通过在水稻种质中过表达OsWRKY5来提高稻瘟病抗性。
[0107] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。