靶向CD5的CAR-γ δ T细胞及其制备方法与应用

摘要

本发明提供了一种靶向CD5的CAR‑γδT细胞及其制备方法与应用。本发明首先提供一种靶向CD5的CAR‑γδT细胞制品，其中γδT细胞中功能性受体的表达比例为：CD16大于40%，NKp30大于40%，NKp44大于50%；CXCR4大于40%，CCR7大于35%，CXCR5大于50%，以及CXCR3大于55%。本发明还提供了制备靶向CD5的CAR‑γδT细胞的方法，包括在培养中添加AB血清、白介素‑2、白介素‑15、TGF‑β以及唑来膦酸。本发明的靶向CD5的CAR‑γδT细胞表达多种NK活化性受体以及趋化性受体，在体内表现出良好的迁移活性，可用于下游科学研究和临床转化。

权利要求

1.一种制备靶向CD5的CAR‑γδT细胞的方法，其特征在于，该方法包括：以完全培养基对外周血PBMC进行培养并感染表达靶向CD5的CAR的慢病毒，继续培养，在感染表达靶向CD5的CAR的慢病毒后的第3 7天，向培养体系中加入灭活的aAPC细胞，然后~再继续培养至收获细胞；

其中，所述完全培养基由基础培养基与添加因子组成，所述基础培养基选自无血清的RPMI1640、DMEM、α‑MEM、X‑VIVO15、AIM‑V培养基中的一种或多种，所述添加因子为AB血清、白介素‑2、白介素‑15、TGF‑β以及唑来膦酸；添加因子在完全培养基中的含量为：AB血清体积含量为5% 10%，白介素‑2为100 1000IU/mL，白介素‑15为5 50ng/mL，TGF‑β为1 20ng/mL，~ ~ ~ ~唑来膦酸为0.1 10μM；

~

其中，aAPC细胞的添加量为按照培养体系中T细胞﹕aAPC细胞的数量为1﹕2 10的比例加~入；所述aAPC细胞为过表达膜结合型IL‑21、CD86、CD83和CD137L的K562细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括：

6 6

将PBMC用完全培养基将细胞密度调整至按1×10 5×10 /mL接种于0.1 40μg/mL ~ ~Retronetic预包被的培养容器中进行培养；

培养过程中每2 3天进行半量换液或补加完全培养基；

~

6 6

培养至第5 7天，收获细胞，将细胞密度调整至1×10 5×10 /mL，感染表达靶向CD5的~ ~CAR的慢病毒，继续在完全培养基中进行培养；

在感染后的第3天，按照T细胞﹕aAPC细胞=1﹕2 10的比例加入灭活的aAPC细胞进行继续~培养；继续培养过程中，每2 3天向培养体系中补充新鲜的完全培养基，每5 7天向培养体系~ ~中按照T细胞﹕aAPC细胞=1﹕2 10的比例加入灭活的aAPC细胞；

~

培养21 25天收获细胞；或者，以初始当细胞为基数，当扩增倍数大于300倍或者CAR阳~性的γδT细胞纯度大于10%时收获细胞。

3.权利要求1或2所述方法在制备用于抗肿瘤细胞的治疗产品中的应用。

4.权利要求1或2所述方法在制备用于外周γδT细胞免疫功能的评估研究和/或基因修饰性γδT细胞抗肿瘤机制的研究的试剂中的应用。

5.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

制备靶向CD5的CAR‑γδT细胞的试剂组合物，所述试剂组合物包括完全培养基组合物以及aAPC细胞；其中所述完全培养基组合物由基础培养基与添加因子组成，所述基础培养基选自无血清的RPMI1640、DMEM、α‑MEM、X‑VIVO15、AIM‑V培养基中的一种或多种，所述添加因子为AB血清、白介素‑2、白介素‑15、TGF‑β以及唑来膦酸，添加因子在完全培养基中的含量为：AB血清体积含量为5% 10%，白介素‑2为100 1000IU/mL，白介素‑15为5 50ng/mL，TGF‑~ ~ ~β为1 20ng/mL，唑来膦酸为0.1 10μM；所述aAPC细胞为过表达膜结合型IL‑21、CD86、CD83和~ ~CD137L的K562细胞。

说明书

靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明是关于一种免分选的以γ δ T细胞为主要成份的靶向CD5的嵌合抗原受体T细胞制备技术及应用。

背景技术

[0002] 嵌合抗原受体修饰性T细胞（CAR‑T）是一类经过基因修饰的具有靶向识别肿瘤特异性抗原的基因工程T细胞制剂。CAR‑T一方面可以依赖CAR受体特异性的识别肿瘤细胞，另一方面可以通过MHC非依赖途径对肿瘤细胞进行杀伤，具有高效的靶向抗肿瘤活性。目前已经证实，CD19特异性CAR‑T对多种难治/复发的B细胞恶性肿瘤治疗具有良好的临床疗效，治疗后的完全缓解率接近90%，为血液肿瘤的治疗提供了全新的解决思路。因此，研究人员也在尝试将CAR‑T制剂用于治疗包括T细胞恶性肿瘤在内的其他血液肿瘤和实体肿瘤的治疗。

[0003] 在T细胞恶性肿瘤中，大约80%表达CD5，因此，CD5目前是开发T细胞恶性肿瘤新型治疗方法/药物的潜在靶点。但是既往的CAR‑T制剂中的效应成分主要为α β T细胞。虽然已有研究显示靶向CD5的自体CAR‑α β T可以有效杀伤肿瘤细胞，延长荷瘤小鼠的生存期，同时其临床安全性也得到了初步的验证。但是在临床治疗中，相当一部分患者由于疾病状况和身体原因，无法使用自体细胞进行CAR‑T的制备；而在使用异体来源的CD5特异性CAR‑α β T进行治疗时，输注后产生的移植物抗宿主病（GVHD）发生比例较高，对患者有较大的安全风险，限制了传统的CAR‑α β T细胞的在治疗T细胞恶性肿瘤中的临床应用。因此，需要开发更为安全有效的CAR‑T制剂。

[0004] γ δ T细胞是存在于外周中的一类T细胞亚群，占循环T细胞的1% 5%。与α β T细~胞不同，表达Vγ9Vδ2的γ δ T细胞一方面可以通过识别肿瘤细胞产生的内源性异戊烯焦磷酸（IPP）进行增殖，另一方面γ δ T细胞还可以通过MHC非依赖性途径杀伤肿瘤细胞。目前已经证实γ δ T细胞对多种肿瘤细胞系具有显著的杀伤作用。此外，与α β T细胞相比，γ δ T在进行异体回输时引发GVHD的风险极低，在进行异体细胞免疫治疗时，具有更好的临床安全性和适用性。因此，γ δ T细胞在抗肿瘤细胞免疫治疗领域具有巨大的临床转化潜力。

[0005] 然而，由于内源性γ δ T细胞在总淋巴细胞中占比较低，因此如何在体外进行大规模制备获得足够数量的效应细胞是该领域长期以来面临的主要技术难题。目前常用的方法是将外周血中的γ δ T细胞利用分选技术进行富集，再进行体外的培养。上述工艺一方面耗时长，另一方面制备成本较高，制约了该技术的临床转化和商业化推广。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的在于提供一种高纯度的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种制备靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞的方法。

[0008] 本发明的另一目的在于提供所述靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞的应用。

[0009] 一方面，本发明提供了一种靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞（CD5CAR‑γ δ T），具体而言，其是一种高纯度的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品。

[0010] 本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品，其中γ δ T细胞中功能性受体的表达比例为：CD16大于40%，NKp30大于40%，NKp44大于50%；CXCR4大于40%，CCR7大于35%，CXCR5大于50%，以及CXCR3大于55%。

[0011] 根据本发明的具体实施方案，本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品，其中γ δ T细胞占比80%以上。

[0012] 根据本发明的具体实施方案，本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品中，γ δ T细胞中CAR在55%以上。

[0013] 根据本发明的具体实施方案，本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品中，其中γ δ T细胞中功能性受体的表达比例为：CD16大于60%，NKp30大于60%，NKp44大于60%；CXCR4大于60%，CCR7大于44%，CXCR5大于80%，以及CXCR3大于80%。

[0014] 根据本发明的具体实施方案，本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品中，其中γ δ T细胞中功能性受体的表达比例为：CD16大于80%，NKp30大于75%，NKp44大于65%；CXCR4大于60%，CCR7大于44%，CXCR5大于85%，以及CXCR3大于85%。

[0015] 另一方面，本发明还提供了一种制备靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞的方法，该方法包括：

[0016] 以完全培养基对外周血PBMC进行培养并感染表达靶向CD5的CAR的慢病毒，继续培养至收获细胞（即所述靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞）。

[0017] 根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞的方法中，所述完全培养基的组成包括基础培养基与添加因子。其中，所述基础培养基选自无血清的RPMI1640、DMEM、α‑MEM、X‑VIVO15、AIM‑V培养基中的一种或多种。所述添加因子包括AB血清、白介素‑2、白介素‑15、TGF‑β以及唑来膦酸（Zoledronic acid，ZA）。优选地，添加因子在完全培养基中的含量为：AB血清体积含量为5% 10%，白介素‑2为100 1000IU/mL，白介素‑~ ~15为5 50ng/mL，TGF‑β为1 20ng/mL，唑来膦酸为0.1 10μM。
~ ~ ~

[0018] 根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞的方法中，在感染表达靶向CD5的CAR的慢病毒后的第3 7天，向培养体系中加入灭活的aAPC细~胞，然后再继续培养至收获细胞。优选地，aAPC细胞的添加量为按照培养体系中T细胞﹕aAPC细胞的数量为1﹕2 10的比例加入。
~

[0019] 根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞的方法包括：

[0020] 将PBMC用完全培养基将细胞密度调整至按1×106 5×106/mL接种于0.1 40μg/mL ~ ~Retronetic预包被的培养容器中进行培养；

[0021] 培养过程中每2 3天进行半量换液或补加完全培养基；

[0022] 培养至第5 7天~，收获细胞，将细胞密度调整至1×106 5×106/mL，感染表达靶向~ ~CD5的CAR的慢病毒，继续在完全培养基中进行培养；

[0023] 在感染后的第2 3天，按照T细胞﹕aAPC细胞=1﹕2 10的比例加入灭活的aAPC细胞进~ ~行继续培养；继续培养过程中，每2 3天向培养体系中补充新鲜的完全培养基，每5 7天向培~ ~
养体系中按照T细胞﹕aAPC细胞=1﹕2 10的比例加入灭活的aAPC细胞；
~

[0024] 培养21 25天后收获细胞；或者，以初始当细胞为基数，当扩增倍数大于300倍或者~CAR阳性的γ δ T细胞纯度大于10%时收获细胞。

[0025] 另一方面，本发明还提供了所述的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞（所述的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品，或根据本发明所述方法制备得到的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞）在制备用于抗肿瘤细胞的治疗产品中的应用。

[0026] 根据本发明的具体实施方案，本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞，可用于杀伤CD5阳性的T细胞肿瘤，包括人急性T淋巴细胞白血病细胞、人T细胞淋巴瘤细胞等。

[0027] 另一方面，本发明还提供了所述的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞（所述的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞制品，或根据本发明所述方法制备得到的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞）在制备用于外周γ δ T细胞免疫功能的评估研究和/或基因修饰性γ δ T细胞抗肿瘤机制的研究的试剂中的应用。

[0028] 本发明的具体实验结果表明，本发明的制备方法获得的靶向CD5的CAR‑γ δ T（CD5CAR‑γ δ T）具有良好的肿瘤细胞杀伤活性；在杀伤过程中具有更强的细胞因子释放能力；并且，本发明的CD5CAR‑γ δ T不仅可以杀伤CD5+的肿瘤细胞，同时可以有效的杀伤CD5‑的肿瘤细胞，比传统的CD5CAR‑α β T具有更好的抗肿瘤活性。体内抗肿瘤活性实验表明，本发明的CD5CAR‑γ δ T具有比使用常规CD3/CD28活化方法制备的CD5CAR‑α β T更好的体内抗肿瘤活性。体内归巢能力的评估实验表明，本发明的CD5CAR‑γ δ T比传统的CAR‑α β T具有更好的骨髓迁移能力。本发明的CD5CAR‑γ δ T不仅具有更好的抗肿瘤活性，同时可以诱导效应细胞表达更高水平的趋化性受体，使其具有更好的体内迁移活性。

[0029] 综上所述，本发明提供了一种免分选的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞及其制备方法，可在无需分选的情况下，可获得足够数量的高纯度的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞，本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞表达多种NK活化性受体以及趋化性受体，在体内表现出更好的迁移活性，可用于下游的科学研究和临床转化。

附图说明

[0030] 图1显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞培养过程中进行连续细胞计数的实验结果。

[0031] 图2显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞产品中γ δ T分析实验结果。

[0032] 图3显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞产品中CAR分析实验结果。

[0033] 图4显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞功能性受体表达水平分析实验结果。

[0034] 图5显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T的肿瘤细胞杀伤活性实验结果。

[0035] 图6显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T杀伤相关细胞因子释放水平检测实验结果。

[0036] 图7显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T在不同效靶比下对CD5阴性肿瘤细胞的杀伤活性的实验结果。

[0037] 图8显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T对CD5单克隆抗体封闭靶细胞前后的杀伤活性的实验结果。

[0038] 图9显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T体内抗肿瘤活性的成像数据。

[0039] 图10显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T体内抗肿瘤活性的生存曲线分析实验结果。

[0040] 图11显示接受本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞治疗的小鼠体内的抗肿瘤相关细胞因子的表达水平测试结果。

[0041] 图12显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T体内归巢能力的评估实验结果。

[0042] 图13显示本发明的靶向CD5的CAR‑γ δ T诱导效应细胞表达趋化性受体的实验结果。

具体实施方式

[0043] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

[0044] 除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。

[0045] 实施例1. 培养基的配制及靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞（CD5CAR‑γ δ T）的制备[0046] 1）完全培养基的配制

[0047] 本实施例中使用的完全培养基，是以商品化的无血清基础培养基，包括但不限于X‑VIVO15为基础，按照表1所示各实验分组，分别加入10%体积比的人AB血清、200IU/mL重组人白介素‑2（rhIL‑2）、30ng/mL重组人白介素‑15（rhIL‑15）、5ng/mL重组人TGF‑β（rhTGF‑β）、4μM唑来膦酸（Zoledronic acid，ZA）中的一种或多种，配制获得完全培养基。

[0048] 另外，实验组1、实验组3、实验组5、实验组7在培养过程中分别添加灭活的人工抗原细胞系（Artificial antigen‑presenting cell，aAPC）。aAPC细胞系为过表达膜结合型IL‑21、CD86、CD83和CD137L的K562细胞系。具体地，该aAPC细胞系可使用人髓系白血病K562细胞系（购自武汉普洛赛生物技术有限公司）利用慢病毒感染使其表达膜结合型重组人IL‑21、CD86、CD83以及CD137L四种分子即可制备得到。

[0049] 表1. 不同实验组及对照组使用的完全培养基组分及培养方法

[0050]

[0051] 注：+代表添加该组分，‑代表未添加该组分。

[0052] 2）靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞（CD5CAR‑γ δ T）的制备

[0053] 采集健康受试者外周血30mL，将外周血缓慢铺于人淋巴细胞分离液上层，保持分层界面清晰。使用荡平式离心机在转速800g、离心温度25℃、升速为0、降速为0的条件下离心15分钟，分离新鲜外周血中的PBMC。离心后小心吸取中间的白膜层，并补充PBS至30mL，使用荡平式离心机在转速1500rpm、离心温度25℃、升速9、降速9的条件下离心10分钟。弃去PBS，用完全培养基重悬计数（相关技术文献：CN108017717A；CN110358734A；Clinical Cancer Research，2019，25 (18)：5595‑5607）。计数后将PBMC用完全培养基将细胞密度调6
整至按3×10/mL接种于1μg/mL Retronetic预包被的培养容器中，在37℃、5%CO2、饱和湿度环境中培养。根据细胞生长情况，每2 3天进行半量换液或补加完全培养基。根据细胞的生~ 6
长状态，培养至第7天，收获细胞并计数，根据计数结果将细胞密度调整至5×10/mL，感染表达靶向CD5的CD5CAR的慢病毒（慢病毒参考Clinical Cancer Research，2019，25 (18)：
5595‑5607及Front Immunol，2020，23 (11)：581116的技术方法进行制备）。在感染后的第3天，即培养的第10天，按照T细胞﹕aAPC细胞=1﹕5的比例加入辐照灭活的aAPC细胞进行继续培养。每2 3天向培养体系中补充等体积的新鲜的完全培养基，每7天向培养体系中按照T细~
胞﹕aAPC细胞=1﹕5的比例加入辐照灭活的aAPC细胞（后续添加的细胞绝对数是参考T细胞数添加，不包括之前已添加的aAPC细胞）。培养21 25天后收获细胞（收获细胞的具体方法参考~
技术文献：Clinical Cancer Research，2019，25 (18)：5595‑5607及Front Immunol，2020，
23 (11)：581116）。

[0054] 各实验组培养过程中γ δ T细胞计数参见图1所示。

[0055] 利用流式分析方法检测不同实验组的终产品细胞亚群，检测结果参见图2和图3所示。结果表明，实验组1和实验组2的培养方法获得的CD5CAR‑T中，γ δ T细胞的比例可达到80%以上，显著高于其他实验组培养获得的终产品。详细数据请参见下表2。

[0056] 表2. 终产品中γ δ T细胞纯度及γ δ T细胞中CAR阳性比例（平均值±标准差）[0057]

[0058] 通过培养过程中进行连续细胞计数以及对终产品计数分析的结果表明，本发明的添加AB血清、白介素‑2、白介素‑15、TGF‑β以及唑来膦酸的完全培养基可显著提高γ δ T细胞的体外增殖能力，并且，添加aAPC的培养方法获得的γ δ T细胞数可进一步显著提高。

[0059] 上述结果表明，本发明的制备方法可以有效地诱导γ δ T细胞的体外扩增，获得高纯度的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞。

[0060] 实施例2. γ δ T细胞相关功能受体的表达

[0061] 利用流式分析检测技术对不同实验组获得的终产品的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞功能性受体表达水平进行分析，结果参见图4所示。结果显示，实验组1培养制备的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞除了高表达CD3、γ δ TCR受体外，还表达更高水平的CD16、NKp30、NKp44受体，这些受体与γ δ T细胞体内的抗肿瘤活性具有正相关性，提示使用本发明的培养方法制备的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞可能具有更好的抗肿瘤活性。详细数据请参见下表3。

[0062] 表3. 靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞功能受体的表达水平（平均值±标准差）[0063]

[0064] 实施例3. 靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞杀伤活性的评估

[0065] 使用CD5阳性的人急性T淋巴细胞白血病CCRF‑CEM细胞系（购自武汉普诺赛生物技术有限公司）对靶向CD5的CAR‑γ δ T体外杀伤能力进行评估。通过LDH释放法进行评估（相关技术文献：CN108017717A；CN110358734A；Clinical Cancer Research，2019，25 (18)：5595‑5607），结果参见图5所示。

[0066] 结果显示，在效应细胞与靶细胞按照不同效靶比分组，进行12小时共培养后，各实验组培养的CD5CAR‑γ δ T对靶细胞的杀伤效率随着效靶比的升高而增强；而使用实验组1培养方法获得的CD5CAR‑γ δ T细胞在相同效靶比例的条件下，对靶细胞的杀伤显著优于其他实验组（表4）。

[0067] 进一步地，通过向共培养体系中反复加入肿瘤细胞检测不同实验组获得的CD5CAR‑γ δ T在体外的连续杀伤的实验结果显示，利用实验组1的培养方法获得的CD5CAR‑γ δ T细胞在体外具有更好的连续杀伤活性。详细数据参见下表4。

[0068] 表4. 不同实验组终产品体外杀伤活性评估（平均值±标准差）

[0069]

[0070] 上述结果表明，使用本发明的制备方法获得的靶向CD5的CAR‑γ δ T在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤活性。

[0071] 实施例4. 杀伤相关细胞因子释放水平检测

[0072] 按照公开技术资料描述的方法（CN108017717A；CN110358734A；Clinical Cancer Research，2019，25 (18)：5595‑5607），利用ELISA方法对共培养杀伤体系中杀伤相关因子的水平进行了检测。结果参见图6所示。

[0073] 检测结果显示，在效靶比为1：1，共培养12小时的条件下，实验组1培养制备的靶向CD5的CAR‑γ δ T在杀伤靶细胞过程中杀伤相关因子，包括IL‑2、IFN‑γ、TNF‑α、GM‑CSF的释放水平显著高于其他实验组，说明本发明的制备方法获得的靶向CD5的CAR‑γ δ T在体外杀伤过程中可以释放更高水平的促炎性因子，提示具有更好的抗肿瘤活性。

[0074] 实施例5. CAR‑γ δ T对CD5阴性肿瘤细胞的杀伤活性

[0075] 本实施例进一步评价了本发明制备的靶向CD5的CAR‑γ δ T细胞对CD5阴性（CD5‑）肿瘤细胞的杀伤活性。首先，使用人B细胞淋巴瘤细胞系Raji作为靶细胞，LHD释放法对比了CD5CAR‑γ δ T（实验组1所制备得到的产品）与CD5CAR‑α β T的杀伤活性。CD5CAR‑α β T的制备参考采用已公开的技术资料（CN108017717A；CN110358734A；Clinical Cancer Research，2019，25 (18)：5595‑5607）进行。实验结果参见图7，结果显示，在效靶比为1：1~8：1范围内，CD5CAR‑α β T对CD5‑的Raji肿瘤细胞系几乎没有杀伤活性，而CD5CAR‑γ δ T表现出良好的杀伤活性。

[0076] 另一方面，使用CD5+的人T急性淋巴细胞白血病细胞系CCRF‑CEM作为靶细胞，在杀伤前使用1μg/mL小鼠抗人CD5单克隆抗体（北京义翘神州生物科技有限公司）封闭靶细胞表面的CD5受体，之后按照效靶比1：1将CD5CAR‑γ δ T（实验组1所制备得到的产品）与CD5CAR‑α β T分别与预处理的靶细胞进行共培养，12小时后利用LDH释放法检测杀伤活性。实验结果参见图8（图中mAb+代表使用抗体封闭处理，mAb‑代表未用抗体封闭处理）。结果显示，使用单克隆抗体封闭后，CD5CAR‑γ δ T依然可以有效的杀伤靶细胞，而CD5CAR‑α β T的杀伤活性被显著抑制。

[0077] 上述结果表明，CD5CAR‑γ δ T不仅可以杀伤CD5+的肿瘤细胞，同时可以有效的杀伤CD5‑的肿瘤细胞，比传统的CD5CAR‑α β T不但具有更好的靶向杀伤活性，同时对于可能发生的靶点转阴的恶性肿瘤也具有显著的杀伤活性，提高了杀伤的持久性。

[0078] 实施例6. 体内抗肿瘤活性的鉴定

[0079] 为评估本发明制备的CD5CAR‑γ δ T细胞的体内抗肿瘤活性，使用6‑8周龄的NOD/6
SCID重度免疫缺陷小鼠，尾静脉注射1×10 稳定表达荧光素酶的人急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF‑CEM（Luci‑CCRF‑CEM）建立小鼠急性T淋巴细胞白血病模型。建模3天后，按照1
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×10 /200μL/小鼠的剂量给予按照实验组1培养方法制备的CD5CAR‑γ δ T细胞（实验组1所制备得到的产品）进行治疗。治疗采用尾静脉注射的方式，分别在注射肿瘤细胞后第3天和第6天各注射一次。治疗对照组动物注射同等剂量的使用常规CD3/CD28活化方法制备的CD5CAR‑α β T（制备详细信息参考技术文献：CN108017717A；CN110358734A；Clinical Cancer Research 2019，25 (18)：5595‑5607），阴性对照组注射同等剂量的正常T细胞，每个治疗组受试动物数量为3只。注射治疗后，每7天对各实验组动物进行活体成像，监测体内肿瘤的进展，直至阴性对照组动物全部死亡。

[0080] 通过比较各组动物活体成像的数据（图9）显示，CD5CAR‑γ δ T可以更有效的抑制肿瘤细胞在体内的生长。

[0081] 进一步的生存曲线分析（图10）表明，接受本发明制备的CD5CAR‑γ δ T细胞治疗后可以有效的延长荷瘤小鼠的中位生存时间，表明CD5CAR‑γ δ T细胞在体内具有比CD5CAR‑α β T和正常T细胞更好的抗肿瘤活性。

[0082] 此外，通过检测不同治疗组小鼠体内的抗肿瘤相关细胞因子的结果显示，接受CD5CAR‑γ δ T细胞治疗的小鼠体内IL‑2、IFN‑γ、TNF‑γ的水平显著高于另外两个治疗组（图11）。

[0083] 上述结果表明，本发明的制备方法获得的CD5CAR‑γ δ T具有比使用常规CD3/CD28活化方法制备的CD5CAR‑α β T更好的体内抗肿瘤活性。

[0084] 实施例7. 体内归巢能力的评估

[0085] 为评估本发明制备的细胞的体内归巢活性，将上述实施例6中接受治疗的小鼠处死，取骨髓，分离白细胞，使用小鼠抗人CD45、山羊抗小鼠Fab抗体标记骨髓中的CD5CAR‑γ δ T及CD5CAR‑α β T（CD45+/CAR+）。检测结果参见图12。结果显示，接受CD5CAR‑γ δ T治疗的小鼠骨髓中CAR‑γ δ T比例显著高于CD5CAR‑α β T治疗组和正常T细胞治疗组，提示本发明制备的CD5CAR‑γ δ T比传统的CAR‑α β T具有更好的骨髓迁移能力。

[0086] 在上述结果的基础上，利用流式细胞检测技术比较了本发明制备的CD5CAR‑γ δ T（实验组1所制备得到的产品）、常规CD3/CD28活化方法制备的CD5CAR‑α β T和正常体细胞6
表面多种趋化性受体的表达水平。将1×10的用于动物实验的不同治疗组的细胞收集到流式样本管中，用含有1%BSA的PBS清洗一遍，1500rpm离心3分钟，弃去上清，加入含有1%BSA的PBS重悬细胞。每管待测样本中分别加入FITIC标记的小鼠抗人CXCR4，PE标记的小鼠抗人CCR7，PerCP标记的小鼠抗人CXCR5以及APC标记的小鼠抗人CXCR3，室温避光孵育25分钟。孵育结束后，用含有1% BSA的PBS洗涤样本一次，加入200μL固定液上机检测。检测结果见图13及表5。

[0087] 表5. 正常T细胞、CD5CAR‑γ δ T以及CD5CAR‑α β T不同趋化因子的表达（平均值±标准差）

[0088]

[0089] 结果表明，本发明制备的CD5CAR‑γ δ T可以表达更高水平的CXCR4、CCR7、CXCR5以及CXCR3，提示使用本发明工艺制备的CD5CAR‑γ δ T不仅具有更好的抗肿瘤活性，同时可以诱导效应细胞表达更高水平的趋化性受体，使其具有更好的体内迁移活性。