抑制ZmbHLH21蛋白表达在植物抗旱中的应用

摘要

本发明公开了抑制ZmbHLH21蛋白表达在植物抗旱中的应用。本发明提供提供了降低植物中DNA分子编码蛋白质活性或含量的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；或本发明提供了抑制植物中上述DNA分子表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用。本发明在玉米中发现bHLH21基因，该基因经过CRISPR‑Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下未突变的对照植株生长明显优于突变体植株，说明该基因突变能够显著降低植物抗旱性。

权利要求

1.抑制植物中DNA分子表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；

或，降低植物中所述DNA分子编码的蛋白质活性或含量的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；

所述DNA分子，是如下（b1）或（b2）的DNA分子：（b1）编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

（b2）编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1）或2）：

1）sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1；

所述sgRNA1的靶点为序列1第867‑885位；

2）表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体；

所述植物为玉米。

2.一种培育抗旱转基因植物的方法，为如下1）或2）或3）：

1）为包括如下步骤：降低目的植物中权利要求1中所述蛋白质活性或含量，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

2）为包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1中所述DNA分子的表达，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

3）为包括如下步骤：对目的植物中权利要求1中所述DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

所述降低目的植物中权利要求1中所述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中权利要求1中所述DNA分子表达或所述对目的植物中权利要求1中所述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将权利要求1中所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中；

所述植物为玉米。

3.权利要求1中所述DNA分子或权利要求1中DNA分子编码的蛋白质在调控植物抗旱性中的应用；

所述调控为降低权利要求1中DNA分子编码的蛋白质活性或含量提高植物抗旱性，或抑制权利要求1中所述DNA分子的表达提高植物抗旱性；

所述植物为玉米。

说明书

抑制ZmbHLH21蛋白表达在植物抗旱中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抑制ZmbHLH21蛋白表达在植物抗旱中的应用。

背景技术

[0002] 玉米是我国第一大农作物，种植面积3300多万公顷，其总产量2亿多吨，在我国粮食安全和国民经济发展中起着重要作用。玉米是重要的粮食、饲料、工业原料和生物能源作物，目前玉米已经成为我国种植面积最大的作物。随着全球气候变暖的加剧，干旱和水资源的短缺已成为制约粮食生产的重要因素，严重的干旱会导致农作物大面积的减产和死亡，干旱胁迫作为一种重要的非生物胁迫，对植物的生长发育、生理和代谢过程产生了极其不利的影响。我国是一个干旱灾害频发的国家，干旱缺水地区面积占国土总面积的52.5％，且干旱是影响玉米产量的重要非生物胁迫因素，对玉米产量造成了极其不利的影响，因此提高玉米的抗旱性对于玉米产量至关重要。为了充分挖掘和提高玉米抗旱性及水分利用效率，我们旨在通过反向遗产学，从CRISPR‑Cas9突变材料中筛选干旱敏感或者抗旱的突变体，研究其基因功能及信号转导途径。

[0003] 转录因子(transcription factors)是RNA聚合酶在真核生物特异启动子上起始转录所需要的作用因子，由DNA结合区、转录调控区、寡聚化位点和核定位信号区组成。bHLH转录因子是真核生物中一类重要的转录因子，首先发现在动物中，bHLH家族的转录因子都含有一个高度保守的DNA结合结构域。其主要由碱性氨基酸区和α‑螺旋‑环‑α‑螺旋区(HLH区)组成。其不仅参与植物的生长发育还在非生物逆境胁迫中起着重要作用。

[0004] bHLH转录因子是一个大家族，在调节植物生长发育、信号转导和逆境胁迫响应方面发挥着重要作用。目前，在拟南芥和水稻中分别鉴定到了162和167个bHLH家族成员。模式植物拟南芥中已有不少bHLH家族蛋白功能研究的相关报道，但由于之前技术手段的限制及植物生命周期的差异，单子叶作物玉米中关于bHLH的作用机制研究甚少.玉米中共鉴定到208个bHLH蛋白，对玉米ZmbHLH家族蛋白的机理和深入研究还较少。目前，B73玉米基因组测序已经完成，玉米的遗传转化技术和基因编辑技术也趋于成熟，为通过基因工程手段进行遗传改良提供了重要保障。

发明内容

[0005] 本发明一个目的是提供如下应用。

[0006] 本发明提供了降低植物中DNA分子编码蛋白质活性或含量的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；

[0007] 或本发明提供了抑制植物中上述DNA分子表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用。

[0008] 上述DNA分子，为bHLH21基因，是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

[0009] (b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

[0010] (b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

[0011] (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

[0012] (b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

[0013] 上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；

[0014] 所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：

[0015] 1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；

[0016] 所述sgRNA1的靶点为序列1第1580‑1598位；

[0017] 所述sgRNA2的靶点为序列1第1633‑1651位；

[0018] 2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

[0019] bHLH21基因的核苷酸序列如序列1所示，根据本发明公开的核苷酸序列，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，得到影响bHLH21蛋白功能的突变序列。具体地说，本发明的技术方案包括：利用网站设计bHLH21基因的编辑靶点，根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等一系列过程，构建CRISPR/Cas9的载体，将载体转入农杆菌，用农杆菌侵染玉米幼胚的方式得到转化苗，用除草剂和PCR鉴定筛选阳性植株，提取突变体植株DNA进行测序，获得具有突变位点的突变体。突变体经自交繁种后进行旱处理实验。bHLH21基因可进行编辑的靶点不止一个，经过编辑后的突变基因可能会产生一个或多个核苷酸增加或缺失，导致蛋白部分缺失或提前终止，其中有些突变会影响蛋白质的生物学功能。表达无功能蛋白的突变体植株可能会产生响应干旱胁迫的表型，均属于本发明要求保护的范围。获得突变体后，检测bHLH21突变体在干旱处理下的表型。

[0020] 本发明还有一个目的是提供一种培育抗旱转基因植物的方法，为如下1)或2)或3)：

[0021] 1)所示的方法为包括如下步骤：降低目的植物中上述蛋白质活性或含量，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

[0022] 2)所示的方法为包括如下步骤：抑制目的植物中DNA分子的表达，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；

[0023] 3)所示的方法为包括如下步骤：对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物。

[0024] 上述方法中，所述降低目的植物中上述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中上述DNA分子表达或所述对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将上述所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中。

[0025] 上述物质也是本发明保护的范围。

[0026] 上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

[0027] 本发明还有一个目的是提供一种一种DNA分子。

[0028] 本发明提供的DNA分子，为bHLH21基因，是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

[0029] (b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

[0030] (b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

[0031] (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

[0032] (b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

[0033] 上述DNA分子编码的蛋白质也是本发明保护的范围。

[0034] 上述蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

[0035] (a1)序列表中序列2所示的蛋白质；

[0036] (a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；

[0037] (a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

[0038] (a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。

[0039] 标签具体如表1所示。

[0040] 表1为标签的序列

[0041]标签 残基 序列
Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
Poly‑His 2‑10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA

[0042] 上述玉米bHLH21基因由3653个碱基(序列1)组成，T01转录本的读码框为序列3，编码的蛋白为序列2。该转录本由8个外显子组成，其中编码外显子7个，读码框第601位到第1056位碱基，第1184位到第1354位碱基，第1523位到第1588位碱基，第1655位到第1774位碱基，第1889位到第2118位碱基，第2326位到第2495位碱基，第2691位到第3053位碱基，其余为其内含子序列。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该DNA段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。

[0043] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。

[0044] 上述DNA分子或上述的蛋白质在调控植物抗旱型中的应用也是本发明保护的范围。

[0045] 本发明的实验证明，本发明在玉米中发现bHLH21基因，该基因经过CRISPR‑Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下突变体植株生长明显优于未突变的对照植株，说明该基因突变能够显著提高植物抗旱性。本发明提供的抗旱植物选育方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强，显著缩短了抗旱育种的周期，提高了抗旱育种的效率。

附图说明

[0046] 图1为玉米bHLH21 CRISPR‑Cas9突变位点。

[0047] 图2为野生型玉米(对照)和bHLH21 CRISPR‑Cas9突变株系干旱处理后植株生长情况照片，左边3个为野生，右边3个为突变。

具体实施方式

[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0050] 以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

[0051] 以下实施例中所用转录本为T01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。

[0052] 玉米生态型为B73，记载在如下文献中：Zhang et al.The genetic architecture of nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032‑1044,2018.；

[0053] 农杆菌菌株是EHA105。

[0054] CRISPR/Cas9载体pBUE411，记载在如下文献中：Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants。

[0055] 主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Takara公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。

[0056] 实施例1、bHLH21基因的获得及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

[0057] 一、bHLH21基因的获得

[0058] 为研究WRKY家族蛋白在植物抗旱中的分子机制，利用CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)B73基因组中定向突变了bHLH21基因。

[0059] 上述玉米bHLH21基因由3653个碱基(序列1)组成，T01转录本的读码框为序列3，编码蛋白为序列2，命名为bHLH21蛋白。该转录本由8个外显子组成，其中编码外显子7个，读码框第763位到第1056位碱基，第1184位到第1354位碱基，第1523位到第1588位碱基，第1655位到第1774位碱基，第1889位到第2218位碱基，第2326位到第2495位碱基，第2691位到第3053位碱基，其余为其内含子序列。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该DNA段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。

[0060] 二、用于基因编辑bHLH21基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

[0061] 选取bHLH21基因中GAACCATGGCCAAGCTGTA(序列1第867‑885位)作为该基因的靶点，设计包含靶点信息的引物:

[0062] 根据靶点设计出的序列分别合成单链寡核苷酸，合成方法如下：

[0063] ID‑1f：GGCGTACAGCTTGGCCATGGTTC

[0064] ID‑1r：AAACGAACCATGGCCAAGCTGTA

[0065] (1)退火：

[0066] 将上述稀释后ID‑1f和稀释后ID‑1r退火获得带粘性末端的双链DNA片段gRNA；

[0067] (2)pBUE411载体(该载体含有3×FLAG‑NLS‑zCas9‑NLS表达系统和用于插入靶序列的gRNA支架)用BsaI(NEB)酶切，得到酶切后pBUE411；

[0068] 表2为酶切体系

[0069]

[0070] (3)连接体系

[0071] 将上述(1)的带粘性末端的双链DNA片段gRNA和上述(2)得到的酶切后pBUE411C连接，得到连接产物，即为重组CRISPR载体pBCXUN‑bHLH21 CRISPR‑Cas9，该载体表达sgRNA,sgRNA识别区的编码序列为序列1第867‑885位。

[0072] 上述连接体系如表3所示：

[0073] 表3为连接体系

[0074]

[0075] (4)鉴定

[0076] 取5μl(3)得到的连接产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆(得到700bp为阳性)，提取质粒送去测序。

[0077] PCR鉴定所需引物如下：

[0078] ID‑1f：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

[0079] ID‑1r：AAACCCCGTTCCAGGGCATGACG

[0080] 测序引物：OsU3‑FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

[0081] 测序结果显示，阳性克隆的质粒为重组CRISPR载体pBCXUN‑bHLH21 CRISPR‑Cas9，该载体表达sgRNA,sgRNA识别区的编码序列为序列1第867‑885位。

[0082] 实施例2、bHLH21基因CRISPR‑Cas9植物的制备及抗旱表型研究

[0083] 一、bHLH21基因CRISPR‑Cas9植物的制

[0084] 1、重组菌的制备

[0085] 将实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体pBCXUN‑bHLH21 CRISPR‑Cas9突变质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，命名为EHA105/pBCXUN‑bHLH21 CRISPR‑Cas9。

[0086] 2、bHLH21基因CRISPR‑Cas9植物的构建

[0087] 将鉴定正确的农杆菌EHA105/pBCXUN‑bHLH21 CRISPR‑Cas9单菌落接种于2‑3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD600在0.8‑1.0之间。

[0088] 将重组菌EHA105/pBCXUN‑bHLH21 CRISPR‑Cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73以下也称为野生型玉米)，B73的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转化苗。构建方法参考：Zhang et al.The genetic architecture of nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032‑1044,2018。

[0089] 3、检测

[0090] 提取T0代转化苗的DNA作为模板进行PCR扩增并测序，以B73玉米为对照。

[0091] 扩增所需引物如下(得到700bp为阳性)：

[0092] ID‑1f：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

[0093] ID‑1r：AAACCCCGTTCCAGGGCATGACG

[0094] 测序引物：OsU3‑FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

[0095] 测序结果如图1所示，

[0096] 其中，上图中，与野生型玉米B73(上面序列)相比，T0代转化苗(下面序列)中bHLH21基因中缺失多个碱基的突变(图1上图)，导致蛋白翻译提前终止，蛋白功能被破坏；将含有该突变形式的转化苗分别命名为阳性T0代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1。

[0097] 下图图中，与野生型玉米B73(下面序列)相比，T0代转化苗(上面序列)中bHLH21基因中有单碱基缺失突变造成移码(图1下图)；将含有该突变形式的转化苗分别命名为阳性T0代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2。

[0098] 阳性T0代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1和阳性T0代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2培育直至获得T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1和T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2。

[0099] 二、bHLH21基因CRISPR‑Cas9突变玉米旱处理表型检测

[0100] 1、在装有营养土的小盆中播种T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1种子、T2代CRISPR‑2
Cas9突变玉米si‑2种子和野生型玉米B73种子，覆盖50cm 土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，培育7天后出苗，得到T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1苗、T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2苗和野生型玉米苗；

[0101] 2、将长势齐的T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1苗、T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2苗和野生型玉米B73苗分别移栽到新的装有营养土的盆中，每盆3株，正常浇水并培养7天。设置三次重复试验，每次重复试验6盆。

[0102] 3、完成步骤2后，持续不浇水14天(干旱处理)，再次恢复浇水7天。

[0103] 恢复浇水7天后，表型差异明显，结果如图2所示，左边3个为野生型玉米B73，右边3个依次为1株T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1和2株T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2，可以看出，不浇水14天再次恢复浇水7天后bHLH21 CRISPR‑Cas9突变植株(T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1或T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2)的生长状况均优于对照野生型玉米B73植株，野生型玉米B73叶片萎蔫程度高于T2代CRISPR‑Cas9突变玉米，突变体植株(T2代CRISPR‑Cas9突变玉米)与未突变的对照植株(野生型玉米)相比更耐旱。

[0104] 统计干旱处理14天且恢复后再次恢复浇水，各株系的存活率(将表现为能正常生长植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑1干旱处理后的存活率为75％；T2代CRISPR‑Cas9突变玉米si‑2干旱处理后的存活率为71％；野生型玉米干旱处理后的存活率为45％。

[0105] 因此，抑制bHLH21蛋白表达或者敲除bHLH21基因能够提高玉米耐旱性。