一组二套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族的技术体系

摘要

本发明公开了一组二套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族的技术体系。该技术体系由2套自成体系的“抗病功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级检测标记组成，并各自逐级推进；供试品种是否携带目标基因由各套技术体系检测的综合结果而独立决定。该技术体系可用于稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因的鉴别、挖掘、克隆及利用，具有系统而严谨的包容性及可比性。可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的多样性及合理布局，以延长其使用寿命。

权利要求

1.一种具包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因的方法，其特征在于，该方法由2套自成体系的“抗病功能性单倍型‑抗病等位基因”两级检测标记组成，并各自逐级推进；供试品种是否携带目标基因由各套方法检测的综合结果而独立决定；

具体地，所述方法包含：

(1)一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的方法包含：(a)该基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：

通过家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；

设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；

(b)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑C的检测程序：基因Pia‑C序列如GenBankOL773678及OL773679所示；

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个功能特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pia‑C基因携带者属于Pia抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pia‑C参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pia‑C；

(2)一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的方法包含：(c)该基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：

通过基因家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；

(d)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F的检测程序：基因Pii‑F序列如GenBank MH490982.1及MH490983.1所示；

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个功能特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pii‑F基因携带者属于Pii抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pii‑F参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pii‑F；

(e)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M的检测程序：基因Pii‑M序列如GenBank EU869185.1及EU869186.1所示；

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个功能特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pii‑M基因携带者属于Pii抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pii‑M参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pii‑M；

上述方法中：

G1‑303T Indel(2‑1007)

(a)中单倍型特异性分子标记组合为Pia‑F/N 及Pia‑F/N ；其序列分别为SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示；

其中，标记说明：F/N，功能性functional/非功能性non‑functional；上标G1‑303T意为位于Pia成对基因之#1基因之#303位置的特异性SNP；上标Indel(2‑1007)意为位于Pia成对基因之#2基因之#1007位置的特异性插入/缺失多态性，如此类推；

T1‑2214C Indel(2‑3038)

(b)中目标基因特异性分子标记组合为Pia‑C 及Pia‑C ；其序列分别为SEQ ID NO.5～8和SEQ ID NO.9～10所示；

T1‑2214C

其中，Pia‑C 标记需要2条正向引物与2条反向引物配对才能确保其稳定性及可靠性；

Indel(1‑1333) Indel(2‑1323)

(c)中目标基因特异性分子标记组合为Pii‑F/N 及Pii‑F/N ；其序列分别为SEQ ID NO.11～12和SEQ ID NO.13～16所示；

Indel(2‑1323)

其中，Pii‑F/N 标记需要2条正向引物与2条反向引物配对才能确保其稳定性及可靠性；

G1‑4603A C1‑5687T

(d)中目标基因特异性分子标记组合为Pii‑F 及Pii‑F ；其序列分别为SEQ ID NO.17～18和SEQ ID NO.19～20；

T1‑4591C A2‑1832C

(e)中目标基因特异性分子标记组合为Pii‑M 及Pii‑M ；其序列分别为SEQ ID NO.21～22和SEQ ID NO.23～24。

2.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，应用于在上述2个复杂的稻瘟病抗病基因家族中对新旧等位基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，应用于在上述2个复杂的稻瘟病抗病基因家族中对新旧等位基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘如下6个目标基因：稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pia‑C，其成对基因的序列如GenBank OL773678及OL773679所示；

稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑A，其成对基因的序列如GenBank AB604626.1及AB604621.1所示；

稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F，其成对基因的序列如GenBank MH490982.1及MH490983.1所示；

稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M，其成对基因的序列如GenBank EU869185.1及EU869186.1所示；

稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑BJ，其成对基因的序列如GenBank OL689231及OL689232所示；

稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑F036，其成对基因的序列如GenBank OL689233及OL689234所示。

4.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，利用Pia基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测原理及程序，甄别并推断该基因家族存在整体性测序错误的应用。

5.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，利用具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的方法，甄别该基因家族真假抗病等位基因的应用。

6.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，应用于在未知目标基因的种质资源中，分别鉴定上述2个基因家族的已知目标基因。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，以及挖掘新型的目标基因：稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pia‑C，其成对基因的序列如GenBank OL773678及OL773679所示。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，以及挖掘新型的目标基因：稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑BJ，其成对基因的序列如GenBank OL689231及OL689232所示。

9.根据权利要求6所述应用，其特征在于，以及挖掘新型的目标基因：稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑F036，其成对基因的序列如GenBank OL689233及OL689234所示。

10.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，应用于挖掘并克隆3个新型的抗病等位基因及其序列在植物抗病育种计划中的应用：稻瘟病Pia‑C抗病基因家族等位基因之成对基因的克隆引物序列为SEQ IDNO.25～26及SEQ ID NO.27～28所示；

稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pia‑C，序列如GenBankOL773678及OL773679所示；

稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因之成对基因的克隆引物序列为SEQ ID NO.29～30及SEQ ID NO.31～32所示；

稻瘟病Pii抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑BJ，其成对基因的序列如GenBank OL689231及OL689232所示；

稻瘟病Pii抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑F036，其成对基因的序列如GenBank OL689233及OL689234所示。

说明书

一组二套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pia及Pii抗病

基因家族的技术体系

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，更具体地，涉及一组二套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pia及Pii抗病基因抗病基因家族的技术体系。

背景技术

[0002] 由稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是全球水稻生产最严重的限制因素之一，每年都造成大量的粮食损失。从环境保护及农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗病育种依赖于对育种材料抗性表型的直接鉴定、选择，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定、选择的结果容易造成误差。特别地，抗病基因之间由于基因互作而发生抗谱重叠、覆盖等问题，对同类目标基因聚合表型的直接选择效率很低甚或不可能。随着分子标记鉴定技术的发展，其准确、可靠且不受环境影响等优点使该技术已成为植物育种的主流技术，由此大大提高了育种工作的目的性及效率。

[0003] 另一方面，在寄主植物抗病基因与病原菌无毒基因漫长的“军备竞赛”过程中，抗病基因以进化成本最低的“等位基因家族”(allele family；各个成员位于同一基因座，因此纯合的二倍体个体只能含有一个成员)等形式，产生新的抗病特异性才能跟上无毒基因快速变异的步伐。也就是说，在病原菌长期而强烈的选择压力下，上述“基因家族”一般地产生功能性/非功能性的单倍型(haplotype)分化；如果是在育种计划中长期使用的抗性“基因家族”，在功能性单倍型中会进一步分化为具有不同抗病特异性的“等位基因”(Zhai et al.2011,New Phytologist,189:321‑334)。

[0004] 在上述“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级进化历程中都存在明显而清晰的DNA多态性，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)以及多核苷酸多态性【即基因组分化区域(diverged genomic region)，以及插入/缺失多态性(Insertion/Deletion,InDel)】。在此，将功能基因内部的核苷酸多态性统称为功能特异性核苷酸多态性(简称功能特异性)。由此一方面，不同抗源品种鉴定到的抗病基因经常聚集于同一“基因家族”中，另一方面，广谱持久抗源品种通常在多个“基因家族”中同时存在功能性的抗病基因。以稻瘟病抗病基因为例，在目前报道的100余个主效基因中，据信至少40％是已知基因的等位基因甚或同一基因；这些基因主要聚集于水稻染色体1(Pit及Pi37家族)，2(Pib家族)，6(Pi2/Pi9家族)，9(Pii家族)，11(Pia及Pik家族)以及12(Pita家族)等基因家族中(Sharma et al.2012,Agricultural Research,1:37‑52；Kalia and Rathour 
2019,3Biotech,9:209)。

[0005] 特别地，Pii，Pia及Pik家族都是成对基因(coupled gene,记为：Pia‑1,Pia‑2，如此类推；下同)同时存在时才能表达其功能(Okuyama et al.2011,The Plant Journal,66:467‑479；Zhai et al.2011,New Phytologist,189:321‑334；Takagi et al.2013,New Phytologist,200:276‑283)。

[0006] 如上所述，位于染色体11短臂中间区域的Pia基因家族是在全球水稻，特别是粳稻抗病育种计划中应用最广泛的抗源之一(Okuyama et al.2011,The Plant Journal,66:467‑479)。为了充分利用该抗源基因，科研工作者迄今仅开发、利用了2专利标记【Pia‑C_1,Pia‑C_2,潘庆华等，稻瘟病抗性基因Pia‑C功能特异性分子标记及其方法与应用(ZL201210164522.6)】，以及2个零散的分子标记【Pia‑ID01_2,Kitazawa et al.2019,Breeding Science,69:68‑83；Pia‑STS,Yadav et al.2019,Plos One,14:e0211061)】，以提高其利用效率(粗体为所用标记)。

[0007] 特别地，由申请人开发的2个专利标记，只能鉴别Pia‑C(详见实施例8)。

[0008] 另一方面，位于染色体9着丝粒区域的Pii基因家族也是在全球水稻，特别是粳稻抗病育种计划中应用最广泛的抗源之一(Takagi et al.2013,New Phytologist,200:276‑283)。为了充分利用该抗源基因，科研工作者迄今开发了4个零散的分子标记【Pii‑ID07,Pii‑ID21,Pii‑ID24Kitazawaet al.2019,Breeding Science,69:68‑83；40N23R,Yadav et al.2019,Plos One,14:e0211061】，以提高其利用效率。

[0009] 如上所述，由于Pia及Pii基因家族都是在水稻抗病育种计划中长期且广泛利用的抗源，在稻瘟病菌持续而强烈的选择压力下，在“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级进化层面都产生了复杂而多样的变异。但是，这些研究成果都没有形成具有可操作性的、能广泛应用于生产实践的技术体系。换言之，上述报道的分子标记都是针对特定基因的特定区域或者位点而零散开发的，彼此之间并没有形成具有清晰的可比性、逻辑性、包容性的技术体系。对于复杂的基因组区域、复杂的基因家族而言，由此产生2个突出而现实的问题是：(1)任何没有基于其进化层次而设计的单一分子标记都难以避免因分子标记的技术局限性而产生标记假阳性或者标记假阴性的问题；(2)任何没有基于其进化层次而设计的单一分子标记都不可能构成一个具有包容性及可比性的技术体系而在复杂基因家族中不断地挖掘、鉴定并命名新基因。

发明内容

[0010] 本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一组二套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因的技术体系。该技术体系由2套自成体系的“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级检测标记组成，并各自逐级推进；供试品种是否携带目标基因由各套技术体系检测的综合结果而独立决定。具体包括：

[0011] (1)本发明的第二目的是提供一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系。其中包括：

[0012] (a)提供Pia基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的特异性分子标记及其鉴定方法；

[0013] (b)提供Pia基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑C的特异性分子标记及其鉴定方法；

[0014] (c)利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系鉴别、挖掘并克隆抗病等位基因Pia‑A的应用及实例；

[0015] (d)利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系甄别测序错误的应用及实例；

[0016] (e)利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系甄别其真假等位基因的应用及实例；

[0017] (f)利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广西稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例；

[0018] (g)提供上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例。

[0019] (2)本发明的第三目的是提供一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系。其中包括：

[0020] (h)提供Pii基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的特异性分子标记及其鉴定方法；

[0021] (i)提供Pii基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F的特异性分子标记及其鉴定方法；

[0022] (j)提供Pii基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M的特异性分子标记及其鉴定方法；

[0023] (k)利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广西稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例；

[0024] (l)利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的辽宁稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例；

[0025] (m)提供上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例。

[0026] (3)本发明的第四目的是提供基于PCR技术的同源基因克隆手段分离克隆并验证上述等位基因的应用及实例。

[0027] 本发明实现上述目的的技术方案同权利要求书和具体实施例中所记载。

[0028] 本发明提供一组二套的技术体系可用于稻瘟病Pia及Pii抗病等位基因家族等位基因的鉴别、挖掘并克隆，具有系统而严谨的包容性及可比性。可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的多样性及合理布局，以延长其使用寿命。

附图说明

[0029] 图1.一组二套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族之技术体系开发及应用的路线图。

[0030] 图2.Pia抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，

[0031] 已克隆的Pia(本专利记为Pia‑A，以示区别)【供体品种Aichi Asahi；Okuyama et al.2011】之成对基因的基因登录号为：AB604626.1及AB60421；为了便于序列比对分析，加入了5个推测为目标基因携带者的测序参考品种Sasanishiki,CO39,Nipponbare(NPB),Hitomebore,Shennong 265；以及2个推测为非目标基因携带者的测序参考品种Suijing 18,Koshihikari相应的基因组序列；

[0032] 所有已经验证的单倍型及等位基因的特异性SNP都已经编号(按标记使用顺序)并绿色标注(详见图2～4)。

[0033] 特别地，由于上述测序品种的参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其成对基因的第一张，以便结合图3～4全面地了解Pia抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

[0034] 图3.Pia抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用[0035] 3a:1个Pia家族之#1成对基因单倍型特异性的最优SNP；

[0036] 3b:1个Pia家族之#2成对基因单倍型特异性的最优SNP；

[0037] 3c:2个Pia家族最优的单倍型特异性标记【#a‑1，上带，非功能性单倍型；下带，功能性单倍型；#a‑2，上带，功能性单倍型；下带，非功能性单倍型】对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0038] 功能性单倍型品种：CK1,Aichi Asahi(Pia‑A)；CK2,Sasanishiki(Pia‑A)；CK3,Nipponbare(Pia‑A)；CK4,Shennong 265(Pia‑A)；CK5,CO39(Pia‑C)；CK6,C101LAC(Pia‑C)；CK7,C101A51(Pia‑C)；CK8,Guangchangai(Pia‑C)；

[0039] 非功能性单倍型品种：CK9,Shin 2(Pia‑Null)；CK10,Fujisaka 5(Pia‑Null)；CK11,Kusabue(Pia‑Null)；CK12,Kasalath(Pia‑Null)；CK13,Koshihikari(Pia‑Null)；
CK14,Suijing 18(Pia‑Null)；M,DL‑500size marker；

[0040] 特别地，供试品种CK3及CK4之序列发生错误，与非功能性单倍型品种Suijing 18及Koshihikari的序列不同，应属于功能性单倍型品种；

[0041] 供试品种说明：14个Pia第一套参考品种之信息如上所述，如非必要，以下恕不赘述。

[0042] 标记说明：#a‑1及#a‑2，为标记的编号，意为Pia之#1及#2标记；Pia‑F/NG1‑303T，基因符号为斜体，表示功能基因；基因符号为正体，表示标记；F/N，功能性(functional)/非功能性(non‑functional)；上标G1‑303T，意为位于#1成对基因之#303位置的特异性SNP，如此类推；

[0043] 特别地，供试品种之2个单倍型特异性标记的基因型都是功能性单倍型时，才能被判断为功能性单倍型品种。

[0044] 图4.Pia抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑C功能特异性分子标记的开发及应用

[0045] 4a:1个之Pia‑C之#1成对基因特异性的最优SNP；

[0046] 4b:1个之Pia‑C之#2成对基因特异性的最优SNP；4c:2个Pia‑C特异性标记【#a‑3及#a‑4,上带，非目标基因；下带，目标基因】对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，其中，[0047] 目标基因品种：CK5,CO39(Pia‑C)；CK6,C101LAC(Pia‑C)；CK7,C101A51(Pia‑C)；CK8,Guangchangai(Pia‑C)；

[0048] 非目标基因品种：其余10个Pia第一套参考品种。

[0049] 图5.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系鉴别抗病等位基因Pia‑A的应用及实例

[0050] 5a:1个Pia家族之#1成对基因单倍型特异性的最优SNP(另一个详见图3)；

[0051] 5b:1个之Pia‑C之#2成对基因特异性的最优SNP(另一个详见图4)；

[0052] 5c:2个Pia家族最优的单倍型特异性标记【#a‑1，上带，非功能性单倍型；下带，功能性单倍型；#a‑2，上带，功能性单倍型；下带，非功能性单倍型】对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，结果表明，CK1～4与CK5～8都属于功能性单倍型品种；

[0053] 5d:2个Pia‑C特异性标记【#a‑3及#a‑4,上带，非目标基因；下带，目标基因】对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，结果表明，CK1～4与CK5～8的基因型不同，不属于Pia‑C；

[0054] 综合上述结果推断，CK1～4为功能性单倍型之Pia‑A携带者。亦即，[0055] 目标基因品种：CK1,Aichi Asahi(Pia‑A)；CK2,Sasanishiki(Pia‑A)；CK3,Nipponbare(Pia‑A)；CK4,Shennong 265(Pia‑A)；

[0056] 非目标基因品种：其余10个Pia第一套参考品种。

[0057] 图6.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系甄别测序错误的应用及实例

[0058] 6a:3个Pia家族之#1成对基因单倍型特异性的最优SNP，其中#a‑1为专利标记SNP，另外2个为本实例新增加的甄别标记SNP；

[0059] 6b:1个Pia家族之#2成对基因单倍型特异性的最优SNP，作为本实例新增加的甄别标记SNP；

[0060] 6c:2个Pia家族最优的单倍型特异性专利标记对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例(详见图3)，结果表明，Nipponbare,Shennong 265等供试品种之序列发生错误，与非功能性单倍型品种Suijing 18的序列不同，CK1～8同属于功能性单倍型品种；

[0061] 6d:3个新增加的甄别标记对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，结果表明，与上述结果一样，Nipponbare,Shennong 265等供试品种之序列发生错误，与非功能性单倍型品种Suijing 18的序列不同，CK1～8同属于功能性单倍型品种；

[0062] 结论：Nipponbare,Shennong 265等测序品种于Pia家族之2个成对基因都发生整体性的测序错误；亦即，在序列表中，Shennong 265以上6个测序品种都是功能性单倍型品种，其序列与Aichi Asahi归为一类。

[0063] 图7.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系甄别其真假等位基因的应用及实例

[0064] 7a:1个Pia家族之#1成对基因之Pia‑C等位基因特异性的最优SNP，此为专利标记SNP；

[0065] 7b:1个Pia家族之#2成对基因之Pia‑C等位基因特异性的最优SNP，此为专利标记SNP；

[0066] 7c:CK2(Sasanishiki)及CK5(CO39)于Pia家族之#2成对基因之等位基因特异性的候选SNP，作为本实例新增加的甄别标记SNP；

[0067] 7d:2个Pia家族之Pia‑C最优的等位基因特异性专利标记对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，结果表明，CK5～8为Pia‑C携带者，而CK1～4则推断为Pia‑A携带者(详见图4～5)；

[0068] 7e:2个新增加的甄别标记对14个Pia第一套参考品种的鉴定实例，结果表明，二者皆演绎为Pia家族之单倍型特异性标记，而非CK2(Sasanishiki)及CK5(CO39)特异性的标记；具体之，Shennong265以上所有功能性单倍型品种的SNP皆为不可酶切的CC，而Suijing 18等非功能性单倍型品种的SNP皆为可酶切的TA；

[0069] 结论：Pia家族迄今只有2个等位基因，Pia‑C及Pia‑A。

[0070] 图8.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广西稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。其中，

[0071] 8a:基于2个最优的一级标记对52个供试品种的鉴定，结果表明，仅Q2634～38,Q2670～71,Q2673,Q2675～77,Q2679～80,Q2687～88,Q2695,Q2704～06等19个品种为非功能性单倍型品种(黒色)；其余33个品种为功能性单倍型品种(红色)；

[0072] 8b:基于2个最优的二级标记(Pia‑C功能特异性)对52个供试品种的鉴定，结果表明，仅Q2684,Q2689,Q2691等3个品种为Pia‑C携带者(蓝色)；其余30个功能性单倍型品种为Pia‑A携带者(绿色)；

[0073] 其中，3个Pia第二套参考品种为，CK1,Aichi Asahi(Pia‑A)；CK2，CO39(Pia‑C)；CK3,Nipponbare(Pia‑A)。

[0074] 图9.利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例

[0075] 9a～b:本发明之技术体系对14个Pia第一套参考品种的鉴定，结果表明，CK1～8为功能性单倍型品种，其中，CK1～4为Pia‑A携带者；CK5～8为Pia‑C携带者；

[0076] 9c1:Pia他方标记技术‑1(Pia‑C_1,Pia‑C_2；ZL201210164522.6)对14个Pia第一套参考品种的鉴定，结果表明，该专利标记与本技术体系之二级标记的效果相似，能够清晰地鉴别Pia‑C携带者，但是却无法像本技术体系那样，通过两级标记体系，在鉴别功能性/非功能性单倍型的基础上，完美地鉴别等位基因Pia‑A及Pia‑C的携带者；

[0077] 9c2:Pia他方标记技术‑2(Pia‑ID01_2,Kitazawa et al.2019,Breeding Science,69:68‑83；Pia‑STS,Yadav et al.2019,Plos One,14:e0211061)对14个Pia第一套参考品种的鉴定，结果表明，该2个标记类似于本技术体系之一级标记，能够清晰地鉴别Pia抗病基因家族的携带者，却不能进一步鉴别其中的等位基因；

[0078] 结论：本发明之技术体系比上述2套他方标记技术具有实质性的创新性、严谨性及优越性。

[0079] 图10.Pii抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，

[0080] 该基因家族迄今已经分离克隆了2个等位基因，Pii‑M(＝Pi5；GenBank EU869185.1及EU869186.1；Lee et al.2009,Genetics,181:1627‑1638；供体品种：IRBL5‑M)；Pii‑F(＝Pii；GenBank MH490982.1及MH490983.1；Takagi et al.2009,New Phytologist,200:276‑283；供体品种：Fujisaka 5)。为了便于序列比对分析，除了上述2个供体品种，加入了2个推测为目标基因携带者的测序参考品种Minghui 63(MH63),Shuhui 498(SH498)；以及5个推测为非目标基因携带者的测序参考品种Nipponbare(NPB),Shennong 265(SN265),Suijing 18(SJ18),Tetep(TTP),IR64相应的基因组序列；

[0081] 所有已经验证的单倍型及等位基因的特异性SNP都已经编号(按标记使用顺序)并绿色标注(详见图10～13)；

[0082] 特别地，由于上述测序品种之参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其成对基因的第一张，以便结合图11～13全面地了解Pii抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

[0083] 图11.Pii抗病等位基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性标记的开发及应用。

[0084] 11a:1个Pii家族之#1成对基因单倍型特异性的最优SNP；

[0085] 11b:1个Pii家族之#2成对基因单倍型特异性的最优SNP；

[0086] 11c:2个Pii最优的单倍型特异性标记【#i‑1及#i‑2，上带，非功能性单倍型；下带，功能性单倍型】对14个Pii第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0087] 功能性单倍型品种：CK1,Fujisaka 5(Pii‑F)；CK2,IRBLi‑F5(Pii‑F)；CK3,IRBL3‑CP4(Pii‑F)；CK4,IRBL5‑M(Pii‑M)；CK5,C104PKT(Pii‑M)；CK6,Minghui 63(Pii‑M)；CK7,Shuhui 498(Pii‑M)；

[0088] 非功能性单倍型品种：CK8,Shin 2(Pii‑Null)；CK9,Aichi Asahi(Pii‑Null)；CK10,IR64(Pii‑Null)；CK11,Tetep(Pii‑Null)；CK12,Shennong 265(Pii‑Null)；CK13,Suijing 18(Pii‑Null)；CK14,Nipponbare(Pii‑Null)；M,DL‑500 size marker；

[0089] 供试品种说明：14个Pii第一套参考品种之信息如上所述，如非必要，以下恕不赘述。

[0090] 图12.Pii抗病基因簇之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F特异性分子标记的开发及应用

[0091] 12a～b:2个Pii‑F之#1成对基因特异性的最优SNP(#2成对基因无)；

[0092] 12c:2个Pii‑F特异性标记【#i‑3及#i‑4,上带，目标基因；下带，非目标基因】对14个Pii第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0093] 目标基因品种：CK1,Fujisaka 5(Pii‑F)；CK2,IRBLi‑F5(Pii‑F)；CK3,IRBL3‑CP4(Pii‑F)；

[0094] 非目标基因品种：其余11个Pii第一套参考品种。

[0095] 图13.Pii抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M特异性分子标记的开发及应用

[0096] 13a:1个Pii‑M之#1成对基因特异性的最优SNP；

[0097] 13b:1个Pii‑M之#2成对基因特异性的最优SNP；

[0098] 13c:2个Pii‑M特异性标记【#i‑5,上带，目标基因；下带，非目标基因；#i‑6,上带，非目标基因；下带，目标基因】对14个Pii第一套参考品种的鉴定实例，其中，[0099] 目标基因品种：CK4,IRBL5‑M(Pii‑M)；CK5,C104PKT(Pii‑M)；CK6,Minghui 63(Pii‑M)；CK7,Shuhui 498(Pii‑M)；

[0100] 非目标基因品种：其余10个Pii第一套参考品种。

[0101] 图14.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广西稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。其中，

[0102] 14a:基于2个最优的一级标记对52个供试品种的鉴定，结果表明，Q2674～76,Q2678～79,Q2682～83,Q2687～2702等23个品种为功能性单倍型品种(红色)；其余29个品种为非功能性单倍型品种(黒色)；

[0103] 14b:基于二级标记对52个供试品种的鉴定，其中，

[0104] b1:2个最优的Pii‑F特异性标记对52个供试品种的鉴定，结果表明，无Pii‑F携带者(蓝色)；

[0105] b2:2个最优的Pii‑M特异性标记对52个供试品种的鉴定，结果表明，Q2674～76,Q2678～79,Q2683,Q2687～89等18个品种为Pii‑M携带者(绿色)；

[0106] 综合上述结果推断，Q2682,Q2699～2702等5个品种的基因型一致且与Pii‑F及Pii‑M的皆不同，因此，推断为Pii家族新型等位基因的携带者，记为：Pii‑F036(Q2682；紫色)。

[0107] 其中，3个Pii第二套参考品种为，CK1,Fijisaka 5(Pii‑F)；CK2，IRBL5‑M(Pii‑M)；CK3,Nipponbare(Pii‑Null)。

[0108] 图15.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的辽宁稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。其中，

[0109] 15a:基于2个最优的一级标记对58个供试品种的鉴定，结果表明，Q2712,Q2717,Q2720,Q2727～30,Q2746～47,Q2749～51,Q2753～54,Q2757～58,Q2760,Q2762,Q2765,Q2771等20个品种为功能性单倍型品种(红色)；其余38个品种为非功能性单倍型品种(黒色)；

[0110] 15b:基于二级标记对58个供试品种的鉴定，其中，

[0111] b1:2个最优的Pii‑F特异性标记对58个供试品种的鉴定，结果表明，Q2712,Q2717,Q2720,Q2727～30,Q2746～47,Q2749～50,Q2753～54,Q2758,Q2760,Q2762,Q2765,Q2771等18个品种为Pii‑F携带者(蓝色)；

[0112] b2:2个最优的Pii‑M特异性标记对52个供试品种的鉴定，结果表明，仅Q2757等1个品种为Pii‑M携带者(绿色)；

[0113] 综合上述结果推断，Q2751等1个品种为Pii家族新型等位基因的携带者(紫色)，因为该品种的基因型与Pii‑F及Pii‑M以及Pii‑F036皆不同，被命名为Pii‑BJ(Q2751)；

[0114] 3个Pii第二套参考品种的信息如上所述。

[0115] 图16.利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例

[0116] 16a～b:本发明之技术体系对上述14个Pii第一套参考品种的鉴定，结果表明，CK1～7为功能性单倍型品种，其中，CK1～3为Pii‑F携带者；CK4～7为Pii‑M携带者；

[0117] 16c:Pii他方标记技术(Pii‑ID07,Pii‑ID21,Pii‑ID24,Kitazawa et al.2019,Breeding Science,69:68‑83；40N23R,Yadav et al.2019,Plos One,14:e0211061)对14个Pii第一套参考品种的鉴定，结果表明，所有4个标记及其组合的检测结果都不具有可比性及逻辑性；

[0118] 结论：本发明之技术体系具有实质性的创新性、严谨性及优越性；

[0119] 14个Pii第一套参考品种的信息如上所述。

[0120] 图17.利用基于PCR技术的同源基因克隆手段克隆并验证稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因的应用及实例

[0121] 17a:Pia主要抗病等位基因的结构图以及克隆示意图；

[0122] 17b:Pii主要抗病等位基因的结构图以及克隆示意图；

[0123] 17c:Pia‑C转基因T1株系及其供体品种(CO39)及受体品种(Fujisaka 5)接种鉴定的抗病表现型以及基于转基因选择标记Hpt的基因型共分离分析，结果表明，大部分自己一后代的表现型与基因型是一致的；#7,9,10个体则不一致，可能涉及接种逃避及转基因沉默的问题；

[0124] 其中，实验室常用的载体pGEM‑T(Promege Corporation,WI,USA)用于目标基因的克隆、测序，多基因聚合转化载体pYLTC380DTH(Lin et al.2003,PNAS,100:5962‑5967；潘金媚2013，华南农业大学硕士学位论文)用于目标基因的遗传转化；R,resistant,抗病性；S,susceptible,感病性。

[0125] 图18.一组二套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因之技术体系(两级标记体系)的实证图(摘要附图)

[0126] 18a:Pia之一级标记对14个Pia第一套参考品种的检测；

[0127] 18b:Pia之二级标记对14个Pia第一套参考品种的检测；

[0128] 18c:Pii之一级标记对14个Pii第一套参考品种的检测；

[0129] 18d:Pii之二级标记对14个Pii第一套参考品种的检测；

[0130] 14个Pia第一套参考品种及14个Pii第一套参考品种的信息如上所述；

[0131] 特别地，2套技术体系以独立的颜色标示。

具体实施方式

[0132] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步的阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，皆为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0133] 在实施例中所用的所有水稻品种：14个Pia第一套参考品种(含2个Pia第二套参考品种)及14个Pii第一套参考品种(含3个Pii第二套参考品种)；供试品种之广西种质资源群体(Q2631～2706)，以及黑龙江种质资源群体(Q2709～2773)皆为申请人实验室收集、保存，并在本研究领域中常用且已在包括但不限于上述文献中公开【Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321‑334,https://nph.onlinelibrary.wiley.com；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics 125:1047‑1055,https://www.springer.com/journal/122；叶雪梅，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)；林丽萍，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)；附件图表可在各自杂志网站获得】。

[0134] 本专利开发及应用的技术路线图如图1所示。

[0135] 实施例1:稻瘟病Pia抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图2～4)[0136] 一、实验方法

[0137] 已克隆的Pia‑A【原称：Pia；供体品种Aichi Asahi；Okuyama et al.2011】之成对基因的GenBank编号为：AB604626.1及AB60421；为了便于序列比对分析，加入了5个推测为目标基因携带者的测序参考品种Sasanishiki,CO39,Nipponbare(NPB),Hitomebore,Shennong 265；以及2个推测为非目标基因携带者的测序参考品种Suijing  18,Koshihikari相应的基因组序列；

[0138] 各个基因ATG～TGA/TAA的范围参考NCBI注释。

[0139] 通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

[0140] 二、实验结果

[0141] 序列比较结果如图2～4所示，结果表明：

[0142] (1)Pia抗病基因家族成对基因的序列都存在明显的功能性单倍型(上述6个抗病参考品种之12条参考序列)与非功能性单倍型(上述2个感病参考品种之4条参考序列)的基因组分化(典型位置如图3之标记#a‑1及#a‑2所示)；

[0143] (2)上述Pia抗病基因家族之等位基因之间则存在功能特异性SNP(典型位置如标记图4之标记#a‑3～#a‑4所示)；

[0144] 特别地，测序参考品种Nipponbare,Hitomebore,Shennong 265等3个品种的参考序列发生整体性的错误，应为功能性单倍型品种(详见实施例2～6)；

[0145] 此外，由于上述16条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中成对基因分别仅仅显示其第一张之前半部分，以便结合图3～4全面地了解Pia抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

[0146] 实施例2：Pia抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用(图3)

[0147] 一、实验方法

[0148] 此实施例的实验方法主要参考申请人已发表的论文(Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321‑334；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics,125:1047‑1055)。

[0149] 【以下参考文献与上述的相同，恕不赘述】

[0150] 简述之：

[0151] (1)单倍型特异性分子标记(SNP标记)的设计：根据上述Pia抗病基因家族序列的比对结果，针对功能性/非功能性单倍型分化清晰的2个单倍型特异性最优SNP，以CAPS及dCAPS(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences；Neff et al.2002,Trends in Genetics 18:613‑615)标记的设计原理，利用在线软件dCAPSFinder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行dCAPS标记的引物设计；然后利用引物设计软件Primer Primer 5.0进行标记设计的确认；

[0152] (2)单倍型特异性分子标记(Indel标记)的设计：对于功能性/非功能性单倍型分化清晰的插入/缺失(insertion/deletion,Indel)多态性区域，则直接在其两侧保守且特异性的基因组区域，利用引物设计软件Primer Primer 5.0进行标记设计、确认；

[0153] 【以下分子标记及引物设计程序与上述的相同，恕不赘述】

[0154] 为了叙述方便，分别命名为#a‑1及#a‑2标记(依次类推)；引物序列如下：

[0155] 对于#a‑1标记(上带，非功能性单倍型；下带，功能性单倍型)：

[0156] SEQ ID NO.1(Pia‑F/NG1‑303T‑F；5’‑3’)：

[0157] ACGACGGCAAGCCCAGA；

[0158] SEQ ID NO.2(Pia‑F/NG1‑303T‑R；5’‑3’)：

[0159] AGAGCCCTGAGCTCCGCGAT。

[0160] 对于#a‑2标记(上带，功能性单倍型；下带，非功能性单倍型)：

[0161] SEQ ID NO.3(Pia‑F/NIndel(2‑1007)‑F；5’‑3’)：

[0162] AGGTGCTCGGCGAATTGCT；

[0163] SEQ ID NO.4(Pia‑F/NIndel(2‑1007)‑R；5’‑3’)：

[0164] AGCTGACCAGCATCGGAGT。

[0165] (2)单倍型特异性分子标记的PCR扩增：利用上述2组引物对上述14个Pia第一套参考品种进行PCR扩增。PCR扩增体系(20.0μL)如下：

[0166]

[0167] 【以下PCR扩增体系与上述的相同，恕不赘述】

[0168] PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行25～40个循环(CAPS/dCAPS标记一般为35循环，Indel标记一般为25循环；视检测对象可适当调整)的PCR扩增【94℃变性30sec，退火30sec(#a‑1/57℃,#a‑2/60℃)，72℃延伸25～30sec(视检测对象可适当调整)】，最后72℃延伸5min，PCR产物置于4℃冰箱保存备用。

[0169] 【除了退火温度之外，以下PCR扩增条件与上述的相同，恕不赘述】

[0170] (3)单倍型特异性分子标记的酶切(Indel标记无需酶切)：对于像#a‑1标记那样的CAPS或者dCAPS标记，先取出上述PCR产物，利用相应的限制性内切酶及其最佳温度(#a‑1,HhaI/37℃)进行酶切，反应体系(10.0μL)如下：

[0171]

[0172]

[0173] 在酶切5小时后，4℃冰箱保存备用。

[0174] 【以下PCR扩增产物酶切体系与上述的相同，恕不赘述】

[0175] (4)单倍型特异性分子标记的检测：

[0176] 分别取出上述CAPS或者dCAPS标记的酶切产物，以及Indel标记的PCR产物，向每管酶切产物或者PCR产物中加入10μL 10x loading并混匀，按照如下程序检测；

[0177] 利用微量进样器取1.5～2.5μL产物在10％～12％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(250V,20～120min；可根据检测对象调整)，之后，按照常规的检测方法进行分子标记的拍照、记录。

[0178] 【以下分子标记检测程序与上述的相同，恕不赘述】

[0179] 二、实验结果

[0180] 各个分子标记的大小如图3所示，结果表明，14个Pia第一套参考品种呈现清晰的基因型(单倍型)：

[0181] 功能性单倍型品种：CK1,Aichi Asahi(Pia‑A)；CK2,Sasanishiki(Pia‑A)；CK3,Nipponbare(Pia‑A)；CK4,Shennong 265(Pia‑A)；CK5,CO39(Pia‑C)；CK6,C101LAC(Pia‑C)；CK7,C101A51(Pia‑C)；CK8,Guangchangai(Pia‑C)；

[0182] 非功能性单倍型品种：CK9,Shin 2(Pia‑Null)；CK10,Fujisaka 5(Pia‑Null)；CK11,Kusabue(Pia‑Null)；CK12,Kasalath(Pia‑Null)；CK13,Koshihikari(Pia‑Null)；
CK14,Suijing 18(Pia‑Null)。

[0183] 特别地，供试品种只有2个功能性/非功能性单倍型特异性分子标记都是功能性单倍型时，才能被判断为功能性单倍型品种

[0184] 供试品种说明：14个Pia第一套参考品种之信息如上所述，如非必要，以下恕不赘述。

[0185] 实施例3：Pia抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑C功能特异性分子标记的开发及应用(图4)

[0186] 一、实验方法

[0187] (1)Pia‑C功能特异性分子标记的设计：根据上述Pia抗病基因家族序列的比对结T1‑2214C果，选择最优的2个SNP设计为Pia‑C功能特异性分子标记Pia‑C (#a‑3标记)，Pia‑Indel(2‑3038)
C (#a‑4标记)；引物序列如下：

[0188] 对于#a‑3标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0189] SEQ ID NO.5(Pia‑CT1‑2214C‑F1；5’‑3’)：

[0190] AATAAAGTTTTTGGCTCCGAAGATCAATGTCCT；

[0191] SEQ ID NO.6(Pia‑CT1‑2214C‑F2；5’‑3’)：

[0192] AATAGAGTTTTTGGATCAGAGCAACAATGTCCT；

[0193] SEQ ID NO.7(Pia‑CT1‑2214C‑R1；5’‑3’)：

[0194] CGGTTGGCTTCCTAGAAGACCTGCTAT；

[0195] SEQ ID NO.8(Pia‑CT1‑2214C‑R2；5’‑3’)：

[0196] CGGCAGGCTTGCTAAAAGACCGGCTAT；

[0197] 对于#a‑4标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0198] SEQ ID NO.9(Pia‑CIndel(2‑3038)‑F；5’‑3’)：

[0199] GCCTTTCATCTACTAAATTTACAACAGG；

[0200] SEQ ID NO.10(Pia‑CIndel(2‑3038)‑R；5’‑3’)：

[0201] CAAGTAGCTCAAATTACTCAAGGC；

[0202] 特别地，由于#a‑3标记位于基因组分化显著的区域，为了确保检测结果的可靠性及准确性，该标记被优化为4条引物组合(2F vs 2R)的标记。

[0203] (2)Pia‑C功能特异性分子标记的检测：利用上述2个标记的引物组合，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#a‑3/57℃,#a‑4/58℃)，对14个Pia第一套参考品种进行PCR扩增，然后按照上述酶切体系(#a‑3/MseI/37℃；#a‑4无需酶切)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0204] 二、实验结果

[0205] 各个分子标记的大小如图4所示，结果表明，Pia‑C功能特异性分子标记可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0206] 目标基因品种：CK5,CO39(Pia‑C)；CK6,C101LAC(Pia‑C)；CK7,C101A51(Pia‑C)；CK8,Guangchangai(Pia‑C)；

[0207] 非目标基因品种：其余10个Pia第一套参考品种。

[0208] 实施例4：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系鉴别抗病等位基因Pia‑A的应用及实例(图5)

[0209] (1)如实施例2所述，2个功能性/非功能性单倍型特异性分子标记对14个Pia第一套参考品种检测的结果表明，CK1～8都是功能性单倍型品种(Pia抗病基因家族等位基因的携带者)；

[0210] (2)如实施例3所述，2个Pia‑C功能特异性分子标记对14个Pia第一套参考品种检测的结果表明，CK5～8都是Pia‑C的携带者，而CK1～4对基因型却与非功能性单倍型品种对相同；

[0211] (3)综合上述结果推断，CK5～8应是Pia‑A的携带者，因为它们是功能性单倍型品种，而且其中CK1就是Pia‑A的供体品种。

[0212] 本实施例说明：虽然Pia抗病基因家族的等位基因比较简单(目前仅发现2个)，但是本技术体系具有非凡的包容性且精准鉴别、挖掘其等位基因的能力。

[0213] 实施例5：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系甄别测序错误的应用及实例(图6)

[0214] 如实施例2所述，2个功能性/非功能性单倍型特异性分子标记对14个Pia第一套参考品种检测的结果表明，CK1～8是功能性单倍型品种(Pia抗病基因家族等位基因的携带者)，而CK9～14则是非功能性单倍型品种(非Pia抗病基因家族等位基因的携带者)。此结果明显与测序的结果不一致，因为后者的结果表明Nipponbare,Shennong 265等应该是非功能性单倍型品种(图6c)。为了确认Nipponbare,Shennong 265等品种之Pia抗病基因位点的测序错误是个案还是整体性的，本实施例进一步开发了3个甄别标记，对Pia抗病基因位点更多的基因组区段进行了检测、确认。

[0215] 一、实验方法

[0216] (1)Pia抗病基因家族测序错误甄别标记的设计：根据上述Pia抗病基因家族序列的比对结果，进一步随机选择最优的2个SNP及1个Indel设计为功能性单倍型/非功能性单T1‑68C倍型特异性分子标记Pia‑F/N (#甄别a‑1标记，序列如SEQ ID NO.33‑34所示)，Pia‑F/T1‑200A Indel(2‑3489)
N (#甄别a‑2标记，序列如SEQ ID NO.35‑36所示)，Pia‑F/N (#甄别a‑3标记，序列如SEQ ID NO.37‑38所示)；

[0217] 特别地，由于甄别标记并非在本专利的保护范围(非专利充分必要的标记)，因此，其引物序列排列于“专利标记”系列之后的“甄别标记”系列中，仅作参考(下同)。

[0218] (2)Pia抗病基因家族测序错误甄别标记的检测：利用上述3个标记的引物组合，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#甄别a‑1/54℃,#甄别a‑2/58℃,#甄别a‑3/56℃)，对14个Pia第一套参考品种进行PCR扩增，然后按照上述酶切体系(#甄别a‑1及#甄别a‑2/Bsr I/65℃；#甄别a‑3无需酶切)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0219] 二、实验结果

[0220] 3个甄别标记呈现与上述2个功能性/非功能性单倍型特异性分子标记(#a‑1及#a‑2)完全一致的结果。由此说明，Nipponbare,Shennong 265等品种之Pia抗病基因位点的测序错误是整体性的(图6d)；

[0221] 该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可靠性，不仅可以精准地鉴别Pia抗病基因家族的功能性/非功能性单倍型及其等位基因，还可以可靠地甄别参考序列存在的测序错误，即便是最高质量的Nipponbare参考序列。

[0222] 实施例6：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆Pia抗病基因家族等位基因的技术体系甄别其真假等位基因的应用及实例(图7)

[0223] 一、实验方法

[0224] (1)为了开发Pia‑A的功能特异性分子标记，在Pia抗病基因家族的参考序列(包括#1及#2成对基因)中，仅仅发现2个候选的SNP(T2‑624C,A2‑627C)(图7c)，在Aichi Asahi(Pia‑A)与CO39(Pia‑C)之间存在可能的多态性(图7c)；

[0225] 特别地，将上述Pia‑C功能特异性分子标记(Pia‑C)作为对照，进行比较分析(图7d)；

[0226] (2)按照上述程序将2个SNP开发为Pia‑A的功能特异性分子标记：Pia‑AT2‑624C(#甄A2‑627C别a‑4，序列如SEQ ID NO.39‑40所示),Pia‑A (#甄别a‑5，序列如SEQ ID NO.41‑42所示)，其引物序列排列于“专利标记”系列之后的“甄别标记”系列中，仅作参考；

[0227] (3)上述2个甄别标记的检测：利用上述2个标记的引物组合，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#甄别a‑4/62℃,#甄别a‑5/62℃)，对14个Pia第一套参考品种进行PCR扩增，然后按照上述酶切体系(#甄别a‑4/XcmI/37℃；#甄别a‑5/TaqI/65℃)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0228] 二、实验结果

[0229] 结果表明，二者皆演绎为Pia家族之单倍型特异性标记，而非CK2(Sasanishiki)及CK5(CO39)特异性的标记；具体之，Shennong265以上所有功能性单倍型品种的SNP皆为不可酶切的CC，而Suijing 18等非功能性单倍型品种的SNP皆为可酶切的TA(图7c)；

[0230] 结论：Pia家族迄今只有2个等位基因，Pia‑C及Pia‑A，而且它们只能通过本专利的技术体系才能精准地鉴别出来(详见下述实施例8)。

[0231] 实施例7.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广西稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例(图8)

[0232] (1)本发明之Pia技术体系由“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级检测标记之4个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型检测需优先推进，而进行抗病等位基因的检测。整套技术体系的检测程序及方案如上所述(图3～4；实施例2～3)，恕不赘述。

[0233] (2)利用上述技术体系对44个随机选择的广西稻种资源群体【叶雪梅，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)】进行Pia抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

[0234] 3个品种CK1,Aichi Asahi(Pia‑A)；CK2，CO39(Pia‑C)；CK3,Nipponbare(Pia‑A)作为Pia第二套参考品种也参加了试验。

[0235] 二、实验结果

[0236] (1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，52个供试品种被分类为(图8a)：

[0237] 功能性单倍型品种(红色标示)：Q2631～33,Q2663～69,Q2672,Q2674,Q2678,Q2681～86,Q2689～94,Q2696～2703等33个品种为功能性单倍型品种；

[0238] 非功能性单倍型品种(黑色标示)：Q2634～38,Q2670～71,Q2673,Q2675～77,Q2679～80,Q2687～88,Q2695,Q2704～06等19个品种为非功能性单倍型品种。

[0239] (2)在基于二级标记的抗病等位基因检测中(图6b)，33个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

[0240] 目标基因Pia‑C携带品种(蓝色标示)：仅Q2684,Q2689,Q2691等3个品种；

[0241] (3)综合一级标记及二级标记的检测结果(图6b)，33个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

[0242] 目标基因Pia‑A携带品种(绿色标示)：Q2631～33,Q2663～69,Q2672,Q2674,Q2678,Q2681～83,Q2685～86,Q2690,Q2692～94,Q2696～2703等30个品种；

[0243] 该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可靠性，因为在52个目标基因未知的广西稻种资源群体中，首先鉴别出33个功能性单倍型品种；然后鉴别了3个新型目标基因Pia‑C的携带者；综合一级标记及二级标记的检测结果，则进一步鉴别了30个已知等位基因Pia‑A的携带者。

[0244] 实施8：本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族功能基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例(图9)

[0245] (1)虽然稻瘟病Pia抗病基因家族是在全球水稻，特别是粳稻抗病育种计划中应用最广泛的抗源之一(Okuyama et al.2011,The Plant Journal,66:467‑479)，但是，迄今开发、应用的只有Pia他方标记技术‑1之2个专利标记【Pia‑C_1(记为#他方a‑1),Pia‑C_2(#他方a‑2),潘庆华等，稻瘟病抗性基因Pia‑C功能特异性分子标记及其方法与应用(ZL201210164522.6)】，以及Pia他方标记技术‑2之2个零散的分子标记【Pia‑ID01_2(#他方a‑3),Kitazawa et al.2019,Breeding Science,69:68‑83；Pia‑STS(#他方a‑4),Yadav et al.2019,Plos One,14:e0211061)】；

[0246] 特别地，Pia他方标记a‑1～a‑4因为不是本技术体系之必需标记而仅作参考，其引物序列分别如SEQ ID NO.43～44,45～46,47～48,49～50所示，其检测程序如文献所述；

[0247] (2)以上述Pia他方标记技术‑1及Pia他方标记技术‑2，以上述14个Pia第一套参考品种作为检测对象进行鉴定比较(图9)。结果表明，本发明之技术体系与Pia他方标记技术相比，具有如下突出而确切的创新性及有益效果：

[0248] (a)首先，利用本技术体系2个最优的一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限(红色框；图9a)。在该实例中，在供试的14个Pia第一套参考品种中，CK1～8被鉴定为功能性单倍型品种，CK9～14则为非功能性单倍型品种。这是Pia他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

[0249] (b)在此基础上，利用本技术体系2个最优的二级标记进行抗病等位基因分析，为抗病等位基因Pia‑C的鉴别划出了清晰且可比对的等位基因界限(蓝色框；图8b)。在该实例中，4个功能性单倍型品种CK5～8被Pia‑C的携带者；

[0250] (c)进一步在此基础上，综合一级标记及二级标记检测的结果，推断另外4个功能性单倍型品种CK1～4被Pia‑A的携带者。这是Pia他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

[0251] (d)Pia他方标记技术‑1:2个授权专利的检测效果与本专利之二级标记的相似，能够清晰地鉴别Pia‑C携带者，但是却无法像本技术体系那样，通过两级标记体系，在鉴别功能性/非功能性单倍型的基础上，完美地鉴别等位基因Pia‑A及Pia‑C的携带者(图9c1)；

[0252] (e)Pia他方标记技术‑2:该2个标记类似于本技术体系之一级标记，能够清晰地鉴别Pia抗病基因家族的携带者，却不能进一步鉴别其中的等位基因(图9c2)

[0253] 结论：本发明之技术体系具有实质性的创新性、严谨性及优越性。

[0254] 实施例9:Pii抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图10～13)[0255] 一、实验方法

[0256] 该基因家族迄今由2个功能基因组成：Pii‑F(原称：Pii；供体品种Fujisaka5；Lin et al.2007；成对基因的GenBank：MH490982.1,MH490983.1)，Pii‑M(原称：Pi5；供体品种Moroberekan之重组自交系RIL260；Takagi et al.2013；成对基因的GenBank：EU869185.1,EU869186.1)；为了便于序列比对分析，除了上述2个供体品种，加入了2个推测为目标基因携带者的测序参考品种Minghui 63,Shuhui 498；以及5个推测为非目标基因携带者的测序参考品种Nipponbare,Shennong 265,Suijing 18,Tetep,IR64相应的基因组序列；

[0257] 各个基因ATG～TGA的范围参考NCBI注释；

[0258] 通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

[0259] 二、实验结果

[0260] 序列比较结果如图10～13所示，结果表明：

[0261] (1)Pii抗病基因家族成对基因的序列都存在明显的功能性单倍型(上述4个目标基因携带者之8条参考序列)与非功能性单倍型(上述5个非目标基因携带者之10条参考序列)的基因组分化(典型位置如图11之标记#i‑1及#i‑2所示)；

[0262] (2)上述Pii抗病基因家族之等位基因之间则存在各自特异性SNP(典型位置如标记图12之标记#i‑3及#i‑4，以及图13之标记#i‑5及#i‑6所示)；

[0263] 此外，由于上述18条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中成对基因分别仅仅显示其第一张之前半部分，以便结合图11～13全面地了解Pii抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

[0264] 实施例10：Pii抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用(图11)

[0265] 一、实验方法

[0266] (1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述Pii抗病基因家族序列的比对结果，Indel(1‑1333)选择最优的2个Indel设计为单倍型特异性分子标记Pii‑F/N (#i‑1标记)及Pii‑Indel(2‑1323)
F/N (#i‑2标记)，引物序列如下：

[0267] 对于#i‑1标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

[0268] SEQ ID NO.11(Pii‑F/NIndel(1‑1333)‑F；5’‑3’)：

[0269] ATTTTTGTTCTTCCAGCAACA；

[0270] SEQ ID NO.12(Pii‑F/NIndel(1‑1333)‑R；5’‑3’)：

[0271] ACCTTTCAGAAGCATTGGATT。

[0272] 对于#i‑2标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

[0273] SEQ ID NO.13(Pii‑F/NIndel(2‑1323)‑F1；5’‑3’)：

[0274] GGAGAAGGGTGGAATTTTGATCAGCGCATA；

[0275] SEQ ID NO.14(Pii‑F/NIndel(2‑1323)‑F2；5’‑3’)：

[0276] GGAGAAGAGTGGAACTTTGATCAACGTATA；

[0277] SEQ ID NO.15(Pii‑F/NIndel(2‑1323)‑R1；5’‑3’)：

[0278] ACTATCAAACTGCTTTGGTCACAAAGAAC；

[0279] SEQ ID NO.16(Pii‑F/NIndel(2‑1323)‑R2；5’‑3’)：

[0280] GACTATCAAACTGCTTTTGTCAGAAAGAAC；

[0281] 特别地，由于#i‑2标记位于基因组分化显著的区域，为了确保检测结果的可靠性及准确性，该标记被优化为4条引物组合(2F vs 2R)的标记。

[0282] (2)单倍型特异性分子标记的检测：利用上述2个标记2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#i‑1/52～54℃，#i‑2/58℃)，对下述14个Pii第一套参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，按照上述检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0283] 二、实验结果

[0284] 各个分子标记的大小如图11所示，结果表明，14个Pii第一套参考品种呈现清晰的基因型(单倍型)：

[0285] 功能性单倍型品种：CK1,Fujisaka 5(Pii‑F)；CK2,IRBLi‑F5(Pii‑F)；CK3,IRBL3‑CP4(Pii‑F)；CK4,IRBL5‑M(Pii‑M)；CK5,C104PKT(Pii‑M)；CK6,Minghui 63(Pii‑M)；CK7,Shuhui 498(Pii‑M)；

[0286] 非功能性单倍型品种：CK8,Shin 2(Pii‑Null)；CK9,Aichi Asahi(Pii‑Null)；CK10,IR64(Pii‑Null)；CK11,Tetep(Pii‑Null)；CK12,Shennong 265(Pii‑Null)；CK13,Suijing 18(Pii‑Null)；CK14,Nipponbare(Pii‑Null)。

[0287] 供试品种说明：14个Pii第一套参考品种之信息如上所述，如非必要，以下恕不赘述。

[0288] 实施例11：Pii抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F功能特异性分子标记的开发及应用(图12)

[0289] 一、实验方法

[0290] (1)Pii‑F功能特异性分子标记的设计：根据上述Pii抗病基因家族序列的比对结G1‑4603A果，选择最优的2个SNP分别设计为Pii‑F功能特异性分子标记Pii‑F (#i‑3标记)及C1‑5687T
Pii‑F (#i‑4标记)；引物序列如下：

[0291] 对于#i‑3标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

[0292] SEQ ID NO.17(Pii‑FG1‑4603A‑F；5’‑3’)：

[0293] GGTCACTAATTTTCAAGAATAGTGGTA；

[0294] SEQ ID NO.18(Pii‑FG1‑4603A‑R；5’‑3’)：

[0295] CACTGAGATCCAAAACACGCA；

[0296] 对于#i‑4标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

[0297] SEQ ID NO.19(Pii‑FC1‑5687T‑F；5’‑3’)：

[0298] CCTCCATCTCACACCTAAATG；

[0299] SEQ ID NO.20(Pii‑FC1‑5687T‑R；5’‑3’)：

[0300] CATAAGGAAATTTCAAAGGAAACAC。

[0301] (2)Pii‑F功能特异性分子标记的检测：利用上述2对引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#i‑3/54℃；#i‑4/54℃)，对14个Pii第一套参考品种进行PCR扩增，取出PCR产物，分别按照上述酶切体系(#i‑3,NlaIII/37℃；#i‑4,MseI/37℃)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0302] 二、实验结果

[0303] 各个分子标记的大小如图12所示，结果表明，Pii‑F功能特异性分子标记可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0304] 目标基因品种：CK1,Fujisaka 5(Pii‑F)；CK2,IRBLi‑F5(Pii‑F)；CK3,IRBL3‑CP4(Pii‑F)；

[0305] 非目标基因品种：其余11个Pii第一套参考品种。

[0306] 实施例12：Pii抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M功能特异性分子标记的开发及应用(图13)

[0307] 一、实验方法

[0308] (1)Pii‑M功能特异性分子标记的设计：根据上述Pii抗病基因家族序列的比对结T1 4591C果，选择最优的2个SNP分别设计为Pii‑M功能特异性分子标记Pii‑M ‑ (#i‑5标记)及A2‑1832C
Pii‑M (#i‑6标记)；引物序列如下：

[0309] 对于#i‑5标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

[0310] SEQ ID NO.21(Pii‑MT1‑4591C‑F；5’‑3’)：

[0311] GGTCACTAATTTTCAAGAATAGTGGTA；

[0312] SEQ ID NO.22(Pii‑MT1‑4591C‑R；5’‑3’)：

[0313] CACTGAGATCCAAAACACGCA；

[0314] 对于#i‑6标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

[0315] SEQ ID NO.23(Pii‑MA2‑1832C‑F；5’‑3’)：

[0316] GGTTTGAATTACTTGCATCGTTCAGTGAAATGTAC；

[0317] SEQ ID NO.24(Pii‑MA2‑1832C‑R；5’‑3’)：

[0318] CCAACCATGTCAAGTGCTATCCACTGTT。

[0319] (2)Pii‑M功能特异性分子标记的检测：利用上述2对引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#i‑5/54℃；#i‑6/54℃)，对14个Pii第一套参考品种进行PCR扩增，取出PCR产物，分别按照上述酶切体系(#i‑5,Rsa I/37℃；#i‑6,Nde I/37℃)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0320] 二、实验结果

[0321] 各个分子标记的大小如图13所示，结果表明，Pii‑M功能特异性分子标记可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0322] 目标基因品种：CK4,IRBL5‑M(Pii‑M)；CK5,C104PKT(Pii‑M)；CK6,Minghui 63(Pii‑M)；CK7,Shuhui 498(Pii‑M)；

[0323] 非目标基因品种：其余7个Pii第一套参考品种。

[0324] 实施例13：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广西稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例(图14)

[0325] 一、实验方法

[0326] (1)本发明之Pii技术体系由“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级检测标记之4个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型检测需优先推进，而后续的各个抗病等位基因的检测则没有先后顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述，恕不赘述。

[0327] (2)利用上述技术体系对52个随机选择的广西稻种资源群体【叶雪梅，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)】进行Pii抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

[0328] 3个品种CK1,Fijisaka 5(Pii‑F)；CK2,IRBL5‑M(Pii‑M)；CK3,Nipponbare(Pii‑Null)作为Pii第二套参考品种也参加了试验。

[0329] 二、实验结果

[0330] (1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，52个供试品种被分类为(图14a)：

[0331] 功能性单倍型品种(红色标示)：Q2674～76,Q2678～79,Q2682～83,Q2687～2702等23个品种；

[0332] 非功能性单倍型品种(黑色标示)：Q2631～73,Q2677,Q2680～81,Q2684～86,Q2703～06等29个品种。

[0333] (2)在基于二级标记的抗病等位基因检测中(图14b)，上述23个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

[0334] 目标基因Pii‑F携带品种(蓝色标示)：无；

[0335] 目标基因Pii‑M携带品种(绿色标示)：Q2674～76,Q2678～79,Q2683,Q2687～98等18个品种；

[0336] 新型目标基因Pii‑F036携带品种(紫色标示)：Q2682,Q2699～2702等5个品种(它们的基因型一致且与Pii‑F及Pii‑M的皆不同)；

[0337] 该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可靠性，因为在52个目标基因未知的广西稻种资源群体中，首先鉴别出23个功能性单倍型品种；然后鉴别了18个目标基因Pii‑M的携带者；综合一级标记及二级标记的检测结果，则进一步鉴别了5个新型等位基因Pii‑F036的携带者。

[0338] 实施例14：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的辽宁稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例(图15)

[0339] 一、实验方法

[0340] (1)本发明之Pii技术体系的检测程序及方案如上所述，恕不赘述。

[0341] (2)利用上述技术体系对58个随机选择的辽宁稻种资源群体【Q2709～41,Q2743～51,Q2753～60,Q2762,Q2764～73；林丽萍，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)】进行Pii抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

[0342] 上述3个Pii第二套参考品种作为对照也参加了试验。

[0343] 二、实验结果

[0344] (1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，58个供试品种被分类为(图15a)：

[0345] 功能性单倍型品种(红色标示)：Q2712,Q2717,Q2720,Q2727～30,Q2746～47,Q2749～51,Q2753～54,Q2757～58,Q2760,Q2762,Q2765,Q2771等20个品种；

[0346] 非功能性单倍型品种(黑色标示)：Q2709～11,Q2713～16,Q2718～19,Q2721～26,Q2731～41,Q2743～45,Q2748,Q2755～56,Q2759,Q2764,Q2766～70,Q2772～73等38个品种。

[0347] (2)在基于二级标记的抗病等位基因检测中(图15b)，58个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

[0348] 目标基因Pii‑F携带品种(蓝色标示)：Q2712,Q2717,Q2720,Q2727～30,Q2746～47,Q2749～51,Q2753～54,Q2757～58,Q2760,Q2762,Q2765,Q2771等18个品种；

[0349] 目标基因Pii‑M携带品种(绿色标示)：仅Q2757等1个品种；

[0350] 新型目标基因Pii‑BJ携带品种(紫色标示)：仅Q2751等1个品种(其基因型与Pii‑F及Pii‑M以及Pii‑F036的皆不同)。

[0351] 该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可靠性，因为在58个目标基因未知的辽宁稻种资源群体中，首先鉴别出20个功能性单倍型品种；然后鉴别了18个目标基因Pii‑F的携带者，1个目标基因Pii‑M的携带者；综合上述检测结果，则进一步鉴别了1个新型等位基因Pii‑BJ的携带者。

[0352] 实施15：本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族功能基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例(图16)

[0353] (1)虽然稻瘟病Pii抗病基因家族是在全球水稻，特别是粳稻抗病育种计划中应用最广泛的抗源之一，但是，科研工作者迄今仅仅开发了一些零散的分子标记，在此仅选择基因内部开发的功能特异性标记进行鉴别能力比较分析。亦即：Pii他方标记技术(Pii‑ID07(记为#他方i‑1),Pii‑ID21(#他方i‑2),Pii‑ID24(#他方i‑3)；Kitazawaet al.2019,Breeding Science,69:68‑83；40N23R(#他方i‑3)；Yadav et al.2019,Plos One,14:e0211061)；

[0354] 特别地，Pii他方标记Pii‑ID07,Pii‑ID21,Pii‑ID24,40N23R的引物序列分别如SEQ ID NO.51～52,53～54,55～56,57～58所示；因为不是本技术体系之必需标记而仅作参考；

[0355] (2)以上述14个Pii第一套参考品种为检测对象进行鉴定比较，结果表明，本发明之技术体系与Pii他方标记技术相比，具有如下突出而确切的创新性及有益效果：

[0356] (a)首先，利用本技术体系2个最优的一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限(图16a)。在该实例中，在供试的14个Pii第一套参考品种中，CK1～7被鉴定为功能性单倍型品种，CK8～14则为非功能性单倍型品种。这是Pii他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

[0357] (b)在此基础上，利用本技术体系2个最优的二级标记进行抗病等位基因分析，为各个抗病等位基因的鉴别划出了清晰且可比对的等位基因界限(图16b)。在该实例中，7个功能性单倍型品种被进一步清晰地鉴别为Pii‑F及Pii‑M的携带者。这也是Pii他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

[0358] (c)相反地，Pii他方标记技术对14个Pii第一套参考品种的鉴定结果表明，所有4个标记及其组合的检测结果都不具有可比性及逻辑性，既不能区分功能性/非功能性单倍型，也不能鉴别2个已知的等位基因，更不能鉴别、挖掘新型的等位基因(图16c)；

[0359] 结论：本发明之技术体系具有Pii他方标记技术所无法比拟的创新性、严谨性及优越性。

[0360] 实施16:利用基于PCR技术的同源基因克隆手段克隆并验证稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因的应用及实例(图17)

[0361] 此实施例的实验方法主要参考本领域已发表的论文(王丽2012，华南农业大学硕士学位论文；潘金媚2013，华南农业大学硕士学位论文；Lin et al.2003,PNAS,100:5962‑5967；Yuan et al.2011,Theor Appl Genet 122:1017‑1028；Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321‑334)。简述之：

[0362] (1)根据上述2个抗病基因家族序列比较的结果，分别构建其精细的等位基因二级结构图比较图，然后在保证各自基因结构完整性的前提下，分别在其上下游保守区域设计其基因克隆引物(图17a～b)；引物序列如下所示：

[0363] 对于#Pia‑1KL引物(退火温度：60℃)：

[0364] SEQ ID NO.25(Pia‑1KLF；5’‑3’)：

[0365] CCAGATAATATCGTGGGGTACATGTTG；

[0366] SEQ ID NO.26(Pia‑1KLR；5’‑3’)：

[0367] CTGTCCATCTTAAATGTGCACTTTATG。

[0368] 对于#Pia‑2KL引物(退火温度：60℃)：

[0369] SEQ ID NO.27(Pia‑2KLF；5’‑3’)：

[0370] CTTCCCCAATAGAGAGGACATCATTGC；

[0371] SEQ ID NO.28(Pia‑2KLR；5’‑3’)：

[0372] AAGGCATGCTAGTTGGCACGTTCGTTA。

[0373] 对于#Pii‑1KL引物(退火温度：58℃)：

[0374] SEQ ID NO.29(Pii‑1KLF；5’‑3’)：

[0375] CACAACTCCACTTCAGATCTAACTCCT；

[0376] SEQ ID NO.30(Pii‑1KLR；5’‑3’)：

[0377] AAGATCTCCTGGCGAGTAGGCTTCACAG。

[0378] 对于#Pi2‑2KL引物(退火温度：58℃)：

[0379] SEQ ID NO.31(Pii‑2KLF；5’‑3’)：

[0380] TGCTTATTGAGTGGGACGGAGGGAGTA；

[0381] SEQ ID NO.32(Pii‑2KLR；5’‑3’)：

[0382] ATGTCAATCAACGTGAAAGATGGCTAA。

[0383] (2)利用高保真长片段DNA聚合酶,Phata Max(Vazyme Biotech Co.,Ltd,Nanjing,China)，根据其PCR扩增程序，以各个目标基因高质量的DNA为模板，分别进行目标基因的扩增；

[0384] (3)利用实验室常用的pGEM‑T Easy Vector(Promege Corporation,WI,USA)，并按照其程序将上述PCR产物连接于pGEM‑T载体测序并保存、备用；

[0385] (4)以上述各个目标基因的pGEM‑T载体为模板，在上述基因克隆引物的基础上加入相应的酶切位点序列(Asc I)，将各个目标基因的成对基因分别连接于双元转化载体pYLTC380DTH中；

[0386] (5)将分子鉴定连接正确的载体，按照常规的遗传转化方法，分别将目标基因转化于相应的感病品种中，并进行转基因后代的鉴定、分析；

[0387] 结果表明，本发明挖掘并克隆的抗病等位基因都具有完整性及功能性(图17c仅显示Pia‑C的结果)，其中大部分转基因T1株系的表现型与基因型(基于其转化载体骨架之潮霉素选择标记,Hpt)表现较好的共分离(个别个体可能由于接种逃避或者转基因后沉默而没有共分离)；

[0388] (6)本发明挖掘并克隆的新型抗病等位基因的完整序列已登录于公共数据库：Pia‑C(GenBank OL773678,OL773679),Pii‑BJ(GenBank OL689231,OL689232),Pii‑F036(GenBank OL689233,OL689234)。

[0389] 上述16个实施例从不同角度实证了本发明之技术体系具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆Pia及Pii抗病基因家族等位基因非凡的能力及效果。

[0390] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。