荔枝酵素、其制备方法和用途

摘要

提供了荔枝酵素、其制备方法和用途。提供了荔枝酵素在制备组合物中的用途，所述组合物用于提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态、或改善肠道健康。荔枝酵素的制备方法包括：(1)一级发酵；(2)对一级发酵后的产物进行挤压和过滤，获得一级发酵滤液；和(3)二级发酵；（4）对二级发酵液进行过滤、灭菌以得到荔枝酵素。本发明的荔枝酵素可用于提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态，进而改善肠道健康。

权利要求

1.荔枝酵素在制备组合物中的用途，所述组合物用于双向调节肠道免疫；

其中荔枝酵素通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

(1) 一级发酵，其包括在荔枝果清洗和压榨后得到的荔枝果液和荔枝果渣中添加第一碳源，接种第一菌剂，于20‑45℃密封静置发酵24‑96小时，其中第一菌剂是酵母菌与乳酸菌的混合菌剂；

(2)对一级发酵后的产物进行挤压和过滤，获得一级发酵滤液；

(3)二级发酵，其包括在一级发酵滤液中添加第二碳源，接种第二菌剂，通气培养3‑15天以得到二级发酵液，其中第二菌剂是醋酸菌；和(4) 对二级发酵液进行过滤、灭菌以得到荔枝酵素；

其中第一碳源为果糖:蔗糖:红糖为1:1:1的果糖、蔗糖和红糖；第一碳源的添加量为

3wt%；第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为500:1的酵母菌和乳酸菌；酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1的面包酵母和清酒酵母；乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1的植物乳杆菌、格氏乳杆菌和清酒乳杆菌；第一菌剂的添加量为荔枝总质量的8wt‰；

第二碳源为蜂蜜；第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的20wt%；第二菌剂为恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1的恶臭醋酸菌、醋酸醋杆菌和巴氏醋杆菌；第二菌剂的添加量为一级发酵滤液总质量的0.9wt‰；培养方式为通气量为5mL/min/mL发酵液的通气培养。

说明书

荔枝酵素、其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于微生物发酵领域，特别涉及荔枝酵素提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态、或改善肠道健康的应用。

背景技术

[0002] 荔枝是我国南方常见的水果，味甘、性温，有补脾益肝、理气补血、温中止痛、补心安神等功效。酵素是以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品，其生物活性成分包括多糖、寡糖、多酚、蛋白质以及多肽、氨基酸、维生素等。酵素具有促进新陈代谢、解酒护肝、美白等功效。

[0003] 现有的荔枝深加工工艺，要么工艺复杂、生产周期长，要么需要引入特定设备，不利于大规模产业化生产。现有的酵素产品中，很少有产品能够对肠道屏障、肠道免疫功能进行改善，另外也存在着不能明确阐述改善机制的现象。本发明通过独特的发酵工艺和益生菌组合，获得荔枝酵素，并针对性地提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫。同时，本发明也对改善的机制加以明确阐述。本发明的意义在于既扩展了酵素产品的功能，又为产品的适用性提供了机理说明。

发明内容

[0004] 现有的酵素产品中，很少有产品能够对肠道屏障、肠道免疫功能进行改善。鉴于此，本发明人开发一种荔枝酵素，其能提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态，进而改善肠道健康。

[0005] 在一方面，本发明提供了荔枝酵素在制备组合物中的用途，所述组合物用于提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态、或改善肠道健康。

[0006] 在一方面，本发明提供了用于提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态、或改善肠道健康的荔枝酵素。

[0007] 在一个实施方案中，荔枝酵素是本发明的荔枝酵素。

[0008] 在一方面，本发明提供了一种制备荔枝酵素的方法，其包括以下步骤：

[0009] (1) 一级发酵，其包括在荔枝果液和荔枝果渣中添加第一碳源，接种第一菌剂，于20‑45℃密封静置发酵24‑96小时，其中第一菌剂是酵母菌与乳酸菌的混合菌剂；

[0010] (2) 对一级发酵后的产物进行挤压和过滤，获得一级发酵滤液；和

[0011] (3) 二级发酵，其包括在一级发酵滤液中添加第二碳源，接种第二菌剂，15‑40℃静置或通气培养3‑15天以得到二级发酵液，其中第二菌剂是醋酸菌；

[0012] （4）对二级发酵液进行过滤、灭菌以得到荔枝酵素。

[0013] 在一个实施方案中，方法包括对荔枝果进行清洗和压榨的前处理步骤。

[0014] 在一个实施方案中，第一碳源为果糖、蔗糖、红糖、麦芽糖、阿拉伯糖中的一种或多种。

[0015] 在一个实施方案中，第一碳源的添加量为0‑5wt%。

[0016] 在一个实施方案中，酵母菌为异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母中的一种或多种。优选地，酵母菌为异常汉逊酵母、清酒酵母、面包酵母中的一种或多种。

[0017] 在一个实施方案中，乳酸菌为植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌中的一种或多种。

[0018] 在一个实施方案中，酵母菌:乳酸菌的重量比为50:1‑500:1。优选地，酵母菌：乳酸菌的重量比为300:1‑500:1。

[0019] 在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.1‰‑10‰。

[0020] 在一个实施方案中，第二碳源为乳糖、赤砂糖、葡萄糖、糖蜜或蜂蜜中的一种或多种。

[0021] 在一个实施方案中，第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的1%‑20%。

[0022] 在一个实施方案中，第二菌剂为巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。

[0023] 在一个实施方案中，第二菌剂的添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰‑10‰。

[0024] 在一个实施方案中，静置培养为8层纱布封口静置培养。

[0025] 在一个实施方案中，通气培养的通气量为0.1‑20mL/min/mL发酵液。

[0026] 在另一个方面，提供了包含本发明的荔枝酵素的组合物。组合物可以是药品。或者，组合物可以是食品或功能性食品，为饮品、饮料、果冻或凝胶糖果形式。在一个实施方案中，荔枝酵素为液体。

[0027] 本发明的优点包括：

[0028] 1. 提供具有提高肠道屏障功能、双向调节肠道免疫、改善肠道炎症、维持肠道稳态、进而改善肠道健康的荔枝酵素；和

[0029] 2. 提供了一种新的荔枝酵素制备工艺，其中采用不同的菌剂配比，分步进行二级发酵。

附图说明

[0030] 图1显示不同浓度荔枝酵素对脂多糖（LPS）处理人结肠癌细胞Caco‑2的跨上皮细胞电阻值（Trans epithelial electric resistance，TEER）的影响。荔枝酵素在浓度大于0.1μg/mL时，能够显著提高肠道细胞跨上皮细胞电阻值（p<0.05），表明荔枝酵素能够修复肠道屏障，具有提高肠道屏障功能的作用。注意：###表示与空白对照组相比有极显著差异（p<0.0001）；ns表示与模型组（LPS组）相比无显著性差异；*表示与模型组（LPS组）相比有显著差异（p <0.05）。

[0031] 图2显示了不同浓度的荔枝酵素对巨噬细胞RAW264.7 NO释放量的影响。不同浓度的荔枝酵素能够促进巨噬细胞RAW264.7分泌NO，表明酵素样品能够激活巨噬细胞，参与免疫调节。注意：图中不同字母表示具有显著性差异（p＜0.05），含有相同字母表示没有显著性差异。用单因素方差分析( ONE‑WAY ANOVA)中的Duncan多范围检验进行显著性分析，p<0.05定义为显著性差异阈值。

[0032] 图3显示不同浓度的荔枝酵素对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞RAW264.7 NO释放量的影响。荔枝酵素在一定浓度范围内能够抑制炎症细胞释放NO,具有抗炎活性，其具有抗炎活性浓度范围为：0.1‑8 μg/mL。巨噬细胞的实验结果表明荔枝酵素对免疫的调节具有双向性，有助于维持肠道稳态。注意：####表示与空白对照组相比有极显著差异（p<0.0001）；ns表示与模型组（LPS组）相比无显著性差异， *表示与模型组（LPS组）相比有显著差异（p <0.05），**表示与模型组（LPS组）相比有极显著差异（p <0.01），***表示与模型组（LPS组）相比有极显著差异（p <0.001）, ****表示与模型组（LPS组）相比有极显著差异（p <0.0001）。

具体实施方式

[0033] 通过阅读以下详细说明以及所附权利要求书，本发明的这些和其它方面、特征和优点对于本领域技术人员而言将是明显的。本发明的一个方面的任何特征可以用于本发明的任何其它方面。术语“包含”意图为开放式的，并且在适当的情况下可以用“由……组成”替换。在本文中，除非另外指出，百分比是指重量/重量百分比。除了在实施例中，或者另外明确说明，说明书和权利要求书中指示物质质量、物理性质等的所有数字应当理解为以“约”修饰，可以表示所述数值±10%或5%。

[0034] 如本文中使用，“酵素”是指以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品。在本发明中提供了荔枝酵素，是指以荔枝为原料在添加碳源的情况下经微生物发酵得到的产品。

[0035] 如本文中使用，“生物活性成分”是指经发酵制得的对生命现象有影响的微量或少量物质。生物活性成分可以包括多糖、寡糖、多酚、蛋白质以及多肽、氨基酸、维生素等。

[0036] 本发明提供了制备荔枝酵素的方法，其包括二步发酵过程。具体地，方法包括一级发酵，其包括在荔枝果液和荔枝果渣中添加第一碳源，接种第一菌剂，于第一温度密封静置发酵第一时间段，其中第一菌剂是酵母菌与乳酸菌的混合菌剂。酵母菌可以为异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母中的一种或多种。乳酸菌可以为植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌中的一种或多种。

[0037] 第一温度的范围可以为20‑45℃，例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或其间的任何范围。第一时间段的范围可以为24‑96小时，诸如25、30、35、40、45、50、55、60、75、70、75、80或90小时。

[0038] 第一碳源可以为果糖、蔗糖、红糖、麦芽糖、阿拉伯糖中的一种或多种。第一碳源的添加量可以为0‑5wt%，例如1wt%、1.5 wt%、2wt%、2.5wt%、3wt%、3.5wt%、或4wt%。第一碳源可以包含两种以上的糖类，例如重量百分比相同的两种以上的糖类。在一个实施方案中，第一碳源为果糖:红糖=1:1。在一个实施方案中，第一碳源为蔗糖。在一个实施方案中，第一碳源为麦芽糖:阿拉伯糖=1:1。在一个实施方案中，第一碳源为麦芽糖。在一个实施方案中，第一碳源为果糖:蔗糖:红糖为1:1:1。在一个实施方案中，第一碳源为蔗糖:阿拉伯糖=1:1。

[0039] 酵母菌:乳酸菌的重量比可以为50:1‑500:1，例如50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1或400:1。

[0040] 第一菌剂的添加量可以为荔枝总质量的0.1‰‑10‰，例如0.5‰、0.9‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰、7‰、8‰或9‰。

[0041] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为400:1；酵母菌为清酒酵母；乳酸菌为副干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌:格氏乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.9‰。

[0042] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为100:1；酵母菌为面包酵母:毕赤酵母:鲁氏酵母为1:1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的5‰。

[0043] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为50:1；酵母菌为威尔酵母:胶红酵母:鲁氏酵母为1:1:1；乳酸菌为清酒乳杆菌:干酪乳杆菌为1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.1‰。

[0044] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为300:1；酵母菌为异常汉逊酵母；乳酸菌为格氏乳杆菌。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的10‰。

[0045] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为500:1；酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的8‰。

[0046] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为200:1；酵母菌为胶红酵母；乳酸菌为植物乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的2‰。

[0047] 在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为150:1；酵母菌为面包酵母；乳酸菌为干酪乳杆菌。在一个实施方案中，第一菌剂的的添加量为荔枝总质量的4‰。

[0048] 可以对一级发酵后的产物进行挤压和过滤，获得一级发酵滤液。该过程可以通过本领域已知的各种方式进行，例如可以通过压滤机进行。在一级发酵过程之前可以进行对荔枝果的清洗和压榨的前处理步骤。

[0049] 制备荔枝酵素的方法还包括二级发酵过程，其包括在一级发酵滤液中添加第二碳源，接种第二菌剂，于第二温度静置或通气培养第二时间段以得到荔枝酵素，其中第二菌剂是醋酸菌。第二菌剂可以是巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。第二碳源可以为乳糖、赤砂糖、葡萄糖、糖蜜或蜂蜜中的一种或多种。第二碳源可以包含两种以上的糖类，例如重量百分比相同的两种以上的糖类。第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的1%‑20%，例如2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%。在一个实施方案中，第二碳源是乳糖。在一个实施方案中，第二碳源是赤砂糖。在一个实施方案中，第二碳源是糖蜜:乳糖为1:1。在一个实施方案中，第二碳源是葡萄糖。在一个实施方案中，第二碳源是蜂蜜。在一个实施方案中，第二碳源是葡萄糖:蜂蜜为1:1。

[0050] 第二温度的范围可以为15‑40℃，例如16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或其间的任何范围。第二时间段的范围可以为3‑15天，例如4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天。

[0051] 第二菌剂的添加量可以为一级发酵滤液总质量的0.1‰‑10‰，例如0.5‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰、7‰、8‰或9‰。

[0052] 在一个实施方案中，第二菌剂是醋酸醋杆菌：醋化醋杆菌。在一个实施方案中，第二菌剂添加量为一级发酵滤液总质量的1‰。

[0053] 在一个实施方案中，第二菌剂是巴氏醋杆菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的5‰。

[0054] 在一个实施方案中，第二菌剂是醋化醋杆菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的9‰。

[0055] 在一个实施方案中，第二菌剂是加纳醋杆菌:醋化醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰。

[0056] 在一个实施方案中，第二菌剂是恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的0.9‰。

[0057] 在一个实施方案中，第二菌剂是恶臭醋酸菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的3‰。

[0058] 在一个实施方案中，第二菌剂是加纳醋杆菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的10‰。

[0059] 在一个实施方案中，接种用的酵母菌含量均为至少1.0×106CFU/g，例如1.5×6 6 6 6 6 6
10CFU/g、2×10CFU/g、2.5×10CFU/g、3×10CFU/g、3.5×10CFU/g、4×10CFU/g、4.5×
6 6 6 6 6 6
10CFU/g、5×10CFU/g、5.5×10CFU/g、6×10CFU/g、6.5×10CFU/g、7×10CFU/g、7.5×
6 6 6 6 6
10CFU/g、8×10CFU/g、8.5×10CFU/g、9×10CFU/g或9.5×10CFU/g。

[0060] 在一个实施方案中，接种用的乳酸菌含量均为至少1.0×105CFU/g，例如1.5×6 6 6 6 6 6
10CFU/g、2×10CFU/g、2.5×10CFU/g、3×10CFU/g、3.5×10CFU/g、4×10CFU/g、4.5×
6 6 6 6 6 6
10CFU/g、5×10CFU/g、5.5×10CFU/g、6×10CFU/g、6.5×10CFU/g、7×10CFU/g、7.5×
6 6 6 6 6
10CFU/g、8×10CFU/g、8.5×10CFU/g、9×10CFU/g或9.5×10CFU/g。

[0061] 在一个实施方案中，接种用的醋酸菌原始菌含量均为至少1.0×105CFU/g，例如6 6 6 6 6 6
1.5×10 CFU/g、2×10CFU/g、2.5×10 CFU/g、3×10CFU/g、3.5×10 CFU/g、4×10CFU/g、
6 6 6 6 6 6
4.5×10 CFU/g、5×10CFU/g、5.5×10 CFU/g、6×10CFU/g、6.5×10 CFU/g、7×10CFU/g、
6 6 6 6 6
7.5×10CFU/g、8×10CFU/g、8.5×10CFU/g、9×10CFU/g或9.5×10CFU/g。

[0062] 在本文中，静置培养可以为本领域技术人员已知的任何形式的静置培养，例如8层纱布封口静置培养。此外，通气培养可以为本领域技术人员已知的任何形式的通气培养。通气量可以为0.1‑20mL/min/mL发酵液，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19 mL/min/mL发酵液。

[0063] 通过本方法制备的荔枝酵素可以作为添加成分加入到制品中，例如添加到食品或功能性食品，或者作为食品或功能性食品。荔枝酵素的形式没有特别限制。例如，荔枝酵素可以是液体。本发明的荔枝酵素可以用于提高肠道屏障功能、双向调节免疫（例如肠道免疫）、改善肠道炎症、维持肠道稳态，进而改善肠道健康。本发明的荔枝酵素可以调节巨噬细胞的NO分泌来实现这些效果：一方面，本发明的荔枝酵素可以激活巨噬细胞生成NO，发挥非特异免疫效用；另一方面，本发明的荔枝酵素可以抑制LPS诱导的炎症细胞释放NO，具有抗炎活性。

[0064] 已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求的范围内。

[0065] 以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本申请。实施例

[0066] 下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外指明，所列出的所有量均基于总重的重量百分比描述。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。

[0067] 在实施例中使用的菌剂如下：

[0068] 清酒酵母Saccharomyces sake CCTCC CY 20081270（购自典型培养物保藏中心）；面包酵母Saccharomyces sp. GDMCC 2.115（购自广东省微生物菌种保藏中心）；异常毕赤酵母Pichia anomala CICC 1859（购自中国工业微生物菌种保藏中心）；鲁氏酵母
Saccharomyces rouxii Boutroux GDMCC 2.55（购自广东省微生物菌种保藏中心）；威尔酵母Saccharomyces willianus Saccardo GDMCC 2.60（购自广东省微生物菌种保藏中心）；
胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa CICC 13237（购自中国工业微生物菌种保藏中心）；
异常汉逊酵母Hansenula anomala var. Anomala CICC 1641（购自中国工业微生物菌种保藏中心）。

[0069] 副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei CGMCC 1.9089（购自中国普通微生物保藏中心）；植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC1.572（购自中国普通微生物保藏中心）；干酪乳杆菌Lactobacillus casei CGMCC 1.575（购自中国普通微生物保藏中心）；罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri CICC 6121（购自中国工业微生物菌种保藏中心）；清酒乳杆菌Lactobacillus sakei subsp. sakei CICC 21858（购自中国工业微生物菌种保藏中心）；格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri FRI2008082（宁波泰斯拓生物技术有限责任公司）。

[0070] 醋酸醋杆菌Acetobacteraceti aceti ATCC15973（来自美国典型培养物保藏中心）；醋化醋杆菌Acetobacter aceti BNCC159639（购自北纳生物菌种保藏中心）；巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus GDMCC 1.67（购自广东省微生物菌种保藏中心）；加纳醋杆菌Acetobacter ghanensis CICC 7002（购自中国工业微生物菌种保藏中心）；恶臭醋酸菌Acetobacter rancens BNCC183824（购自北纳生物菌种保藏中心）。以上菌株以菌粉购买，6 5
酵母菌原始菌含量均为1.0×10CFU/g，乳酸菌原始菌含量均为1.0×10CFU/g，醋酸菌原始
5
菌含量均为1.0×10CFU/g。实验过程中以菌株菌粉形式添加。

[0071] 实施例1：荔枝酵素的制备

[0072] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0073] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，30℃密封静置发酵72h；

[0074] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0075] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，15℃通气培养5天；

[0076] （5）过滤、灭菌。

[0077] 在本实施例中，糖1为果糖:红糖=1:1；糖1的添加量为2%（w/w）；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为400:1；酵母菌为清酒酵母；乳酸菌为副干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌:格氏乳杆菌为1:1:1；菌剂1的添加量为荔枝总质量的0.9‰。

[0078] 在本实施例中，糖2为乳糖；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的15%；菌剂2为醋酸醋杆菌:醋化醋杆菌为1:1；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的1‰；培养方式为通气量为1mL/min/mL发酵液的通气培养。

[0079] 通过上述方法制备得到荔枝酵素。

[0080] 实施例2：荔枝酵素的制备

[0081] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0082] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，21℃密封静置发酵96h；

[0083] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0084] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，37℃通气培养7天；

[0085] （5）过滤、灭菌。

[0086] 在本实施例中，糖1为蔗糖；糖1的添加量为5%（w/w）；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为100:1；酵母菌为面包酵母:毕赤酵母:鲁氏酵母为1:1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌为1:1:1；菌剂1的添加量为荔枝总质量的5‰。

[0087] 在本实施例中，糖2为赤砂糖；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的1%；菌剂2为巴氏醋杆菌；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的5‰；培养方式为通气量为15mL/min/mL发酵液的通气培养。

[0088] 实施例3：荔枝酵素的制备

[0089] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0090] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，45℃密封静置发酵24h；

[0091] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0092] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，30℃通气培养3天；

[0093] （5）过滤、灭菌。

[0094] 在本实施例中，糖1为麦芽糖:阿拉伯糖1:1；糖1的添加量为4%（w/w）；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为50:1；酵母菌为威尔酵母:胶红酵母:鲁氏酵母为1:1:1；乳酸菌为清酒乳杆菌:干酪乳杆菌为1:1；菌剂1的添加量为荔枝总质量的0.1‰。

[0095] 在本实施例中，糖2为糖蜜:乳糖为1:1；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的5%；菌剂2为醋化醋杆菌；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的9‰；培养方式为通气量为
20mL/min/mL发酵液的通气培养。

[0096] 实施例4：荔枝酵素的制备

[0097] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0098] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，39℃密封静置发酵25h；

[0099] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0100] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，25℃通气培养10天；

[0101] （5）过滤、灭菌。

[0102] 在本实施例中，糖1为麦芽糖；糖1的添加量为1%（w/w）；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为300:1；酵母菌为异常汉逊酵母；乳酸菌为格氏乳杆菌；菌剂1的添加量为荔枝总质量的
10‰。

[0103] 在本实施例中，糖2为葡萄糖；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的18%；菌剂2为加纳醋杆菌:醋化醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰；培养方式为通气量为3mL/min/mL的通气培养。

[0104] 实施例5：荔枝酵素的制备

[0105] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0106] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，25℃密封静置发酵48h；

[0107] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0108] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，40℃通气培养9天；

[0109] （5）过滤、灭菌。

[0110] 在本实施例中，糖1为果糖:蔗糖:红糖为1:1:1；糖1的添加量为3%（w/w）；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为500:1；酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1；菌剂1的添加量为荔枝总质量的8‰。

[0111] 在本实施例中，糖2为蜂蜜；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的20%；菌剂2为恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的0.9‰；培养方式为通气量为5mL/min/mL发酵液的通气培养。

[0112] 实施例6：荔枝酵素的制备

[0113] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0114] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，32℃密封静置发酵86h；

[0115] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0116] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，35℃通气培养15天；

[0117] （5）过滤、灭菌。

[0118] 本实施例中糖1添加量为0%；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为200:1；酵母菌为胶红酵母；乳酸菌为植物乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1；菌剂1的添加量为荔枝总质量的2‰。

[0119] 本实施例中糖2为葡萄糖:蜂蜜为1:1；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的10%；菌剂2为恶臭醋酸菌；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的3‰；培养方式为通气量为
0.1mL/min/mL发酵液的通气培养。

[0120] 实施例7：荔枝酵素的制备

[0121] （1）前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；

[0122] （2）一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，28℃密封静置发酵65h；

[0123] （3）过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60%；

[0124] （4）二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，28℃静置培养13天；

[0125] （5）过滤、灭菌。

[0126] 本实施例中，糖1为蔗糖:阿拉伯糖为1:1；糖1的添加量为2.5%（w/w）；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为150:1；酵母菌为面包酵母；乳酸菌为干酪乳杆菌；菌剂1的添加量为荔枝总质量的4‰。

[0127] 本实施例中，糖2为赤砂糖；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的3%；菌剂2为加纳醋杆菌；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的10‰；静置培养为8层纱布封口静置培养。

[0128] 实施例8：功效测试方法

[0129] 荔枝酵素实验处理方式：

[0130] 称取1mg荔枝酵素样品溶于1mL PBS中，制成1mg/mL的母液，然后稀释成31.25、62.5、125、250、500、1000倍的样品液，与之对应的浓度为32、16、8、4、2、1 μg/mL。

[0131] 人结肠癌细胞Caco‑2肠道屏障功能测试实验

[0132] 细胞培养及细胞单层屏障模型的建立：

[0133] 将保存于液氮中的Caco‑2细胞进行复苏，当细胞贴壁融合率达到85%时，在 37℃下消化细胞约5 min后进行传代培养。其中，完全培养基中含有1%的100 µg/mL 链霉素、100 U/mL青霉素以及10%的胎牛血清。

[0134] 在进行单层屏障模型建立前，提前用预冷的PBS溶液润湿迁移杯Transwell的上4
室，之后将细胞以1x10个细胞数/孔的密度接种Transwell板的上室中，并使用无血清的培养基饥饿细胞24 h，之后再更换为完全培养基。在细胞连续生长18 21天后则可在
~
Transwell板的上室形成连续且致密的细胞单层，此时可进行后续实验处理。

[0135] 整个实验分为三个组：空白组、脂多糖（LPS）造模组、酵素处理组。实验选用分段孵育的模型，其中，空白组代表只添加完全培养基，不进行任何实验处理；造模组代表向完全培养基中添加终浓度为5 μg/mL的LPS，在与细胞共同孵育24 h后需用PBS洗去；酵素处理组代表在LPS与Caco‑2细胞共同孵育24 h后用PBS洗净，此时将不同浓度荔枝酵素液（实施例5）与Caco‑2细胞共孵育6h。

[0136] 肠道细胞跨膜电阻值（TEER）的检测

[0137] 将Caco‑2细胞接种在24孔的Transwell小室中。待细胞连续培养18 21天后，若~2
TEER值达到300 1000 Ω·cm ，则指示已经形成了致密的细胞单层。之后，在下室加入终浓~
度为5 μg/mL LPS与上层细胞作用24 h，后测量细胞TEER值，当电阻值下降超过20%则认为造模成功。之后再添加荔枝酵素与细胞共孵育6 h，再次测定TEER值。最后，计算肠道细胞TEER的相对变化值。

[0138] Caco‑2上皮细胞单层的TEER值能够反映肠上皮的屏障功能，采用LPS造模之后肠道屏障功能受损，荔枝酵素的干预如果可以升高上皮细胞单层的TEER值，则说明其具有恢复受损的肠屏障的作用。

[0139] 根据图1可知，荔枝酵素在浓度大于0.1μg/mL时，具有显著提高肠道细胞跨上皮细胞电阻值的作用（p <0.05），说明荔枝酵素能够修复肠道屏障功能。

[0140] 巨噬细胞RAW264.7免疫活性测试实验

[0141] 巨噬细胞RAW264.7的一氧化氮（NO）分泌量测定:

[0142] 一氧化氮（NO）是巨噬细胞产生的主要效应分子，当巨噬细胞被激活后，生成的NO发挥非特异免疫的主要细胞毒效应。若荔枝酵素能够影响NO的分泌，则说明荔枝酵素能够调节免疫。本实验测定荔枝酵素对巨噬细胞的NO分泌量的影响。

[0143] 把对数生长期细胞，按每孔5×105个细胞加入24孔板，加入各浓度荔枝酵素1、2、4、8、16、32μg/mL刺激24 h，吸上清，按照50 μL/孔，加入96 孔板中，同时设置空白对照；每孔加入50 μL室温Griess I，轻混匀；每孔加入50 µl室温Griess II轻混匀；以酶标仪检测
540 nm处的测吸光度。

[0144] 根据图2可知，不同浓度的荔枝酵素（实施例5）能够促进巨噬细胞分泌NO，表明酵素样品能够激活巨噬细胞，参与免疫调节。

[0145] 巨噬细胞RAW264.7的炎症模型实验

[0146] 巨噬细胞RAW264.7用含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素、链霉素的DMEM培养基培养，二氧化碳培养箱条件为37℃, 5% CO2。待细胞生长至培养皿的80%时进行传代，传代时用移液枪吸取的培养基反复吹吸使细胞脱壁并形成单细胞悬液，200 g离心3分钟，弃上清，5
加入新鲜培养基吹匀后接种于培养皿。将巨噬细胞RAW264.7以每孔5x10的密度接种于六孔板，每种处理设3个孔。待贴壁并生长至孔面积的70%时开始进行处理，用含不同浓度（0.01、0.1、1、2、4、8、16 μg/mL）的荔枝酵素（实施例5）和LPS（0.1 μg/mL）的特制DMEM培养基处理细胞24 h。结束后，收集培养基上清液，每份样品取50 μL加入96孔板进行检测，每孔中加入Griess试剂I 50 μL，再加入50 μL Griess试剂Ⅱ，发生显色反应后，于540 nm检测吸光度值。

[0147] 评价标准：

[0148] 当巨噬细胞受到LPS等刺激时，诱导型一氧化氮合成酶会显著增加，从而产生大量的NO进行免疫应答。NO具有一定细胞毒性，会进一步对机体造成损伤，从而促进炎症部位渗出和水肿。抑制NO生成的程度则是检测抗炎活性的直接指标。如果添加荔枝酵素样品可以抑制NO的生成，则说明荔枝酵素具有良好的抗炎活性。

[0149] 根据图3可知，不同浓度的荔枝酵素能够抑制LPS诱导的炎症细胞释放NO，表明荔枝酵素具有抗炎活性。其具有抗炎活性的浓度范围为0.1‑8 μg/mL。图2与图3的实验结果表明，荔枝酵素对免疫的调节具有双向性，有助于维持肠道稳态。

[0150] 实施例1‑7的荔枝酵素的效果比较

[0151] 利用实施例1‑7的荔枝酵素，以样品浓度为4μg/mL进行上述人结肠癌细胞Caco‑2肠道屏障功能测试实验、巨噬细胞RAW264.7免疫活性测试实验和巨噬细胞RAW264.7的炎症模型实验，并且比较了各荔枝酵素的效果。表1中显示了荔枝酵素的效果。

[0152] 表1：不同实施例的效果

[0153]

[0154] 注：跨上皮细胞电阻值恢复率=酵素干预组跨上皮细胞电阻值/初始跨上皮细胞电阻值*100%

[0155] 抗炎效率=（模型组NO释放量‑样品组NO释放量）/模型组NO释放量*100%

[0156] 根据表1可知，实施例7获得的荔枝酵素的效果最差。实施例1‑5中均添加了第一碳源并采用通气培养的方式，相比之下实施例6中未添加第一碳源且二级发酵过程中通气量为0.1mL/min/mL，实施例7中添加了第一碳源且二级发酵过程中采用静置培养的方式，结果表明第一碳源的添加及第二步发酵过程通气培养对发酵过程产生了有利的变化，进而增强了荔枝酵素对于肠道健康的有益效果。采用实施例5获得的荔枝酵素在跨上皮细胞电阻值恢复率、免疫活性测试中一氧化氮（NO）释放量、炎症模型中一氧化氮（NO）释放量和抗炎效率上取得了最佳的效果。发明人在长期的研究中通过调整菌株和培养参数发现，除了实施例5外的其他培养菌株或条件（诸如实施例1‑4和6）不能实现如此高的抗炎效率；并且使用实施例5中的单个菌进行的实验得到的效果相加也远不如本发明实施例5的菌组合得到的效果。

[0157] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。