抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用

摘要

本发明公开一种抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用。其中，B7H6‑CAR‑T细胞包含靶向B7H6抗原的抗体或其抗原结合片段，其含有重链可变区或轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO.:11‑13所示氨基酸序列的CDR1‑3，和/或轻链可变区包含SEQ ID NO.:14‑16所示氨基酸序列的CDR1‑3；或者重链可变区包含SEQ ID NO.:17‑19所示氨基酸序列的CDR1‑3，和/或轻链可变区包含SEQ ID NO.:20‑22所示氨基酸序列的CDR1‑3。本发明的抗体以及基于该抗体的B7H6‑CAR与B7H6抗原分子具有极强的亲和力。同时本发明的B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6阳性靶细胞具有显著且特异的杀伤作用，为细胞治疗临床应用提供了有益的CAR‑T细胞。此外，本发明在CAR‑T结构上应用自杀性基因结构，可以在不需要时消除CAR‑T细胞，以保障其应用的安全性。

权利要求

1.抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段能够靶向B7H6，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO.: 11‑13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO.: 14‑16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；或者所述重链可变区包含SEQ ID NO.: 17‑19所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO.: 20‑22所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：(I) 含有SEQ ID NO：4所示的重链可变区氨基酸序列和由SEQ ID NO：24所示的轻链可变区编码序列得到的氨基酸序列；或者含有由SEQ ID NO：25所示的重链可变区编码序列得到的氨基酸序列和由SEQ ID NO：

26所示的轻链可变区编码序列得到的氨基酸序列；

(II) 与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO.:24‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

(III) 与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO.:24‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和双特异性抗体中的至少一种；所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv‑Fc片段和单链抗体ScAb中的至少一种。

4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，其包括：

1) 识别B7H6抗原的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包括根据权利要求1‑3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

2) 跨膜结构域；和

3) 胞内信号传导结构域。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包括铰链区。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包括自杀开关分子。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包括细胞内共刺激域。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域选自：多肽CD28、NKp30、CDS、DAP10、4‑1BB、DAP12、CD3C、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA‑1、ICOS、GITR、CD40、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA‑6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、PAG/Cbp中的至少一种或其组合。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域选自：CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI‑γ、FcγRIII‑γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、B7H69a、B7H69b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(4‑1BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40中的至少一种或其组合。

10.根据权利要求4‑9任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域包含缩短的CD3ζ链，其保留选自CD3ζ链的至少一个ITAM基序。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其保留CD3ζ链的3个ITAMs中的第一个ITAM基序。

12.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包括融合片段，所述融合片段包括细胞因子和抗PD1‑scFv。

13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞因子包括IL21。

14.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码根据权利要求1‑3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求4‑13任一项所述的嵌合抗原受体。

15.一种载体，其特征在于，其包含权利要求14所述的核酸分子。

16.一种宿主细胞，其特征在于，其包含根据权利要求15所述的载体。

17.一种免疫效应细胞，其特征在于，其表达根据权利要求1‑3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求4‑13任一项所述的嵌合抗原受体。

18.根据权利要求17所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞选自：自然杀伤细胞和T淋巴细胞中的至少一种或其组合。

19.根据权利要求17所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞包括外周血单个核细胞。

20.根据权利要求18所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞包括αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞和细胞毒性T淋巴细胞。

21.试剂在用于制备预防和/或治疗B7H6表达阳性相关的癌症或肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述试剂包括：根据权利要求1‑3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求4‑13任一项所述的嵌合抗原受体，或根据权利要求14所述的核酸分子，或根据权利要求15所述的载体，或根据权利要求16所述的宿主细胞，或根据权利要求17‑20任一项所述的免疫效应细胞。

22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，进一步包括：根据权利要求1‑3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求4‑13任一项所述的嵌合抗原受体，或根据权利要求17‑20任一项所述的免疫效应细胞在与其它药物联合用药中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述其它药物包括诊断剂、预防剂和/或治疗剂。

24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述其它药物包括靶向CD20抗体药物。

说明书

抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物免疫治疗技术领域，具体地涉及抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用。

背景技术

[0002] B7家族，属于免疫球蛋白超家族，由结构类似的细胞表面糖蛋白配体组成，这些配体主要表达于多种免疫细胞和非免疫细胞上，其与T、B、NK等效应淋巴细胞上的受体结合，形成“共刺激”或者“共抑制”(co‑stimulatory/co‑inhibitory)信号，以辅助调节淋巴细胞的活化、增殖、免疫应答等最终的生物活性。目前已知该家族有11名成员被发现，如B7‑2(与CD28作用)、B7H1(即PD‑L1，与PD‑1作用)，而B7H6是B7家族中新发现的“共刺激”信号蛋白，大小为51kDa，与其作用的受体为NKp30，主要表达于NK细胞表面，二者结合可激活NK细胞的免疫效应。比较特别的是，B7H6被发现可在很多肿瘤细胞表面表达，如淋巴瘤、白血病、消化道肿瘤、小细胞肺癌等，但几乎不在正常组织细胞表达；并且它在肿瘤细胞的表达率与较差的肿瘤预后有一定的相关性。最近也发现，肿瘤细胞可以通过下调或者脱落B7H6的表达而逃避免疫细胞的监视。因此，B7H6被认为是肿瘤靶向治疗和预后诊断的一个潜在的理想靶点。

[0003] 嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已在临床试验中证明对B细胞白血病具有持久且显著的疗效。CAR策略可以针对任何肿瘤表面抗原，只要能产生抗原结合受体。针对B7H6肿瘤相关抗原制备CAR‑T、CAR‑NK的CAR‑细胞治疗，是对实体瘤和血液肿瘤治疗的一个良好的选择之一。目前仍亟需一种B7H6‑CAR‑T细胞及其制备方法，从而有效用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

[0004] 背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

[0005] 为解决现有技术中的技术问题，本发明人通过深入研究，发现了一系列不同的具有靶向B7H6抗原分子的抗体，其中以抗体Ad02和Ad05的scFv制备的CAR‑T细胞，可以高效特异地杀伤表达B7H6的肿瘤细胞和转化细胞。此外，本发明在CAR‑T结构上应用自杀性基因结构，可以在不需要时消除CAR‑T细胞，以保障其应用的安全性。具体地，本发明包括以下内容。

[0006] 本发明的第一方面，提供一种抗体或其抗原结合片段，其含有重链可变区或轻链可变区，其中，

[0007] 所述重链可变区包含SEQ ID NO.:11‑13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；和/或

[0008] 所述轻链可变区包含SEQ ID NO.:14‑16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或者

[0009] 所述重链可变区包含SEQ ID NO.:17‑19所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；和/或

[0010] 所述轻链可变区包含SEQ ID NO.:20‑22所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

[0011] 根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，优选地，其能够特异性结合抗原B7H6。

[0012] 根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，优选地，所述抗体具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：

[0013] (I)含有由SEQ ID NO：23所示的重链可变区编码序列得到的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO：24所示的轻链可变区编码序列得到的氨基酸序列；或者含有由SEQ ID NO：25所示的重链可变区编码序列得到的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO：26所示的轻链可变区编码序列得到的氨基酸序列；

[0014] (II)与SEQ ID NO.:23‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，还优选至少98％，最优选至少99％同源性的氨基酸序列；

[0015] (III)与SEQ ID NO.:23‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；

[0016] 其中，(II)或(III)中所述抗体或其抗原结合片段依然保持特异性结合B7H6抗原的能力。

[0017] 根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，优选地，其中所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体中的至少一种；所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv‑Fc片段或单链抗体ScAb中的至少一种。

[0018] 本发明的第二方面，提供一种嵌合抗原受体，其包括：

[0019] 1)识别B7H6抗原的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包括根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；

[0020] 2)跨膜结构域；和

[0021] 3)胞内信号传导结构域；

[0022] 优选地，进一步包括铰链区；

[0023] 优选地，进一步包括自杀开关分子；

[0024] 优选地，进一步包括细胞内共刺激域；

[0025] 优选地，进一步包括融合片段，所述融合片段包括细胞因子和抗PD1‑scFv或PD1抗原结合片段；

[0026] 优选地，所述细胞因子包括IL21；

[0027] 优选地，所述跨膜结构域选自：多肽CD28、NKp30、CDS、DAP10、4‑1BB、DAP12、CD3C、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA‑1、ICOS(CD278)、4‑1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA‑6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA‑1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA‑1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB‑A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO‑3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp中的至少一种或其组合；

[0028] 优选地，所述胞内信号传导结构域选自：CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI‑γ、FcγRIII‑γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、B7H69a、B7H69b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(4‑1BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40中的至少一种或其任何组合；

[0029] 优选地，所述胞内信号传导结构域包含缩短的CD3ζ链，其保留选自CD3ζ链的至少一个ITAM基序，还优选为CD3ζ链的3个ITAMs中的第一个ITAM基序。

[0030] 本发明的第三方面，提供一种分离的核酸分子，其编码根据本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或根据第二方面所述的嵌合抗原受体。

[0031] 本发明的第四方面，提供一种载体，其包含根据第三方面所述的核酸分子。

[0032] 本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，其包含根据第四方面所述的载体。

[0033] 本发明的第六方面，提供根据第二方面所述的嵌合抗原受体的制备方法，其包括培养根据第五方面所述的宿主细胞。

[0034] 本发明的第七方面，提供一种免疫效应细胞，其表达根据本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或根据第二方面所述的嵌合抗原受体；

[0035] 优选地，所述免疫效应细胞选自：白细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、天然淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、T淋巴细胞、外周血单个核细胞和造血干细胞中的至少一种。

[0036] 本发明的第八方面，提供试剂在用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的组合物、药物、制剂或试剂盒中的用途，所述试剂包括：根据本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或根据第二方面所述的嵌合抗原受体，或根据第七方面所述的免疫效应细胞；

[0037] 优选地，所述癌症或肿瘤是指B7H6表达相关的癌症或肿瘤，还优选地，所述癌症或肿瘤包括髓性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B‑细胞淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、透明细胞肾细胞癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肉瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、侵袭性导管乳腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、卵巢浆液性表面乳头状癌、胰腺癌、前列腺癌、T‑细胞急性淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌或T‑细胞淋巴瘤。

[0038] 本发明的第九方面，提供根据本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或根据第二方面所述的嵌合抗原受体，或根据第七方面所述的免疫效应细胞在与其它药物联合用药中的用途。其它药物包括但不限于：诊断剂、预防剂和/或治疗剂。

[0039] 本发明的第十方面，提供预防和/或治疗癌症或肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者给予治疗有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物所述的抗体或其抗原结合片段，或所述核酸分子。

[0040] 本发明的优异技术效果包括但不限于：

[0041] (1)本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人B7H6抗原分子(例如结合该抗原分子的胞外结构域，优选结合该抗原分子的胞外结构域氨基酸残基25‑262)，显示出对B7H6抗原分子极强的亲和力。

[0042] (2)本发明构建的CAR结构能够解除肿瘤微环境对特异性T细胞的抑制作用。

[0043] (3)本发明构建的CAR结构能够促进记忆性T细胞形成和大量增殖，提高肿瘤治疗效果。

[0044] (4)本发明的B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6阳性靶细胞具有显著且特异的杀伤作用，为细胞治疗临床应用提供了有益的CAR‑T细胞。

[0045] (5)本发明在CAR‑T结构上应用自杀性基因结构，可以在不需要时消除CAR‑T细胞，以保障其应用的安全性。

[0046] (6)本发明的抗体或其抗原结合片段可应用于如ADCC、双/多特异性抗体等治疗与诊断的应用，大大扩展了免疫治疗的应用范围。

[0047] 此外，本发明的效果还包括：有效杀死表达B7H6的细胞，或减少表达B7H6的细胞的生长，或有效诱导针对表达B7H6的细胞的免疫应答。

附图说明

[0048] 图1为第三代慢病毒载体pCDH‑EF1(X6)‑MCS‑T2A‑Puro的质粒图谱。

[0049] 图2为B7H6‑CAR(CD3ζ1)的分子结构图。

[0050] 图3为B7H6‑CAR(CD3ζ)的分子结构图。

[0051] 图4为B7H6‑CAR(CD3ζ)‑aPD1‑IL21的分子结构图。

[0052] 图5‑10为B7H6‑CAR‑T细胞与靶细胞U87‑B7H6/U87共培养杀伤曲线。图中曲线分别对应效靶比0：1(target only，靶细胞空白对照)、1：1、2：1和4：1。

[0053] 图11为B7H6‑CAR‑T对靶细胞U87‑B7H6/U87的杀伤效率。图中各柱从左至右依次对应效靶比1：1、2：1和4：1。

具体实施方式

[0054] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0055] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其它陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0056] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0057] 本发明中，B7H6、B7同源物6、B7‑H6可互换使用，是指NK细胞活化受体NKp30的配体。

[0058] 本文所用术语“针对”、“靶向”和“特异性结合”可互换地用于指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

[0059] 抗体的重链可变区和轻链可变区通常包括3个互补决定区CDR和4个骨架区FR。互补决定区之间通过骨架区连接，在识别抗体时，FR分子卷曲使CDR分子相互靠近。互补决定区为抗体或抗原结合片段与抗原的结合部位，因此，互补决定区的序列决定了抗体的特异性。如本领域所理解，抗体是包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区包含框架区(FR)和互补决定区(CDR)。四个FR是相对保守的，而CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)包含高变区。

[0060] 本文中的“抗原结合片段”是指多肽片段，其包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区，并且具有能够特异性靶向B7H6的特性。优选地，其含有抗体重链可变区和/或轻链可变区的至少一个CDR；还优选地，其可以含有重链可变区的CDR1‑3和/或轻链可变区的CDR1‑3。抗原结合片段可以通过多种技术制备，包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化，或由包含抗原结合片段的宿主细胞表达产生。

[0061] 本发明提供了上述靶向B7H6的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有良好的安全性和靶向性，能够特异性结合人B7H6的胞外域，将包含该抗体或其抗原结合片段的编码序列的载体，用于感染免疫细胞，能够获得对表达B7H6的肿瘤细胞具有显著杀伤能力的免疫效应细胞，该免疫效应细胞能够应用于治疗或改善B7H6表达相关的疾病，从而为B7H6阳性肿瘤的治疗奠定基础。

[0062] 在没有限定或理论约束的情况下，抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的序列可在下述范围内随机选择：具有SEQ ID NO.:11‑13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，和/或具有SEQ ID NO.:14‑16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或者

[0063] 具有SEQ ID NO.:17‑19所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；和/或具有SEQ ID NO.:20‑22所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。

[0064] 本发明中，抗体或其抗原结合片段具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：(I)含有由SEQ ID NO：23所示的重链可变区编码序列得到的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO：24所示的轻链可变区编码序列得到的氨基酸序列；或者含有由SEQ ID NO：25所示的重链可变区编码序列得到的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO：26所示的轻链可变区编码序列得到的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.:23‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，还优选至少98％，最优选至少99％同源性的氨基酸序列；(III)与SEQ ID NO.:23‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。需要说明的是，上述同源性(本文有时也称为“同一性”)序列不会改变抗原与抗体结合特性，即选自上述的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段依然保留针对肿瘤表面抗原B7H6的抗体的活性。优选地，上述(II)、(III)中氨基酸变化均发生在框架区(FR区)，即，包含各自重链和轻链CDR1‑3的氨基酸序列且在SEQ ID NO.:23‑26任一所示的编码序列得到的氨基酸序列中至少一个框架区中存在至少一个突变。

[0065] 优选地，本发明中的上述氨基酸序列是根据鼠源抗体的编码序列经宿主密码子偏好性改造序列后通过表达得到的序列。本发明中，经宿主密码子偏好性改造是指为了适应于不同宿主表达的需要，根据简并密码子来对碱基序列进行碱基替换，密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。所述鼠源抗体(Ad02)的编码序列中，其重链可变区的编码序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO：5所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明还提供抗B7H6单抗Ad05，其重链可变区VH的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，轻链可变区VL的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区VL的氨基酸序列SEQ ID NO：10所示。

[0066] 优选地，所述抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体中的至少一种；所述抗原结合片段为Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、单链抗体scFv、二硫键连接的Fv(sdFv)、或单域抗体中的至少一种。还优选地，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。

[0067] 优选地，所述抗体还包括抗体恒定区；还优选地，所述抗体恒定区选自：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

[0068] 优选地，所述抗体恒定区的重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任意一者的重链恒定区，优选为IgG4的重链恒定区；所述抗体恒定区的轻链恒定区为κ或λ。

[0069] 本发明的抗体可包含Fc区，所述Fc区来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

[0070] 本文所用术语“单克隆抗体”，有时也称为“单抗”或mAb，其是指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，但这不应被解释成需要用任何特殊或特定的方法来生产所述抗体。

[0071] 变体抗体也都被包括在本发明的范围内。在本发明对变体的序列不特别限定，只要其具有靶向B7H6抗原的结合特性，或具有提高的亲和力的抗体即可，具有这样序列的其它变体可以使用本领域已知的方法得到，并都包括在本发明的范围内。本领域技术人员利用用于生产变体多肽的重组方法和/或合成化学技术可以修改多肽的氨基酸序列。例如，可以使用氨基酸置换得到具有进一步提高的亲和力的抗体。可选地，可以使用核苷酸序列的密码子优化来提高在用于生产抗体的表达系统中的翻译效率。这样的变体抗体序列与在本发明中列举的序列具有80％或更高的(即，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。相对于在本发明中列举的序列，计算所述序列同一性。或进行最佳比对时，如通过程序GAP或使用默认值间隙权重的BESTFIT。

[0072] 本文所用术语“修饰”意指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。本发明的抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰等。

[0073] 保守氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族‑羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸及苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸‑亮氨酸‑异亮氨酸、苯丙氨酸‑酪氨酸、赖氨酸‑精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸‑天门冬酸和天冬酰胺‑谷氨酰胺。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基或CDR区外的框架区中的一个或多个氨基酸残基。

[0074] 另一类可能存在的可变区修饰是突变VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基以改进目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以通过定点诱变或PCR介导的诱变来导入突变。优选导入(如上所述的)保守修饰。突变可以是氨基酸的取代、添加或缺失，但优选为取代。此外，CDR区或CDR区外的框架区中残基变化通常不超过一个、两个、三个、四个或五个。

[0075] 本发明还提供了一种抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR，所述CAR包含可识别B7H6抗原的抗原结合结构域(本文有时也称为“抗原识别区”)、铰链区、跨膜结构域(本文有时也称为“跨膜区”)和胞内信号传导结构域(本文有时也称为“胞内区”)，其中所述抗原识别区包括本发明所述的特异性结合B7H6的抗体或其抗原结合片段。

[0076] 在没有限定的情况下，“抗原识别区”可以为单价的或多价的(如二价的或三价的)。抗原结合区可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。双特异性可以是针对B7H6和另一种抗原，也可以是针对B7H6的两种不同表位。优选地，所述抗原识别区为单链抗体(一价或多价)。单链抗体scFv包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区通过Linker(接头)连接而成的抗体。优选地，scFv重链和轻链的连接方式为VH‑Linker‑VL或VL‑Linker‑VH。在一些实施方案中，Linker的序列可选用现有的接头序列。还优选地，Linker的序列是SEQ ID NO.:27所示的核苷酸序列。

[0077] 优选地，所述CAR还包括信号肽序列。一般而言，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需部位的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使多肽靶向细胞的分泌通路，并且将允许多肽整合和锚定至脂双层。在一些实施方案中，信号肽为膜定位信号肽。优选地，所述信号肽序列来源于CD8a的信号肽序列；更优选地，所述CD8a信号肽序列具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。

[0078] 本文中的“铰链区”、“跨膜区”和“胞内区”均可选自现有已知的CAR‑T技术中的铰链区、跨膜区和胞内区的序列。

[0079] 嵌合抗原受体的铰链区位于胞外抗原结合区和跨膜区之间，铰链区是通常在蛋白质的两个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和两个域的彼此相对运动。铰链区可以是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链区也可用于本文所述的嵌合抗原受体。非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合抗原受体的铰链区。在一些实施方案中，铰链区是肽接头。优选地，所述铰链区来源于CD8α。还优选地，所述CD8α铰链区具有SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。

[0080] 嵌合抗体受体的跨膜区可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨域细胞磷脂双层的任何其它稳定结构。跨膜区可以是天然或合成来源的。跨膜区可源自CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、T细胞受体的α、β或ζ链。优选地，所述跨膜区来源于CD8α。优选地，所述CD8α跨膜区具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。

[0081] 优选地，嵌合抗原受体的胞内区包含信号传导区和/或共刺激信号传导区。信号传导区和/或共刺激信号传导区的个数均可以为一个或多个。

[0082] 胞内信号传导区负责表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。虽然通常可以利用整个胞内信号传导区，但是在很多情况下，使用整个链是不必要的。就使用胞内信号传导区的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。因此，胞内信号传导区包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导区的任何截短形式。在一些实施方案中，信号传导区来源于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD137、B7H69a、B7H69b和CD66d中的至少一种。优选地，所述胞内区来源于人CD3ζ胞内区。在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含缩短的CD3ζ链，简称为CD3ζ1，所述CD3ζ1只保留了CD3ζ链的3个ITAMs(Immunoreceptor Tyrosine‑based Activation Motifs)中的第一个ITAM基序，且所述CD3ζ1具有SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述人CD3ζ胞内区具有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。与现有技术不同的是，本文中的CD3ζ并不对其链的三个ITAMs的第二个和第三个基序进行碱基突变，而是直接删除第二个和第三个基序，仅保留CD3ζ链中的第一个ITAM基序，从而获得更强和更持久的肿瘤抑制活性。

[0083] 在抗原特异性信号的刺激以外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。“共刺激信号传导区”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上的关联结合伴侣，该关联结合伴侣与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激响应，诸如但不限于增殖和存活。共刺激信号传导区可源自CARD11，CD2，B7H6，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD‑L2，PD‑L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C，SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88和4‑1BB中至少一种的胞内信号区。在一些实施方案中，共刺激信号传导区来源于4‑1BB。在一些实施方案中，4‑1BB共刺激信号传导区包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。

[0084] 优选地，所述CAR的核苷酸序列和氨基酸序列选自下述序列中的至少一种或其组合：

[0085] (1)氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，其编码序列如SEQ ID NO:29所示；

[0086] (2)氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，其编码序列如SEQ ID NO:31所示；

[0087] (3)氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其编码序列如SEQ ID NO:33所示；

[0088] (4)氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，其编码序列如SEQ ID NO:35所示。

[0089] 为了解决CAR‑T细胞治疗伴随的多种毒副作用，增加CAR‑T细胞治疗的安全性，本发明人设计的嵌合抗原受体CAR进一步包括“自杀开关”RQR8分子，其具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，其编码序列如SEQ ID NO:51所示。所述RQR8分子以具自剪切功能的T2A连接肽与B7H6‑CAR结构中的胞内信号传导结构域CD3ζ相融合。T2A连接肽序列不特别限定，在具体实施方案中，其具有SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，其编码序列如SEQ ID NO:49所示。

[0090] 优选地，所述RQR8分子带有两个CD20抗原表位，使用抗CD20的利妥昔单抗(Rituximab)靶向CD20，激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用(CDC)，可诱导T细胞凋亡。在必要的时候利用例如利妥昔单抗，可实现对CAR‑T细胞的消除，从而增加CAR‑T细胞治疗的安全性。

[0091] 需要说明的是，本发明CAR结构中引入了融合片段，该融合片段包括细胞因子和抗PD1抗体或其抗原结合片段。优选地，抗PD1抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，其编码序列如SEQ ID NO:55所示。还优选地，所述细胞因子为调控CD8+T细胞反应的白细胞介素，进一步优选为IL‑21，其具有SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，其编码序列如SEQ ID NO:58所示。本发明人通过研究发现，上述CAR结构能够解除肿瘤微环境对特异性T细胞的抑制作用，在发挥PD1抗体功能的同时，促使IL‑21靶向肿瘤特异性T细胞，促进记忆性T细胞形成和大量增殖，从而提高肿瘤治疗效果。

[0092] 本发明提供了一种分离的核酸，其编码如前所述的抗体或其抗原结合片段，或嵌合抗原受体。

[0093] 本发明提供了一种载体，其包括本发明所述的分离的核酸。载体可以为表达载体或克隆载体。在一些实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。

[0094] 本发明提供了一种宿主细胞，其包括上述的载体。用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。

[0095] 本发明提供了一种抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR的制备方法，其包括培养上述的宿主细胞。优选地，所述制备方法的培养条件足以使宿主细胞能够表达抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR。

[0096] 本发明提供了一种免疫效应细胞，其表达上述的特异性结合B7H6的抗体或其抗原结合片段，或抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR。

[0097] 本发明中，“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。优选地，所述免疫效应细胞选自：由多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞、T淋巴细胞、NK细胞、外周血单个核细胞(PBMC)和造血干细胞中的至少一种。更优选地，所述免疫效应细胞为T淋巴细胞(同T细胞)。在一些实施方案中，T细胞可以为CD4+/CD8‑、CD4‑/CD8+、CD4+/CD8+、CD4‑/CD8‑或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时产生IL‑2、IFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时裂解抗原特异性靶细胞。

[0098] 本发明提供了所述的免疫效应细胞的制备方法，其包括采用本发明所述的分离的核酸或所述的载体感染免疫效应细胞。优选地，本发明通过将嵌合抗原受体引入免疫效应细胞(诸如T细胞)来制备经基因改造的免疫效应细胞。

[0099] 需要说明的是，将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入免疫效应细胞。用于将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于将核酸或载体引入免疫效应细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的体系(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外递送媒介物的示例性胶体体系是脂质体(例如人工膜囊泡)。用于将核酸或载体引入免疫效应细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞的最广泛使用的方法。在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。

[0100] 在一些实施方案中，所述制备还包括进一步评估或筛选转导的或转染的免疫效应细胞以选择经改造的免疫效应细胞。

[0101] 本发明进一步提供了一种药物或药物组合物，其包括：所述的特异性结合B7H6的抗体或其抗原结合片段、所述的核酸、所述的载体、所述的嵌合抗原受体CAR、所述嵌合抗原受体CAR的制备方法制备获得的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR、所述的免疫效应细胞以及所述的免疫效应细胞的制备方法制备获得的免疫效应细胞中的至少一种。

[0102] 在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

[0103] 药物组合物可以通过使具有所需纯度的活性药剂与任选的药学上可接受的载剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，可包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂和表面活性剂中的至少一种。此外，为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。

[0104] 在一些实施方案中，药物组合物可以含有：细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。添加剂的具体添加量可根据实际需要进行调整。

[0105] 本发明还提供了试剂在制备用于治疗或改善癌症的药物或药物组合物中的应用，所述试剂选自：所述的特异性结合B7H6的抗体或其抗原结合片段、所述的核酸、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR、所述的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR的制备方法制备获得的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR、所述的免疫效应细胞以及所述的免疫效应细胞的制备方法制备获得的免疫效应细胞中的至少一种。

[0106] 优选地，所述治疗或改善癌症是指能够激发或提高癌症患者的免疫功能。

[0107] 优选地，所述癌症是指与B7H6表达相关的癌症。

[0108] 本文中“与B7H6表达相关的癌症”是指由B7H6表达异常所直接或间接导致的疾病，通常是指由B7H6过表达所导致的疾病。优选地，所述癌症或肿瘤包括但不限于：髓性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B‑细胞淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、透明细胞肾细胞癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肉瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、侵袭性导管乳腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、卵巢浆液性表面乳头状癌、胰腺癌、前列腺癌、T‑细胞急性淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌或T‑细胞淋巴瘤。

[0109] 本发明还提供一种治疗/与预防癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物的步骤，其中所述药物包括：所述的特异性结合B7H6的抗体或其抗原结合片段、所述的分离的核酸、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR、所述的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR的制备方法制备获得的抗人B7H6的嵌合抗原受体CAR、所述的免疫效应细胞以及所述的免疫效应细胞的制备方法制备获得的免疫效应细胞中的至少一种。

[0110] 本文所用术语“受试者”和“患者”在本文中互换地用于指可能需要本文描述的抗体相关制剂或药物、治疗的任何动物。受试者和患者因此包括但不限于：灵长类动物(包括人类)、犬科动物、猫科动物、鼠和其它哺乳动物受试者。优选地，所述受试者是人类。

[0111] 在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如自身免疫性疾病的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。

[0112] 本文所用术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。通常，本文中的有效量根据各种因素而变化，所述因素例如给定的药物或化合物、药学制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。本发明的化合物的有效量可以由本领域技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。

[0113] 本发明还提供根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的嵌合抗原受体，或所述的免疫效应细胞在与其它药物联合用药中的用途。优选地，所述其它药物包括诊断剂、预防剂和/或治疗剂。进一步优选地，所述其它药物为靶向CD20抗体药物，所述靶向CD20抗体药物包括但不限于：利妥昔单抗、阿托珠单抗、奥法木单抗、替伊莫单抗等。

[0114] 实施例1

[0115] 本实施例为抗B7H6抗原蛋白的小鼠单克隆抗体的制备及序列分析。

[0116] 本发明采用B7H6抗原蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，经过细胞融合和初筛、复筛，获得系列能产生抗B7H6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述B7H6抗原的前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示，其中氨基酸残基25‑262为B7H6抗原胞外结构域，如SEQ ID NO.：2所示。所述用于免疫小鼠的B7H6抗原蛋白为重组人B7H6蛋白(带His标签)，其氨基酸序列为B7H6抗原胞外结构域序列(SEQ ID NO.：2)。

[0117] 对产生抗B7H6单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行培养，收集细胞，提取RNA，采用RT‑PCR法获得编码抗B7H6的单克隆抗体的cDNA序列，再通过PCR方法克隆重链和轻链的可变区并将PCR产物连接到T‑载体上，测序获得抗B7H6单抗的重链可变区VH和轻链可变区VL的序列，并进一步通过Uniprot数据库进行序列比对和确认，从中选出两株单抗克隆Ad02和Ad05进行后续实验。

[0118] 抗B7H6单抗Ad02的VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.：3序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：4所示；Ad02单抗的VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示；

[0119] 抗B7H6单抗Ad05的VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.：7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：8所示；Ad05单抗的VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.：9所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：10所示。

[0120] 进一步对两单抗的VH和VL的氨基酸序列进行分析，确定其中的互补决定区(CDR)，结果如表1所示。

[0121] 表1.抗B7H6的单克隆抗体的VH和VL结构域的CDR分析

[0122]

[0123] 实施例2

[0124] 1、Anti‑B7H6 scFv的编码核苷酸的合成，具体如下：

[0125] 首先，分别采用单抗Ad02和Ad05的VH和VL的编码核苷酸序列，对其进行人源化密码子优化后合成相应的Anti‑B7H6 scFv的编码核苷酸序列。单抗Ad02的VH和VL经人源密码子优化后的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.：23和SEQ ID NO.：24所示。单抗Ad05的VH和VL经人源密码子优化后的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.：25和SEQ ID NO.：26所示。所合成的两单抗的Anti‑B7H6 scFv的结构为VL‑(G4S)4接头‑和VH，该(G4S)4接头的编码核苷酸序列见SEQ ID NO.：27。

[0126] 2、B7H6‑CAR的慢病毒表达质粒的构建

[0127] 采用常规技术手段构建B7H6‑CAR的慢病毒表达质粒，所采用的载体骨架为本公司所有的第三代慢病毒表达载体pCDH‑EF1(X6)‑MCS‑T2A‑Puro，其图谱如图1所示，载体线性化酶切位点为XbaI和SalI，B7H6‑CAR的全长DNA序列(含N端KOZAC序列)被插入该两酶切位点之间。

[0128] 共构建三种结构的四种B7H6‑CAR的慢病毒表达质粒：

[0129] 其中，采用单抗Ad02的scFv构建了三种结构的B7H6‑CAR的慢病毒表达质粒，分别为：(1)B7H6‑CAR(CD3ζ1)，其分子结构如图2所示，其全长氨基酸序列和全长DNA序列(含N端KOZAC序列)分别如SEQ ID NO.：28和SEQ ID NO.：29所示；(2)B7H6‑CAR(CD3ζ)，其分子结构如图3所示，其全长氨基酸序列和全长DNA序列(含N端KOZAC序列)分别如SEQ ID NO.：30和SEQ ID NO.：31所示；(3)B7H6‑CAR(CD3ζ)‑aPD1‑IL21，其分子结构如图4所示，其全长氨基酸序列和全长DNA序列(含N端KOZAC序列)分别如SEQ ID NO.：32和SEQ ID NO.：33所示。该结构中，anti‑PD1 scFv与IL21以(G4S)3接头相融合，并以自剪切连接肽T2A与前面的CAR结构中的CD3ζ结构域相连。

[0130] 对于单抗Ad05，采用其scFv构建了一种慢病毒表达质粒，其分子结构如图2所示的B7H6‑CAR(CD3ζ1)，其全长氨基酸序列和全长DNA序列(含N端KOZAC序列)分别如SEQ ID NO.：34和SEQ ID NO.：35所示。

[0131] 至今，第一代CAR‑T只有一个胞内信号组分(CD3ζ或FcRγ)；第二代CAR‑T添加了CD28或4‑1BB等共刺激结构域；第三代CAR‑T同时添加了CD28和4‑1BB等两个共刺激结构域；第四代CAR‑T在第二代的基础上添加了共表达的细胞因子，比如IL‑2等；第五代CAR‑T同样基于第二代，添加了激活其它信号通路的共刺激结构域，比如IL2‑2Rβ胞内结合SAAT3/5的结构域。一代又一代多种不同的结构设计，赋予了CAR‑T细胞疗法无限的生机和未来。

[0132] 本发明中，所构建的三种结构的四种B7H6‑CAR采用了二代CAR主体结构‑含4‑1BB和CD3ζ(CD3ζ1)两个胞内信号结构域，其中B7H6‑CAR(CD3ζ)结构中采用的胞内信号组分CD3ζ是全长的CD3ζ链，含3个天然的ITAM激活基序(Immunoreceptor Tyrosine‑based Activation Motifs)，可能较易出现CAR‑T细胞耗竭的现象；B7H6‑CAR(CD3ζ1)结构中只保留了CD3ζ链中的第一个ITAM基序(简称CD3ζ1)，以获得更强和更持久的肿瘤抑制活性。

[0133] 程序性死亡蛋白(PD1)是T细胞表面表达的一种免疫检查点受体，肿瘤细胞通过表达其配体PD‑L1(PD‑L2)与其结合，进而抑制肿瘤浸润性T细胞对肿瘤的杀伤作用。本发明的第三个CAR结构(B7H6‑CAR(CD3ζ)‑aPD1‑IL21)中首先引入了抗PD1 scFv(anti‑PD1scFv)，以解除肿瘤微环境对特异性T细胞的抑制作用。IL‑21是调控CD8+T细胞反应的重要细胞因子之一，可诱导干性记忆CD8+T细胞的扩增和分化。该结构中进一步将IL‑21与anti‑PD1 scFv融合，在发挥PD1抗体功能的同时，促使IL‑21靶向肿瘤特异性T细胞，促进记忆性T细胞形成和大量增殖，以提高肿瘤治疗效果。

[0134] CAR‑T细胞治疗通常会伴随多种毒副作用，为了增加CAR‑T细胞治疗的安全性，本发明在B7H6‑CAR(CD3ζ1)和B7H6‑CAR(CD3ζ)两种CAR分子结构里均融入了“自杀开关”RQR8分子，该RQR8分子以具自剪切功能的T2A连接肽与B7H6‑CAR结构中的胞内信号传导结构域CD3ζ相连。该RQR8分子带有两个CD20抗原表位肽，使用抗CD20的利妥昔单抗(Rituximab)靶向CD20，激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用(CDC)，可诱导T细胞凋亡。在必要的时候利用利妥昔单抗，可实现对CAR‑T细胞的消除，从而增加CAR‑T细胞治疗的安全性。

[0135] 四种B7H6‑CAR分子中各片段的氨基酸和核苷酸序列所对应的序列编号如表2所示，其中SP为CD8a信号肽，CD8H为CD8a铰链区，CD8TM为CD8a跨膜区，4‑1BB和CD3ζ均为胞内信号传导结构域。

[0136] 表2.B7H6‑CAR分子结构中各组分序列对应表

[0137]

[0138]

[0139] 实施例3

[0140] 慢病毒包装采用本领域的常规四质粒体系，其中三种辅助质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev和pMD2.G。采用293T细胞作为慢病毒包装细胞。携带B7H6‑CAR的慢病毒表达质粒与pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev和pMD2.G的共转染293T细胞的质粒用量比例为7.5:9:9:3.5；对于T75细胞培养瓶，则四种质粒用量分别为7.5ug、9ug、9ug、3.5ug。转染试剂PEI的用量(ug)为四种质粒总量的3倍，对于T75培养瓶，PEI用量为87ug(1ug/ul，87ul)。

[0141] 四种质粒共转染293T后48小时收取细胞培养液，离心(2000rpm，15min)后取上清，经0.45um滤器过滤后，采用超速离心(20000rpm，2h)浓缩上清，然后根据稀释倍数用相应体积的培养基重悬病毒沉淀，分装，置于‑80℃冻存。

[0142] 对于B7H6‑CAR慢病毒的滴度测定，将慢病毒原液或浓缩液进行系列梯度稀释后转染293T细胞，48h后流式检测转染效率，计算得出慢病毒的活性滴度。

[0143] 实施例4

[0144] 本实施例为Anti‑B7H6 scFv与B7H6抗原分子的亲和力鉴定，具体如下：

[0145] 采用两种单抗Ad02和Ad05的B7H6‑CAR(CD3ζ1)的慢病毒，以系列不同MOI值分别转导293T细胞，4天后流式检测293T细胞中的B7H6‑CAR阳性率以及与B7H6抗原蛋白结合的293T细胞比率，计算出B7H6‑CAR‑293T细胞中Anti‑B7H6 scFv与B7H6抗原蛋白的亲合率，用以表示Anti‑B7H6 scFv与B7H6抗原的亲和力。

[0146] 所述B7H6抗原蛋白为实施例1中的带His标签的重组人B7H6蛋白，流式检测时首先用该B7H6抗原蛋白与B7H6‑CAR‑293T细胞孵育，再用荧光标记的抗His小鼠单抗检测与293T细胞结合的B7H6抗原蛋白。

[0147] 结果如表3所示。

[0148] 表3.Anti‑B7H6 scFv与B7H6抗原分子的亲和力检测

[0149]

[0150]

[0151] 结果显示，Ad02和Ad05两种单抗的anti‑B7H6 scFv对B7H6抗原的亲和率分别为84.89％、76.27％，后续杀伤试验中只采用了与B7H6抗原蛋白亲和力更强的Ad02的scFv构建的CAR‑T。

[0152] 实施例5

[0153] 本实施例为B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6阳性靶细胞的体外杀伤试验，具体如下：

[0154] 为了进一步验证B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6阳性靶细胞杀伤的特异性，首先利用B7H6抗原阴性的U87细胞构建了B7H6抗原过表达的U87‑B7H6‑eGFP细胞株，利用RTCA仪器分析了B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6阳性靶细胞U87‑B7H6‑eGFP(简称U87‑B7H6)的杀伤作用。

[0155] 构建U87‑B7H6‑eGFP细胞株所采用的B7H6抗原分子编码序列为B7H6抗原前体蛋白的DNA编码序列(SEQ ID NO.：60)，所采用的eGFP分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.:61所示，其DNA编码序列如SEQ ID NO.:62所示，B7H6分子与eGFP分子之间由自剪切连接肽T2A(SEQ ID NO.:49，SEQ ID NO.:49，SEQ ID NO.：50)连接。B7H6‑T2A‑eGFP结构N端添加KOZAK序列(36)后插入到慢病毒载体pCDH‑EF1(X6)‑MCS‑T2A‑Puro的XbaI和SalI两酶切位点之间，构建成B7H6过表达慢病毒载体。按照常规手段将B7H6‑T2A‑eGFP转导入U87细胞，eGFP用作转导后细胞的筛选和检测标记。

[0156] 杀伤试验采用RTCA法(Real Time Cellular Analysis)，实时检测B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6靶细胞的杀伤作用。

[0157] 用于杀伤试验的三种B7H6‑CAR‑T细胞的CAR结构分别为B7H6‑CAR(CD3ζ1)、B7H6‑CAR(CD3ζ)和B7H6‑CAR(CD3ζ)‑aPD1‑IL21(其scFv序列均来自单抗Ad02)，所对应的CAR‑T细胞分别简称为CAR(CD3ζ1)‑T、CAR(CD3ζ)‑T和CAR(aPD1)‑T，其CAR阳性率经流式检测分别为51.28％、45.26％和68.98％。

[0158] 杀伤试验中效靶共培养实验组设置及杀伤曲线图如表4和图5‑10所示：

[0159] 表4.杀伤试验中效靶共培养实验组设置

[0160]

[0161] 各效靶共培养实验组均设置4个效靶比，包括0：1(即靶细胞空白对照)、1：1、2：1和4：1；各效靶比设置2个平行实验孔，但靶细胞空白对照即效靶比为0：1的除外：U87‑B7H6细胞为8个平行孔，U87细胞为4个平行孔，分析结果时取平均值。

[0162] 各效靶共培养实验组杀伤曲线如图5‑10所示。时间点0.0为铺种靶细胞时间点，在靶细胞培养约26h时加入效应细胞共培养，整个实验持续96h。效应T细胞加入时为CD3/CD28磁珠激活后8天，CAR病毒转导T细胞后7天。

[0163] 从杀伤曲线可以看出，对于阳性靶细胞U87‑B7H6，三种B7H6‑CAR‑T细胞均表现出显著的杀伤作用，而对照T(Control T)细胞则没有明显的杀伤作用；而对于阴性对照靶细胞U87，接受检测的三种CAR‑T细胞之一B7H6‑CAR(CD3ζ1)‑T以及Control T均未显示杀伤作用。

[0164] 从杀伤曲线上还可以看出，三种CAR‑T细胞对阳性靶细胞U87‑B7H6‑eGFP的杀伤作用，在杀伤早期(在共培养开始后的大约12小时内)，随着效靶比的提高而增强(曲线斜率增大)，但随着共培养时间的延长，杀伤效应趋于缓和。

[0165] 为了进一步分析B7H6‑CAR‑T对靶细胞的总体杀伤效率，截取了共培养的早期时间段两端的细胞指数值(即26:36:27和70:23:33的Cell Index)，计算杀伤效率，结果如表5和图11所示。

[0166] 表5.B7H6‑CAR‑T对靶细胞U87‑B7H6/U87的杀伤效率

[0167]

[0168] 从表5及图11的结果可以看出：

[0169] (1)在现有CAR阳性率情况下，三种结构的CAR‑T对靶点阳性靶细胞均有极强的杀伤作用，但在所考察的共培养终点，三种效靶比之间区别不大，其中效靶比为2:1时杀伤作用相对最强，而对照T细胞的杀伤作用相比极弱。

[0170] (2)三种CAR‑T细胞中，仅以CAR(3ζ)‑T为代表检测了对阴性对照靶细胞U87的杀伤作用，结果显示其杀伤作用随着效靶比提高而增强，在效靶比为4：1时杀伤效率达到最高，为28.76％的，但跟阳性靶细胞组相比，仅为其对应杀伤效率的31.56％。

[0171] (3)Control T细胞对阴性对照靶细胞具有一定的非靶点特异性杀伤作用，在效靶比为2：1时杀伤效率最高，为32.82％，但也仅为杀伤作用最强的实验组(CAR(3ζ1)‑T:U87‑B7H6，E:T＝2:1)的杀伤效率的35.45％。

[0172] 综合杀伤试验曲线和杀伤效率图表分析结果，可以得出结论：三种B7H6‑CAR‑T细胞对B7H6阳性靶细胞具极强且特异的杀伤作用。

[0173] 尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。