一种生物质炭基菌肥及其制备方法与应用

摘要

本发明属于生物质炭基菌肥技术领域，具体涉及一种生物质炭基菌肥及其制备方法与应用。本发明是以生物质炭为基础，构建适合土壤生防细菌扩繁的载体。以人参栽培生防益生菌——死谷芽孢杆菌为探针，构建适宜的炭基‑微生物复合体系(即生物质炭基菌肥)，达到提高生防菌活菌数，延长田间防治时间，增强防效的目的。

权利要求

1.一种用于提高微生物定殖率的生物质炭基载体，所述生物质炭基载体是通过如下方法制备得到的：（1）将生物质原材料置于密闭的石英管内，抽真空后通入氮气，在无氧和氮气气氛保护下，炭化，制备得到生物质炭；

（2）对所述生物质炭在超声条件下进行溶剂化处理，制备得到生物质炭基载体；所述溶剂化处理是将所述生物质炭浸没在溶剂中，在超声条件下进行溶剂化处理；其中，所述的溶剂为水；

步骤（1）中，所述生物质原材料选自玉米芯、玉米秸秆、大豆秸秆、杨树枝条、瓜子壳、食用菌栽培废料；

步骤（1）中，所述炭化的温度为200 600℃，所述炭化的时间为20 100min。

~ ~

2.根据权利要求1所述的生物质炭基载体，其中，步骤（2）中，所述超声条件包括高频超声处理和低频超声处理，其中，所述高频超声处理的频率为50 80KHz，所述低频超声处理的~频率为30 45KHz。

~

3.一种提高微生物定殖率的方法，所述方法包括如下步骤：（a）将菌种发酵液与权利要求1或2所述的生物质炭基载体混合，得到混合体系；

（b）将步骤（a）的混合体系与营养配方粉混合，进行定殖培养；

步骤（a）中，所述菌种发酵液与生物质炭基载体的质量比为5 10:40 60；所述的菌种发~ ~

6 8

酵液中含菌量为10 10 CFU/mL；

~

步骤（b）中，所述生物质炭基载体与营养配方粉的质量比为60 40:40 60；

~ ~

所述营养配方粉选自基础培养基和天然物的混合物，其中，所述天然物选自玉米粉、大米粉和黄豆粉中的至少一种；所述基础培养基和天然物的质量比为60 40:40 60；

~ ~

所述定殖培养的温度为28 32℃，所述定殖培养的时间为1 5天，所述定殖培养的是在~ ~摇床中进行的，摇床的转速为150 200r/min。

~

4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（a）中，所述菌种选自芽孢杆菌类微生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（a）中，所述菌种选自生防菌SZ‑4。

6.一种生物质炭基菌肥，其包括权利要求1或2所述的生物质炭基载体和芽孢杆菌类微生物；

所述生物质炭基菌肥包括40 60质量份的生物质炭基载体、5 10质量份的芽孢杆菌类~ ~ 6 8微生物发酵液；其中，所述的芽孢杆菌类微生物发酵液中含菌量为10 10 CFU/mL；

~

所述生物质炭基菌肥还包括40 60质量份的营养配方粉；

~

所述营养配方粉选自基础培养基和天然物的混合物，其中，所述基础培养基和天然物的质量比为60 40:40 60。

~ ~

7.根据权利要求6所述的生物质炭基菌肥，其中，所述天然物选自玉米粉、大米粉和黄豆粉中的至少一种。

8.权利要求6或7所述的生物质炭基菌肥在土壤的修复、改良中的应用。

9.权利要求6或7所述的生物质炭基菌肥在人参种植中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其中，所述土壤为人参种植土壤。

2

11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述生物质炭基菌肥按1‑3t/1000m量施用于人参种植田中。

说明书

一种生物质炭基菌肥及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物质炭基菌肥技术领域，具体涉及一种生物质炭基菌肥及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 人参为五加科人参属多年生草本植物，适宜生长在弱酸性的森林腐殖土中，主产于长白山区，为我国传统名贵中药材。我国人参药材的供给主要依赖于集约化的人工种植，但人参栽培存在严重的连作障碍问题，其忌连作周期达到10～30年。随着目前道地产区宜参土地资源的不断减少，如何进行老参地土壤的修复、改良一直是人参栽培研究的热点。

[0003] 修复手段大致可分为如下几类：农业修复(合理施肥、改土、轮作)、化学修复(土壤消毒、添加各种农药防病治病)、生物修复(引入生防细菌、真菌、放线菌拮抗病原菌的生长繁殖)等。

[0004] 但上述修复手段都存在一定的缺陷，只能缓解无法根治。(1)农业修复：改土轮作没有操作标准和规程，效果因人而异，不可重复且不稳定；施肥标准不清，易导致化肥超施、滥施。(2)化学法：它是目前主要的防治手段，但大量农药反复施用容易使病菌产生抗药性，导致环境污染，与绿色农业、生态农业产业的发展要求相冲突。(3)生物修复：主要是指植物和微生物修复，是利用植物、微生物及其环境共存体系对污染物进行去除、转移、固定和降解，以恢复土壤体系正常生态功能。与其他方法相比，植物或微生物修复在经济、实用和生态效应等方面具有不可比拟的优势，且可以大面积应用，但植物修复治理周期长，效果不稳定，环境要求高，且不易筛选超积累植物；而微生物修复影响因素比较复杂，主要包括微生物种群、底物性质、土壤环境条件等，使得游离微生物存在抗菌性差、难存活、有效浓度低等问题，严重影响了微生物修复的实际效果。因此，老参地土壤的修复、改良还需不断探索新的解决方案，走综合治理的路子。

发明内容

[0005] 本发明提供一种生物质炭基菌肥及其制备方法与应用。本发明中，作为探针的死谷芽孢杆菌(B.vallismortis(Bacillus amyloliquefaciens))是一株对引起人参根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的主要病原菌具有显著拮抗作用的生防菌，记为SZ‑4。

[0006] 具体地，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种用于提高微生物定殖率的生物质炭基载体，所述生物质炭基载体是通过如下方法制备得到的：

[0008] (1)将生物质原材料置于密闭的石英管内，抽真空后通入氮气，在无氧和氮气气氛保护下，炭化，制备得到生物质炭；

[0009] (2)对所述生物质炭在超声条件下进行溶剂化处理，制备得到生物质炭基载体。

[0010] 根据本发明，步骤(1)中，所述炭化是在真空管式炉中进行的。

[0011] 根据本发明，步骤(1)中，所述生物质原材料选自玉米芯、玉米秸秆、大豆秸秆、杨树枝条(例如来源于园林修剪残枝)、瓜子壳、食用菌栽培废料(如菇渣)。

[0012] 根据本发明，步骤(1)中，所述生物质原材料的粒径为大于60目，例如为碎屑(尺寸小于1cm)、14目、20目、40目、60目。

[0013] 根据本发明，步骤(1)中，所述炭化的温度为200～600℃，例如为200℃、300℃、400℃、500℃、600℃。

[0014] 根据本发明，步骤(1)中，所述炭化的时间为20～100min，例如为20min、40min、60min、80min、100min。

[0015] 根据本发明，步骤(1)中，所述炭化的升温速率为5～20℃/min，例如为5℃/min、10℃/min、15℃/min、20℃/min。

[0016] 根据本发明，步骤(1)中，所述生物质炭的孔径为2.941～29.22μm，所述生物质炭为中孔结构的生物质炭。

[0017] 根据本发明，步骤(2)中，所述超声条件包括高频超声处理和低频超声处理，其中，所述高频超声处理的频率为50～80KHz，例如为61KHz，所述低频超声处理的频率为30～45KHz，例如为35KHz。

[0018] 根据本发明，步骤(2)中，所述高频超声处理的时间和所述低频超声处理的时间相同，为10～30min，例如为15min。

[0019] 根据本发明，步骤(2)中，所述溶剂化处理是将所述生物质炭浸没在溶剂中，在超声条件下进行溶剂化处理。

[0020] 其中，所述的溶剂为酸、碱、水和醇中的至少一种。示例性地，为5％的稀HCl、5％的NaOH、75％的乙醇水溶液和蒸馏水中的至少一种。

[0021] 其中，所述生物质炭与溶剂的质量比为1:2～10，例如为1:5。

[0022] 根据本发明，所述方法还包括后处理步骤，所述后处理步骤包括将溶剂化处理后的物料减压过滤，蒸馏水洗涤至中性，蒸气灭菌(121℃，15min)后低温烘干备用。

[0023] 本发明还提供一种提高微生物定殖率的方法，所述方法包括如下步骤：

[0024] (a)将菌种发酵液与生物质炭基载体混合，得到混合体系；

[0025] (b)将步骤(a)的混合体系与营养配方粉混合，进行定殖培养。

[0026] 本发明中，采用上述的定殖培养方法可以实现提高微生物定殖率。

[0027] 根据本发明，步骤(a)中，所述菌种选自芽孢杆菌类微生物，如生防菌SZ‑4。

[0028] 根据本发明，步骤(a)中，所述菌种发酵液是通过如下方法制备得到的：

[0029] 将菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基(即基础培养基)中，30℃，180r/min摇床培养24h，得到细菌种子液；按1～10％接种量转入基础培养基中，30℃，180r/min摇床培养36h，得到菌种发酵液。

[0030] 其中，所述的菌种发酵液中含菌量为106～108CFU/mL。

[0031] 根据本发明，步骤(a)中，所述菌种发酵液与生物质炭基载体的质量比为5～10:40～60，例如为5:40、7:50、8:55、10:60。

[0032] 根据本发明，步骤(a)中，所述生物质炭基载体使用前可以先用蒸馏水湿润。

[0033] 根据本发明，步骤(b)中，所述生物质炭基载体与营养配方粉的质量比为60～40:40～60，例如为50:50。

[0034] 根据本发明，步骤(b)中，所述营养配方粉选自基础培养基和天然物的混合物，其中，所述天然物选自玉米粉、大米粉和黄豆粉中的至少一种；所述基础培养基和天然物的质量比为60～40:40～60，例如为50:50。

[0035] 示例性地，所述营养配方粉选自基础培养基+玉米粉(配方1)；基础培养基+大米粉(配方2)；基础培养基+黄豆粉(配方3)中的至少一种，其中，基础培养基是指的牛肉膏蛋白胨液体培养基。

[0036] 根据本发明，步骤(b)中，所述定殖培养的温度为28～32℃，例如为30℃。

[0037] 根据本发明，步骤(b)中，所述定殖培养的时间为1～5天，例如为2～4天。

[0038] 根据本发明，步骤(b)中，所述定殖培养的是在摇床中进行的，摇床的转速为150～200r/min，例如为180r/min。

[0039] 本发明还提供一种生物质炭基菌肥，其包括上述的生物质炭基载体和芽孢杆菌类微生物。

[0040] 根据本发明，所述生物质炭基菌肥包括40～60质量份的生物质炭基载体、5～10质6
量份的芽孢杆菌类微生物发酵液。其中，所述的芽孢杆菌类微生物发酵液中含菌量为10 ～
8
10CFU/mL。

[0041] 根据本发明，所述生物质炭基菌肥还包括营养配方粉。

[0042] 根据本发明，所述生物质炭基菌肥还包括40～60质量份的营养配方粉。

[0043] 根据本发明，所述营养配方粉选自基础培养基和天然物的混合物，其中，所述天然物选自玉米粉、大米粉和黄豆粉中的至少一种；所述基础培养基和天然物的质量比为60～40:40～60，例如为50:50。

[0044] 示例性地，所述营养配方粉选自基础培养基+玉米粉(配方1)；基础培养基+大米粉(配方2)；基础培养基+黄豆粉(配方3)中的至少一种，其中，基础培养基是指的牛肉膏蛋白胨液体培养基。其中，所述基础培养基包括蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000ml，所述基础培养基的pH7.3。

[0045] 本发明还提供一种生物质炭基菌肥的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0046] (i)无菌条件下，将菌种发酵液加入到生物质炭基载体中，再加入营养配方粉，得到混合体系；

[0047] (ii)培养；

[0048] (iii)48h后每隔2h检查发酵培养质量，以血球计数板检查含菌量>108CFU/mL为培养终止标准。

[0049] 根据本发明，所述菌种为芽孢杆菌类微生物，优选为死谷芽孢杆菌SZ‑4。

[0050] 根据本发明，步骤(i)中，所述混合体系中，包括40～60质量份的生物质炭基载体、5～10质量份的菌种发酵液、40～60质量份的营养配方粉。

[0051] 其中，所述的菌种发酵液中含菌量为106～108CFU/mL。

[0052] 根据本发明，步骤(ii)中，所述培养的温度为28～32℃，例如为30℃。所述培养的时间为1～5天，例如为2～4天。所述培养的是在摇床中进行的，摇床的转速为150～200r/min，例如为180r/min。

[0053] 本发明还提供上述生物质炭基菌肥在土壤的修复、改良中的应用。

[0054] 本发明还提供上述生物质炭基菌肥在人参种植中的应用。

[0055] 根据本发明，所述土壤为人参种植土壤，更有选的，所述土壤为老参地。

[0056] 根据本发明，所述生物质炭基菌肥按1‑3t/1000m2量施用于人参种植田中。

[0057] 本发明的有益效果：

[0058] 本发明是以生物质炭为基础，构建适合土壤生防细菌扩繁的载体。以人参栽培生防益生菌——死谷芽孢杆菌为探针，构建适宜的炭基‑微生物复合体系(即生物质炭基菌肥)，达到提高生防菌活菌数，延长田间防治时间，增强防效的目的。

附图说明

[0059] 图1为实施例1的生物质炭的红外扫描光谱图，其中左图为玉米秸秆炭，右图为玉米芯炭)。

[0060] 图2为实施例1的生物质炭表面的扫描电镜图，其中，A(标尺为50μm)/a(标尺为5μm)为玉米秸秆炭、B(标尺为100μm)/b(标尺为5μm)为玉米芯炭。

[0061] 图3为实施例2的超声波耦合水改性对玉米秸秆炭定殖效果的影响，其中同一生防菌不同小字母表示P<0.05显著差异。

[0062] 图4为实施例2的经超声波耦合水改性处理后的玉米秸秆炭的电镜照片。

[0063] 图5为实施例3的不同营养配方粉对生防菌定殖效果的影响。

[0064] 图6为实施例3的不同单因素对生防菌定殖效果的影响。

[0065] 图7盆栽人参根系扫描图(A为经CK处理，B为经生物炭基肥处理)。

具体实施方式

[0066] 下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

[0067] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0068] 生物质炭的各参数的测试方法：

[0069] (1)生物质炭的理化性质测定

[0070] 填充密度参照环刀法；含水量参照植物样品水分测定方法；持水量参照土壤持水量测定方法；pH值：炭水比为1∶20，震荡30min后过滤，采用pH计测定；参照《木炭和木炭的实验方法》GB/T17664‑1999进行灰分测定，称取过100目筛的生物质炭，平铺于坩埚的底部，置于程序控马弗炉中，在通入氮气的条件下，于800℃下灰化4h，然后冷却至室温后，取出坩埚称量质量，根据前后质量差计算生物质炭的灰分含量，灰分含量的计算公式为：

[0071]

[0072] 式中：A代表样品中灰分的百分比含量，％；M代表灼烧前生物质炭的质量，g；M1代表空坩埚的质量，g；M2代表灼烧后灰分和坩埚的质量，g。

[0073] (2)生物质炭的比表面积测定

[0074] 采用比表面积测定仪在液氮温度(77k)条件下测定不同生物质炭对高纯液氮的吸附作用。样品前处理条件：100℃下真空脱气12h。根据测定的结果采用多点BET法计算生物质炭的比表面积。

[0075] (3)生物质炭的扫描电镜分析

[0076] 取10mg左右生物质炭样品平铺在测试板上，使其均匀的覆盖在板上，然后使用扫描电镜观察生物质炭的形状、结构和表面性状，分析观测条件：电压20.0KV，放大倍数为3400倍。

[0077] (4)生物质炭官能团的红外分析

[0078] 采用透射红外光谱测定生物质炭主要官能团，取适量干燥样品以重量比1:200与无水KBr混合，在玛瑙研钵中研磨均匀混合，压片后上机(TENSOR27型傅里叶红外光谱仪，FTIR)测定。

[0079] 实施例1

[0080] 将生物质原材料置于密闭的石英管内，抽真空后通入氮气，在无氧和氮气气氛保护下，加热炭化，制备得到生物质炭。

[0081] 生物质原材料为玉米芯、玉米秸秆、速生杨修剪枝条、食用菌栽培废料时，制备工艺一致，为加热温度400℃，加热时间40min，升温速率5℃/min，生物质原材料粒径为碎屑；

[0082] 生物质原材料为大豆秸秆时的制备工艺为加热温度400℃，加热时间40min，升温速率5℃/min，原材料粒径为20目；

[0083] 生物质原材料为瓜子壳时的制备工艺为加热温度400℃，加热时间40min，升温速率10℃/min，原材料粒径为碎屑。

[0084] 6种生物质原材料制备得到的6种生物质炭的得率大小排列顺序为：玉米芯(得率为36.10％)>玉米秸秆(得率为34.73％)>瓜子壳(3得率为4.07％)>菇渣(得率为33.89％)>杨树枝条(得率为32.28％)>大豆秸秆(得率为28.16％)。

[0085] 对上述6种生物质原材料制备得到的6种生物质炭进行如下性能分析：

[0086] (1)基本理化性质分析

[0087] 6种生物质炭的基本理化性质如表1所示。由表1可见，6种生物质炭的填充密度介‑3于0.1～0.25g·cm ，玉米芯炭填充密度最高，玉米秸秆炭最低。总体看来，6种生物质炭的‑3
填充密度均低于土壤(1.29～1.31g·cm )，因此，增施生物质炭可降低土壤容重，提高土壤平衡持水量和电导率。

[0088] 研究发现，东北黑土区土壤由于其良好的颗粒结构而具有较高的田间持水量，约为31～40％，显著高于红壤和黄壤区。上述6种生物质炭的平均田间持水量为77.84％，约为黑土的2倍，表明增施生物质炭可提高土壤的保水能力。

[0089] 表1实施例1制备的6种生物质炭的基本理化性质

[0090]

[0091] 6种生物质炭的pH均为碱性，其中碱性最大的是大豆秸秆炭和玉米秸秆炭，其次为瓜子壳炭、杨树炭、玉米芯炭、菇渣炭的pH值接近中性。栽培人参后土壤酸化严重，施用上述6种生物质炭可改善土壤pH值，有助于维持土壤正常的理化性质。

[0092] 由表1可见，6种生物质炭中，大豆秸秆炭、杨树枝炭、菇渣炭灰分含量高于其余生物质炭。植物的灰分中含有较多的矿质元素，如Na、K、Mg、Ca等，且植物的灰分含量越高，表明生物质炭的养分含量越好。

[0093] 分析6种生物质炭的比表面积和平均孔径，菇渣炭比表面积最大，其次为玉米芯炭、玉米秸秆炭、杨树枝炭、瓜子壳炭和大豆秸秆炭。孔径的大小排列顺序为：杨树枝炭>大豆秸秆炭>玉米秸秆炭>菇渣炭>瓜子壳炭>玉米芯炭。总体看来，比表面积较大，孔径较小的生物质炭孔隙结构较好，因此，菇渣炭、玉米芯炭、玉米秸秆炭是比较好的选择。

[0094] (2)生物质炭的红外光谱分析

[0095] 综合制备方案、得率与理化性质分析，将玉米秸秆炭和玉米芯炭作为重点研发对象，比较这2种生物质炭的红外扫描光谱图，如图1所示。

[0096] 由图1可见，玉米秸秆炭信息少于玉米芯炭。在X‑H伸缩振动区，波数为3200～‑13650cm 处为分子间氢键缔合的酚羟基的伸缩振动，该处出现多个吸收峰，表明存在多个‑‑1
OH。在3127～3130cm 处出现了2种炭的共有峰，为酰胺类官能团的N‑H伸缩振动。在双键伸‑1
缩振动区，1610cm 是芳香族化合物环内碳原子之间的伸缩振动引起的环的骨架振动，该处‑1
吸收峰显示生物质炭表面含有苯环类物质。在指纹区，1400cm 附近出现吸收峰，归属为C‑O键的反对称伸缩振动。

[0097] 综合上述分析可见，玉米秸秆炭和玉米芯炭均含有羟基、酰胺和一些含氧官能团，但数量和吸收强度存在差异。此外，玉米秸秆炭和玉米芯炭中还存在化学稳定性较强的芳环，表明玉米秸秆炭和玉米芯炭能够长期稳定存在于土壤中，这是生物质炭具有固碳作用和缓解温室效应的主要理论依据。

[0098] (3)生物质炭的扫描电镜分析

[0099] 玉米秸秆炭和玉米芯炭的微观形貌的扫描电镜表征结果如图2所示。对比发现，玉米秸秆炭在该条件下裂解并不完整，植物体一部分被灼烧、断裂，结构出现不完整性，残体大小不一，没有观察到明显的孔隙，但玉米秸秆炭和玉米芯炭某些部位存在一定数量的圆形微孔，这可能是植物体中水分或挥发分释放造成的。玉米芯炭呈蜂窝状，可能是玉米芯中髓部含有大量薄壁细胞导致的；总体看结构紧致，孔隙致密，表面粗糙，含有大量的颗粒物，孔隙壁均较厚，具有一定的机械支撑强度。

[0100] 综上，从上述测试结果可以看出：

[0101] (1)6种生物质炭的理化性质由于原材料不同存在差异，但pH值均呈碱性，填充密度均低于土壤，表明生物质炭施用于土壤可有效的提高土壤pH值，降低土壤容重，有助于维持土壤正常的理化性质。

[0102] (2)玉米秸秆炭得率、田间持水量、pH值、灰分、比表面积和平均孔径均居于6种生物质炭的中高位，表明其保水保肥性能较优；红外分析显示其表面含有丰富的酰胺、‑COH、‑OH等官能团，其产生的表面负电荷使生物质炭具有较高的阳离子交换量，施用生物质炭后可以提高土壤的阳离子交换量(CEC)。

[0103] (3)电镜分析显示低温制备的玉米秸秆炭具有一定的中孔特征，但由于裂解不彻底，其内部孔隙大小不一，结构不规则，需要进一步对其结构进行改性，以提高生物质炭孔径与被吸附分子之间的匹配度，增强生物质炭对化感物质或微生物的吸附、定殖效果。

[0104] 实施例2

[0105] (1)酸法：按料液比为1:5将上述实施例1的玉米秸秆炭浸没在5％的稀HCl溶液中，超声30min(高频(61KHz)15min，低频(35KHz)15min，50W，40℃)后减压过滤，蒸馏水洗涤至中性，蒸气灭菌(121℃，15min)后低温烘干备用。

[0106] (2)碱法：按料液比为1:5将上述实施例1的玉米秸秆炭浸没在5％的NaOH溶液中，超声30min(高频(61KHz)15min，低频(35KHz)15min，50W，40℃)后减压过滤，蒸馏水洗涤至中性，蒸气灭菌(121℃，15min)后低温烘干备用。

[0107] (3)有机溶剂：按料液比为1:5将上述实施例1的玉米秸秆炭浸没在75％的乙醇溶液中，超声30min(高频(61KHz)15min，低频(35KHz)15min，50W，40℃)后减压过滤，蒸馏水洗涤至中性，蒸气灭菌(121℃，15min)后低温烘干备用。

[0108] (4)水：按料液比为1:5将上述实施例1的玉米秸秆炭浸没在蒸馏水中，超声30min(高频(61KHz)15min，低频(35KHz)15min，50W，40℃)后减压过滤，蒸馏水洗涤至中性，蒸气灭菌(121℃，15min)后低温烘干备用。

[0109] 将采用酸、碱、水、醇结合超声波改性处理后的4种生物质炭分别接种供试菌种，以菌种定殖成功率反映生防菌SZ‑4偏好的炭改性方法。

[0110] 将供试菌种SZ‑4接入基础培养基中，30℃，180r/min摇床培养24h，得到细菌种子液。按5％接种量转入基础培养基中，30℃，180r/min摇床培养36h，得到供试菌种的发酵液，8
即生防菌SZ‑4发酵液，此时其含菌量约为10CFU/mL。

[0111] 称取5g实施例2中经超声波耦合改性处理后的4种玉米秸秆炭或实施例1的玉米秸秆炭分别于50mL无菌水中，180r/min下震荡30min，加入0.5ml的生防菌SZ‑4发酵液(接种量10％)，将上述体系置摇床中震荡培养(180r/min，30℃)5天，结果如图3所示。

[0112] 从图3中可以看出，超声波耦合酸或者是超声波耦合水改性有助于提高生防菌SZ‑4在生物质炭上的定殖成功率，超声波耦合水改性处理后的SZ‑4活菌数可达到65.00×
5
10CFU/g，较实施例1的玉米秸秆炭中定殖活菌数提高了87.05％(图3中原炭即为实施例1
5
的玉米秸秆炭，其活菌数可达到34.75×10CFU/g)。

[0113] 经超声波耦合水改性处理后的玉米秸秆炭电镜照片如图4。由图4可见，处理后玉米秸秆炭表面覆盖物减少，基本保留了植物体原本骨架，又暴露出了更多的孔隙结构，其疏松的孔隙彼此相连，有效的增加了比表面积。改性后的生物质炭孔径分布2.941～29.22μm之间，符合中孔生物质炭特性。

[0114] 综上可以看出，超声波耦合溶剂改性方法主要的利用超声波的空化效应，不断在微观尺度上实现生物质炭材料的局部爆破，增加生物质炭材料的孔隙度，创造丰富的孔环境，达到增加比表面积、促进微生物定殖的目的。结果显示，采用该方法可有效提高生防菌SZ‑4在生物质炭材料上的定殖成功率，较原炭提高87.05％。这与电镜照片中玉米秸秆炭微观结构变化一致。

[0115] 实施例3

[0116] 将供试菌种SZ‑4接入基础培养基中，30℃，180r/min摇床培养24h，得到细菌种子液。按5％接种量转入基础培养基中，30℃，180r/min摇床培养36h，得到供试菌种的发酵液，8
即生防菌SZ‑4发酵液，此时其含菌量约为10CFU/mL。

[0117] 定殖：将供试菌种的发酵液加入实施例2中经超声波耦合水改性处理后的玉米秸秆炭基载体中，在不同条件下培养一段时间后采用平板稀释涂布法测定活菌数。具体地，以单位质量玉米秸秆炭上活菌数作为定殖效果的评价指标，采用平板稀释涂布法进行活菌数的测定。具体为：

[0118] 称取5g实施例2中经超声波耦合水改性处理后的玉米秸秆炭于50mL无菌水中，‑1180r/min下震荡30min，取上述菌种发酵液1ml，加入9ml蒸馏水，震荡，得到10 稀释液，取上‑4 ‑5 ‑6
述稀释液1ml梯度稀释，逐步得到10 、10 、10 的生物质炭基肥稀释液。精密吸取0.1mL稀释液涂布于培养基平板中，3次重复，30℃培养箱中培养36h后计数，活菌数以CFU/g表示(g为生物质炭重量)。

[0119] 充足的养分供给有利于微生物定殖与扩繁，实验选择了3种不同类型营养配方粉，即基础培养基+玉米粉(配方1)；基础培养基+大米粉(配方2)；基础培养基+黄豆粉(配方3)，其中，基础培养基是指的牛肉膏蛋白胨液体培养基；探讨营养类型与添加量对生防菌在生物质炭中定殖效果的影响，结果如图5所示，图5中40％、50％、60％分别代表营养配方粉的占比。对SZ‑4而言，经超声波耦合水改性处理后的玉米秸秆炭搭载60％的配方3有助于SZ‑47
生长，其含菌数为56.00×10CFU/g。

[0120] 在此基础上，采用单因素实验进一步考察分析供试的接种量、培养温度、生物质炭粒径等指标对生防菌SZ‑4在玉米秸秆炭上定殖效果的影响，结果如图6所示。由图6可见，供试菌种的接种量、天然物(玉米粉、大米粉和黄豆粉)的添加比例、基础培养基的添加比例、培养时间最佳条件分别为：8％、50％、50％、4天。根据上述结果得到该生防菌进行正交实验的因素水平表及正交实验设计，如表2～表5。

[0121] SZ‑4在玉米秸秆炭上的定殖最佳条件为A1B2C2D2(接种量为7％，配方3添加50％，基础培养基添加量为50％，发酵时间为2d)，其中对SZ‑4在其定殖上含菌量的影响表现为B>7
D>C>A，此发酵条件下生防菌SZ‑4的含菌量可达到22.24×10 CFU/g，是原玉米秸秆炭上含菌量的2.63倍。综上可见，通过条件优化后，提高了炭载体上活菌数。

[0122] 表2SZ‑4定殖条件因素水平表

[0123]

[0124] 表3生防菌SZ‑4在玉米秸秆炭上定殖条件的优化

[0125]

[0126] 表4方差分析表

[0127]

[0128] 对生防菌SZ‑4优化后定殖条件进行验证，结果如表5所示，结果显示，条件稳定，可重复性强，经条件优化后，生物炭基肥中活菌数量分别为对照的2.45倍，符合生物有机肥国7
家质量标准(有效活菌数≥2.0×10CFU/g)。

[0129] 表5生防菌定殖条件优化效果

[0130]

[0131] 结果表明，以超声波耦合水改性处理后的玉米秸秆炭为基础，构建生物质炭基‑生防菌的耦合系统，生防菌SZ‑4的最佳定殖条件为：接种量7％，配方3，添加量50％，基础培养基添加量为50％，发酵时间为2d，活菌数达到原炭的2.45‑2.63倍。

[0132] 实施例4

[0133] 供试生防菌：

[0134] 死谷芽孢杆菌SZ‑4由本实验室从人参根际土壤中分离筛选后鉴定获取，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.8273。

[0135] 供试三年生人参：

[0136] 由吉林参王植保公司种苗繁育基地提供，经吉林农业大学中药材学院杨利民教授鉴定为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Meyer)。

[0137] 人参单体皂苷11种标准品(购自西安神农科技有限公司，纯度＞99.80％)，甲醇、乙腈(色谱纯)、其他试剂均为分析纯。

[0138] 实验采用盆栽设计于2019年4‑9月在吉林农业大学药用植物栽培基地大棚内进行。供试土壤为抚松地区老参地土壤，基本性质如下：有机碳94.56mg/kg、碱解氮43.87mg/kg、有效磷28.97mg/kg、速效钾330.07mg/kg、pH为5.95、EC为244.51μs/cm。

[0139] 采用上述制备的生物炭基肥进行土壤改良：GTH4为上述实施例3中最优条件下获得的生物质炭基‑生防菌的耦合系统；CK不添加生物炭基肥。

[0140] 控制每盆老参地土壤质量均为3kg，分别按2％的添加量加入土壤中混匀，置于花盆中(内口径15cm)。为使花盆内土壤温度接近自然，将花盆深埋在土地中，仅上沿露出地面，每个处理设置4个平行，定期田间管理。于2019年9月分别取出土壤及人参，测定相关指标。

[0141] 生物指标：

[0142] 人参样品取回后用清水冲洗干净，滤纸吸干水分使用游标卡尺量取人参根长、根粗并称取人参根鲜重。将鲜样置于烘箱中低温烘干至恒重后，测定人参样品根干重。人参须根根系特征参数用根系扫描仪测定，使用软件根系分析软件winRHIZO对数据进行分析。

[0143] 标准溶液的配制：

[0144] 称取11种单体人参皂苷标准品，加入甲醇制成每毫升含Rg1、Rg3、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rh2、Ro分别为0.0375mg、0.75mg、0.15mg、0.3mg、0.6mg的对照品混合溶液，过孔径0.22μm膜后放置于4℃冰箱中保存。

[0145] 色谱条件：

[0146] 试验采用色谱柱为依利特Hypersil ODS2(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长为‑1203nm，进样体积10uL，流速1.0mL·min ，柱温(25.00±0.15)℃，洗脱程序见表6。

[0147] 表6HPLC梯度洗脱程序

[0148]

[0149] 注：A为超纯水，B为乙腈。Note:A is ultrapure water and B is acetonitrile.[0150] 标准曲线的绘制：

[0151] 吸取对照品溶液10μL按上述色谱条件进样，以所测得人参皂苷的峰面积为纵坐标(y)，对照品溶液质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，建立回归方程，结果见表7。

[0152] 表7 11种有效成分回归方程

[0153]

[0154] 供试样品含量测定：低温烘干人参样品粉碎过筛，精密称取人参粉末1.000g于锥形瓶中，加入30mL甲醇，超声波提取30min，重复操作3次后，合并滤液，将滤液置于蒸发皿中水浴挥干定容至5mL容量瓶中，过孔径0.22μm膜后得到人参皂苷待测溶液。按上述色谱条件进样测定人参样品中各单体皂苷含量，总皂苷含量为各单体皂苷含量之和。

[0155] (1)生物炭基肥对老参地的修复效果分析

[0156] 将三年生人参移栽在老参地土壤中重茬种植，以人参生长量反应生物炭基肥对老参地土壤的改良效果，结果如表8所示。由表可见，生物炭基肥处理有助于人参产量增加，其处理下人参鲜重、干重分别增加了5.51％、14.53％。

[0157] 表8炭基菌肥处理对人参产量的影响

[0158]

[0159] (2)生物炭基肥对三年生人参根系生长的影响

[0160] 根是人参的入药部位，也是药农最关心的经济产量形成部位，不仅重量，根部的外形也是评价人参生药等级的重要内容。通过根系扫描仪分析三年生人参根部形态指标，结果如图7、表9。由表可见，GTH4处理总根长、根面积、根尖数3个指标均显著高于对照；表明上述处理中人参产量增加与根面积增加有关，而处理下人参根体积、面积的增加主要源于主根长度和根尖数增加，提示生物炭基肥可能通过促进根系纵向伸长提升人参产量。

[0161] 表9不同处理对人参根系的影响

[0162]

[0163] (3)生物炭基产品对重茬人参质量的影响

[0164] 分析炭基肥改良老参地上三年生栽培人参品质变化，结果如表10所示。由图7可见，施用生物炭基肥有利于人参皂苷的积累，各项含量指标均表现为炭基肥处理大于对照，其中增长幅度最大的指标是Rb1(206.32％)、总皂苷(71.06％)、PPD(70.09％)。综合上述分析可见，炭基肥处理有利于二醇型皂苷类物质的含量积累。

[0165] 表10不同炭基肥处理对人参质量的影响

[0166]

[0167] 结论：

[0168] (1)施入生物炭基菌肥后，重茬人参的生长及皂苷含量的积累均不同程度的得到了改善，人参根系的生长更为发达，其根体积、面积的增加主要源于主根长度和根尖数增加，提示生物炭基肥可能通过促进根系纵向伸长提升人参产量。

[0169] (2)生物质炭基肥处理下总皂苷含量较CK分别平均增加了71.06％，生物质炭基肥有利于PPD型人参皂苷的积累。

[0170] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。