蛋白质ZMCPK6及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了蛋白质ZMCPK6及其编码基因与应用。蛋白质ZMCPK6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。向玉米自交系B73中导入ZMCPK6基因，得到转ZMCPK6基因玉米。实验证明，与玉米自交系B73相比，转ZMCPK6基因玉米的抗旱性降低。由此可见，蛋白质ZMCPK6可以调控玉米的抗旱性，本发明具有重要的应用价值。

权利要求

1.蛋白质ZMCPK6的应用，为K1）或K2）或K3）：K1）降低植物抗旱性；

K2）培育抗旱性降低的转基因植物；

K3）培育旱敏感植物；

所述植物为单子叶植物；

蛋白质ZMCPK6为（a1）或（a2）：（a1）SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质ZMCPK6的核酸分子的应用，为K1）或K2）或K3）：K1）降低植物抗旱性；

K2）培育抗旱性降低的转基因植物；

K3）培育旱敏感植物；

所述植物为单子叶植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下（b1）或（b2）或（b3）的DNA分子：（b1）编码区如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

（b2）核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

（b3）核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3中所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌的应用，为K1）或K2）或K3）：K1）降低植物抗旱性；

K2）培育抗旱性降低的转基因植物；

K3）培育旱敏感植物；

所述植物为单子叶植物。

5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质ZMCPK6的含量，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因植物的抗旱性降低；所述植物为单子叶植物。

6.一种培育旱敏感植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质ZMCPK6的含量，得到旱敏感植物；

所述植物为单子叶植物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质ZMCPK6的含量通过将编码权利要求1中所述蛋白质ZMCPK6的核酸分子导入受体植物实现。

8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1中所述蛋白质ZMCPK6的含量，从而使植物抗旱性降低；

所述植物为单子叶植物。

9.一种旱敏感植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1中所述蛋白质ZMCPK6的含量，从而使植物旱敏感；

所述植物为单子叶植物。

说明书

蛋白质ZMCPK6及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZMCPK6及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 在地球人口基数激增的前提下，原生态的地球资源日渐紧缺，水资源更是制约关键因素，由此引发的一系列缺水矛盾逐步尖锐。从农业角度来看，水分短缺将直接导致农作物产量降低，以农作物为来源的粮食加工、畜牧业等产业链会面临严重的挑战。因此，提高植物的抗旱性能是迫在眉睫的任务。长期以来，前仆后继的科研工作者致力于采用各种生物学手段改良植物的抗逆性能，其中传统的育种方式需要对优良性状进行鉴别和组合，准确性和效率决定了育种的成败，尽管生物安全性和稳定性高，但育种周期长，结果具有不可预测性。近年来风生水起的分子育种具有明显的优势，主要包括效率高、针对性强、周期短、可预见性强。通过基因工程的手段改良农作物将为快速解决环境胁迫导致的粮食短缺提供新契机。

[0003] 玉米作为世界三大粮食作物之一，其产量直接影响到各个相应产业链，逆境胁迫对于玉米的产量影响巨大，因此通过基因工程手段，尽可能多得挖掘抗旱基因对于将来提高玉米抗旱性以及减弱逆境对于产量的影响具有重要战略意义。目前，玉米自交系B73基因组测序已经完成，玉米的遗传转化技术和基因编辑技术也趋于成熟，为通过基因工程手段进行遗传改良提供了重要保障。

发明内容

[0004] 本发明的目的是调控玉米的抗旱性。

[0005] 本发明首先保护蛋白质ZMCPK6，可为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

[0006] (a1)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

[0007] (a2)将SEQ ID NO:1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；

[0008] (a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

[0009] (a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。

[0010] 标签具体如表1所示。

[0011] 表1标签的序列

[0012]

[0013]

[0014] 编码所述蛋白质ZMCPK6的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0015] 具体来说，编码所述蛋白质ZMCPK6的核酸分子可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的DNA分子：

[0016] (b1)编码区如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

[0017] (b2)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

[0018] (b3)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

[0019] (b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质ZMCPK6的DNA分子；

[0020] (b5)来源于玉米且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质ZMCPK6的DNA分子。

[0021] 所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

[0022] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0023] 其中，SEQ ID NO:2由1876个核苷酸组成，SEQ ID NO:3由558个核苷酸组成，SEQ ID NO:3所示的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

[0024] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ZMCPK6的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ZMCPK6的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ZMCPK6，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0025] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的所述蛋白质ZMCPK6的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0026] 含有上述任一所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0027] 构建重组载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物。

[0028] 所述重组载体具体可为将上述任一所述核酸分子插入植物表达载体的多克隆位点，得到的重组质粒。

[0029] 所述植物表达载体具体可为pBCXUN载体。

[0030] 所述重组菌具体可为将所述重组载体导入出发菌，得到的重组菌。所述出发菌可为农杆菌或大肠杆菌。

[0031] 本发明还保护上述任一所述蛋白质ZMCPK6的应用，可为K1)或K2)或K3)：

[0032] K1)调控植物抗旱性；

[0033] K2)培育抗旱性改变的转基因植物；

[0034] K3)培育旱敏感植物。

[0035] 本发明还保护上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌的应用，可为K1)或K2)或K3)：

[0036] K1)调控植物抗旱性；

[0037] K2)培育抗旱性改变的转基因植物；

[0038] K3)培育旱敏感植物。

[0039] 上述任一所述的应用中，所述调控植物抗旱性可为降低植物抗旱性或提高植物抗旱性。

[0040] 上述任一所述的应用中，所述调控为负调控，即过表达蛋白质ZMCPK6降低植物的抗旱性。

[0041] 上述任一所述的应用中，所述培育抗旱性改变的转基因植物可为培育抗旱性降低的转基因植物或培育抗旱性提高的转基因植物。

[0042] 本发明还保护S1)、S2)或S3)。

[0043] S1)培育转基因植物甲的方法一，包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性，得到转基因植物甲；与受体植物相比，转基因植物甲的抗旱性降低。所述转基因植物甲可为植物旱敏感突变体。

[0044] S2)培育旱敏感植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性，得到旱敏感植物。

[0045] S3)培育转基因植物乙的方法二，包括如下步骤：抑制受体植物中上述任一所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性，得到转基因植物乙；与受体植物相比，转基因植物乙的抗旱性提高。

[0046] 上述方法中，所述提高受体植物中所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性通过将编码上述任一所述蛋白质ZMCPK6的核酸分子导入受体植物实现。

[0047] 本发明还保护T1)、T2)或T3)。

[0048] T1)植物育种方法一，包括如下步骤：增加目的植物中上述任一所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性，从而使植物抗旱性降低。

[0049] T2)旱敏感植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中上述任一所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性，从而使植物旱敏感。

[0050] T3)植物育种方法二，包括如下步骤：降低目的植物中上述任一所述蛋白质ZMCPK6的含量和/或活性，从而使植物抗旱性增高。

[0051] 上述任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

[0052] 所述植物为禾本科植物。

[0053] 所述植物为玉蜀黍属植物。

[0054] 所述植物为玉米。

[0055] 所述植物为玉米自交系B73。

[0056] 由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，SEQ ID NO:2产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本发明的保护范围内。

[0057] ZMCPK6基因的转录本不止一个，其它形式的转录本相应的cDNA过表达后也可能抗干旱胁迫，均属于本发明保护的范围。

[0058] 向玉米自交系B73中导入ZMCPK6基因，得到转ZMCPK6基因玉米。实验证明，与玉米自交系B73相比，转ZMCPK6基因玉米的抗旱性降低，抗旱性降低表现为存活率降低和株高降低。由此可见，蛋白质ZMCPK6可以调控玉米的抗旱性，本发明具有重要的应用价值。

具体实施方式

[0059] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0060] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0061] 实施例1、蛋白质ZMCPK6及其编码基因的发现

[0062] 本发明的发明人经过大量实验，从玉米自交系B73(以下简称玉米B73)中发现了ZMCPK6基因。

[0063] 玉米B73的基因组DNA中，ZMCPK6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0064] 玉米B73的cDNA中，ZMCPK6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0065] ZMCPK6基因编码蛋白质ZMCPK6。蛋白质ZMCPK6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0066] 实施例2、转基因植物的获得和抗旱性鉴定

[0067] 一、重组质粒pBCXUN‑ZMCPK6的构建

[0068] 将SEQ ID NO:3所示的DNA分子插入pBCXUN载体中，得到重组质粒pBCXUN‑ZMCPK6。重组质粒pBCXUN‑ZMCPK6中，SEQ ID NO:3所示的DNA分子由Ubi启动子启动并由Nos终止子终止，从而表达蛋白质ZMCPK6。

[0069] pBCXUN载体是将pCXUN载体(GenBank:FJ905215.1，06‑JUL‑2009)的HYG基因(hptII，潮霉素抗性基因)替换为Bar基因(编码膦丝菌素乙酰转移酶)(GenBank:MG719235.1中的第284‑835位核苷酸，02‑OCT‑2018)，保持pCXUN的其它核苷酸不变得到的表达载体。

[0070] 二、ZMCPK6基因过表达植物的获得

[0071] 1、将重组质粒pBCXUN‑ZMCPK6导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

[0072] 2、采用步骤1制备的重组农杆菌对玉米B73的胚性愈伤组织进行侵染，然后依次进行共培养、抗性筛选(抗性筛选采用除草剂草丁膦)、然后依次进行预分化、分化、生根，得到T0代再生植株。

[0073] 3、T0代再生植株进行PCR鉴定，筛选获得转基因植株；将T0代转基因植株自交，得到的种子即为T1代种子，T1代种子长成的植株即为T1代植株；将T1代植株自交，得到的种子即为T2代种子，T2代种子长成的植株即为T2代植株；将T2代植株自交，得到的种子即为T3代种子，T3代种子长成的植株即为T3代植株。

[0074] 4、将T1代植株以及抽样的T2代植株进行PCR鉴定。对于某一T1代植株，如果该植株以及该植株自交得到的T2代植株均为转基因植株，该植株的自交后代为纯合的转基因株系。

[0075] 步骤3和步骤4中PCR鉴定的方法如下：提取植株叶片的基因组DNA，采用UbiP‑seq(对应于Ubi启动子中)和NosR‑seq(对应于Nos终止子中)组成的引物对进行PCR扩增，如果得到特异性扩增产物，该植株为转基因植株。

[0076] UbiP‑seq:TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC

[0077] NosR‑seq:AGACCGGCAACAGGATTCAATC。

[0078] 三、ZMCPK6基因过表达植物的抗旱性鉴定

[0079] 供试种子：纯合的转基因株系OE1的T3代种子、纯合的转基因株系OE5的T3代种子或玉米B73的种子。

[0080] 1、将供试种子分别播种于装有营养土的小盆中，25℃培养7天。

[0081] 2、完成步骤1后，将长势一致的幼苗移栽到装有2500g营养土的长方形大盆中，每个盆中，一半区域种植15株转基因植株，另一半区域种植15株玉米B73植株，正常浇水并培养7天。设置三次重复试验，每次重复试验5盆。

[0082] 3、完成步骤2后，持续不浇水20天，此时可以观察到转基因植株和玉米B73植株表型差异明显，具体的，与玉米B73相比，OE1株系的株高显著降低(约为玉米B73的4/5)，OE1株系的株高显著降低(约为玉米B73的7/10)。

[0083] 4、完成步骤3后，恢复正常浇水并培养7天，然后统计存活率。

[0084] 存活率即存活植株占总植株数量的百分比。

[0085] OE1株系植株的存活率为31％±2％，OE2株系植株的存活率为29±3％。玉米B73植株的存活率为46％±3％。

[0086] 由此可见，过表达蛋白质ZMCPK6可以降低玉米的抗旱性。

[0087] CDPK是一类集钙离子感知与传递于一体的蛋白家族，除含有钙离子结合结构域之外，还含有激酶域用于磷酸化下游底物从而快速传递信号。CDPK蛋白家族在植物中非常保守，在模式植物拟南芥中有34个成员，其中多个成员被报道在植物抗旱、抗盐、抗冷等响应逆境的过程中发挥关键作用，该家族成员的突变体和过表达株系多具有逆境响应表型，进一步说明了该家族蛋白的重要性。在玉米中，CDPK蛋白家族共40个成员，而对于其机理研究甚少。基于CDPK蛋白家族的研究现状，过表达某一基因引起性状，则抑制该基因一般会引起相反的性状。因此，基于上述实验结果，推测抑制蛋白质ZMCPK6表达可以提高玉米的抗旱性。

[0088] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。