一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法及其应用

摘要

本发明公开了一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法及其应用，制备方法为：S1、配置适宜浓度的聚电解质化合物溶液、钙离子溶液、正磷酸根离子溶液、焦磷酸根离子溶液、碱性磷酸酶溶液；S2、向I型胶原溶液中依次加入钙离子溶液、聚电解质化合物溶液、焦磷酸根离子溶液、正磷酸根离子溶液、碱性磷酸酶溶液；S3、依次添加完各个溶液后，调节pH至8‑9，然后加去离子水至体积为I型胶原溶液体积的3‑5倍，静置反应25‑35min得到矿化骨基质溶液；S4、调节矿化骨基质溶液的pH至7‑8，静置反应24‑32h得到初产物；S5、初产物除杂后浓缩至原体积的10％‑20％，得到骨基质矿化液，将骨基质矿化液0℃以下冷冻成型12‑24h后取出，干燥得到具有多层花朵样磷灰石空间矿化结构的矿化骨基质材料。

权利要求

1.一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、配置0.5‑1.5mg/mL聚电解质化合物溶液、0.05‑0.15M钙离子溶液、0.05‑0.15M正磷酸根离子溶液，以及2.5‑3.5wt％焦磷酸根离子溶液、5‑10mg/L碱性磷酸酶溶液；

S2、向离心管中加入3‑5mg/mL的I型胶原溶液，然后依次向所述I型胶原溶液中加入S1中配置的所述钙离子溶液、所述聚电解质化合物溶液、所述焦磷酸根离子溶液、所述正磷酸根离子溶液、所述碱性磷酸酶溶液，形成反应体系，各个溶液的添加量由所述反应体系内各组分的最终浓度计算得到，其中，I型胶原的最终浓度为0.5‑2mg/mL，钙离子的最终浓度为

10‑20mM，聚电解质化合物的最终浓度为30‑100μg/mL，焦磷酸根离子的最终浓度为0.5‑

2wt％，正磷酸根离子的最终浓度为5‑10mM，碱性磷酸酶的最终浓度为30‑100μg/mL；

S3、依次添加完各个溶液后，调节所述反应体系的pH至8‑9，然后向所述反应体系中加入去离子水至其体积为所述I型胶原溶液体积的3‑5倍，之后静置反应25‑35min得到矿化骨基质溶液；

S4、用1‑5wt％乙酸溶液调节所述矿化骨基质溶液的pH至7‑8，之后继续静置反应24‑

32h得到初产物；

S5、对所述初产物进行除杂，然后根据总反应体积的多少将除杂后的所述初产物浓缩至其原体积的10％‑20％，得到骨基质矿化液，将所述骨基质矿化液放置于0℃以下恒温环境中冷冻成型，12‑24h后取出，冷冻干燥，得到矿化骨基质材料。

2.根据权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，S1中，所述聚电解质化合物溶液为聚丙烯酸溶液、聚丙烯酰胺溶液中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，S1中，所述钙离子溶液为水溶性钙盐溶液。

4.根据权利要求3所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，所述钙离子溶液为氯化钙溶液、硝酸钙溶液中的一种或其混合物。

5.根据权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，S1中，所述正磷酸根离子溶液为磷酸氢二铵溶液、磷酸二氢铵溶液中的一种或其混合物。

6.根据权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，S1中，所述焦磷酸根离子溶液为焦磷酸钠溶液、焦磷酸钾溶液中的一种或其混合物。

7.根据权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，S3中，调节所述反应体系pH值的调节剂具体是：浓度为1M的碱溶液、浓度为0.1M的碱溶液和浓度为

0.1M的氨水。

8.根据权利要求7所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，所述碱溶液为NaOH溶液、KOH溶液的一种或其混合物。

9.根据权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其特征在于，S5中，对所述初产物进行除杂的具体流程包括：流程A、向所述初产物中加去离子水，清洗；

流程B、离心加去离子水后的所述初产物；

流程C、离心后，滤除液体，重新加去离子水至体积为所述矿化骨基质溶液的2‑3倍；

流程D、重复流程B‑C3次，得到除杂后的所述初产物。

10.一种矿化骨基质材料，其特征在于，是由权利要求1所述的磷酸盐介导的磷灰石自组装方法得到，且具有花朵样和多层花朵样的磷灰石空间矿化结构。

11.权利要求1所述的一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法在制备用于骨缺损修复的植介入医疗器械方面的应用。

说明书

一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法及其应用。

背景技术

[0002] 磷灰石是组成骨组织组成骨基质的主要无机相，是骨组织实现力学强度的主要来源。最新研究表明，在骨组织内，磷灰石在纳米尺度上包括丝状图案、花边图案以及嵌套的玫瑰花结图案等不同的结构形态。宏观尺度上则主要是片层结构。事实上，磷灰石在骨组织内存在多尺度的多级矿化结构，磷灰石在不同尺度上以不同的结构形态存在，使得骨能够适应复杂多变的外界力学环境。

[0003] 然而，目前，在体外仿生矿化研究中，鲜有能够制备出具有不同图案结构的磷灰石的技术出现。

发明内容

[0004] 为此，本发明实施例提供一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法及其应用，以解决上述现有技术中存在的问题。

[0005] 为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

[0006] 第一方面，本发明实施例提供了一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，其包括以下步骤：

[0007] S1、配置0.5‑1.5mg/mL聚电解质化合物溶液、0.05‑0.15M钙离子溶液、0.05‑0.15M正磷酸根离子溶液，以及2.5‑3.5wt％焦磷酸根离子溶液、5‑10mg/L碱性磷酸酶溶液；

[0008] S2、向离心管中加入3‑5mg/mL的I型胶原溶液，然后依次向I型胶原溶液中加入S1中配置的钙离子溶液、聚电解质化合物溶液、焦磷酸根离子溶液、正磷酸根离子溶液、碱性磷酸酶溶液，形成反应体系，各个溶液的添加量由反应体系内各组分的最终浓度计算得到，其中，I型胶原的最终浓度为0.5‑2mg/mL，钙离子的最终浓度为10‑20mM，聚电解质化合物的最终浓度为30‑100μg/mL，焦磷酸根离子的最终浓度为0.5‑2wt％，正磷酸根离子的最终浓度为5‑10mM，碱性磷酸酶的最终浓度为30‑100μg/mL；

[0009] S3、依次添加完各个溶液后，调节反应体系的pH至8‑9，然后向反应体系中加入去离子水至其体积为I型胶原溶液体积的3‑5倍，之后静置反应25‑35min得到矿化骨基质溶液；

[0010] S4、用1‑5wt％乙酸溶液调节矿化骨基质溶液的pH至7‑8，之后继续静置反应24‑32h得到初产物；

[0011] S5、对初产物进行除杂，然后根据总反应体积的多少将除杂后的初产物浓缩至其原体积的10％‑20％，得到骨基质矿化液，将骨基质矿化液放置于0℃以下恒温环境中冷冻成型，12‑24h后取出，冷冻干燥，得到矿化骨基质材料。

[0012] 优选地，S1中，聚电解质化合物溶液为聚丙烯酸溶液、聚丙烯酰胺溶液中的一种。

[0013] 优选地，S1中，钙离子溶液具体为水溶性钙盐溶液，更具体为氯化钙溶液、硝酸钙溶液中的一种或其混合物。

[0014] 优选地，S1中，正磷酸根离子溶液为磷酸氢二铵溶液、磷酸二氢铵溶液中的一种或其混合物。

[0015] 优选地，S1中，焦磷酸根离子溶液为焦磷酸钠溶液、焦磷酸钾溶液中的一种或其混合物。

[0016] 优选地，S3中，调节反应体系pH值的调节剂具体是：浓度为1M的碱溶液、浓度为0.1M的碱溶液和浓度为0.1M的氨水。

[0017] 进一步地，碱溶液为NaOH溶液、KOH溶液的一种或其混合物。

[0018] 优选地，S5中，对初产物进行除杂的具体流程包括：

[0019] 流程A、向初产物中加去离子水，清洗；

[0020] 流程B、离心加去离子水后的初产物；

[0021] 流程C、离心后，滤除液体，重新加水至体积为矿化骨基质溶液的2‑3倍；

[0022] 流程D、重复流程B‑C 3次，得到除杂后的初产物。

[0023] 第二方面，本发明实施例提供了一种由上述方法得到的矿化骨基质材料，其具有花朵样和多层花朵样的磷灰石空间矿化结构。

[0024] 第三方面，本发明实施例提供了上述方法在制备用于骨缺损修复的植介入医疗器械方面的应用。

[0025] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

[0026] (1)本发明实施例提供的磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，利用磷灰石自组装，在微米尺度上，在矿化骨基质表面制备具有不同空间组装结构和矿化程度的矿化磷灰石即矿化骨基质材料，组装结构主要是与机体内一致的片层结构、花朵样结构以及多层花朵样结构，为实现多尺度高度仿生骨材料的制备提供了强有力的技术支持。

[0027] (2)本发明实施例提供的磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，相较传统的磷灰石矿化方法，更加充分地考虑了离子来源、化学反应平衡及化学因素添加顺序在矿化中的影响，构建了多因素协同调控体系，更好的模拟了体内复杂的骨基质矿化组装过程；在碱性磷酸酶的作用下，焦磷酸盐发生酶解，产生大量的正磷酸根，有利于磷灰石的形成。在矿化初始阶段加入正磷酸盐作为调控因子，可以有效控制焦磷酸盐的酶解速度，同时引导形成的磷灰石聚集形成片层结构，片层结构的磷灰石进一步组装，形成花朵样和多层花朵样的磷灰石空间矿化结构，弥补了目前该技术领域中的空白。

[0028] (3)本发明实施例提供的磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，通过控制骨基质内调控因子的添加以及添加顺序，在弱碱性条件下，利用碱性磷酸酶，水解焦磷酸盐，同时，利用聚电解质化合物调控纳米磷灰石颗粒的尺寸，正磷酸盐调控碱性磷酸酶的水解以及磷灰石在胶原/磷酸钙仿生矿化体系中的自组装机制，可制作出具有不同形状的磷灰石空间矿化结构。

[0029] (4)本发明实施例提供的磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，通过加入氨水来调节pH值，氨水能够形成缓冲体系，实现在反应进程中自主调节反应体系的PH，使操作更加简便，同时使反应更加平稳可控。

[0030] (5)本发明实施例提供的矿化骨基质材料，具有花朵样和多层花朵样的磷灰石空间矿化结构，同时，既具有很好的生物相容性，也具有与人体骨组织内骨基质相匹配的力学特性，有很广阔的应用空间。

附图说明

[0031] 为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的附图。

[0032] 以下附图仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，任何形式的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的的前提下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

[0033] 图1为本发明实施例1的操作流程示意图；

[0034] 图2为本发明实施例1、实施例3和对照例1中在正磷酸盐调控下焦磷酸盐经碱性磷酸酶酶解形成正磷酸盐的反应曲线图；其中，图2‑A为不同正磷酸盐添加量下，碱性磷酸酶添加量对焦磷酸根离子浓度的作用曲线图，图2‑B为不同正磷酸盐添加量下，碱性磷酸酶添加量对正磷酸根离子浓度的作用曲线图；

[0035] 图3为本发明实施例1、对照例1和对照例2的SEM图像；其中图3‑A1为对照例2的SEM图像，图3‑A2为图3‑A1中框选区域的形貌放大图像；图3‑B1为对照例1的SEM图像，图3‑B2为图3‑B1中框选区域的形貌放大图像；图3‑C1为实施例1的SEM图像，图3‑C2为图3‑C1中框选区域的形貌放大图像。

具体实施方式

[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0037] 在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等旨在区别指代的对象。对于具有时序流程的方案，这种术语表述方式不必理解为描述特定的顺序或先后次序，对于装置结构的方案，这种术语表述方式也不存在对重要程度、位置关系的区分等。

[0038] 此外，术语“包括”、“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包括了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于已明确列出的那些步骤或单元，而是还可包含虽然并未明确列出的但对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元，或者基于本发明构思进一步的优化方案所增加的步骤或单元。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例提供了一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，通过该方法可制备出具有花朵样和多层花朵样磷灰石空间矿化结构的矿化骨基质材料。本实施例操作流程如图1所示，具体步骤及相关参数如下：

[0041] 步骤1、将购买的成品聚丙烯酸(即图1中的聚电解质化合物)、氯化钙(即图1中的钙离子)、磷酸氢二铵(即图1中的正磷酸盐)以及焦磷酸钠(即图1中的焦磷酸盐)、碱性磷酸酶的试剂首先利用无菌的去离子水配置成反应原液。反应原液的浓度分别是，聚丙烯酸1mg/mL，氯化钙0.1M，磷酸氢二铵0.1M，焦磷酸钠质量分数3％。另外调节pH需要用到氢氧化钠、氨水以及乙酸。配置两个浓度的NaOH溶液用于粗调和微调pH，分别是1M和0.1M。氨水
0.1M，添加氨水的目的是氨水能够形成缓冲体系，实现在反应进程中自主调节反应体系的pH。乙酸浓度为质量分数2％。由BD biocoat购买的鼠尾I型胶原即为胶原的反应原液(即图
1中的I型胶原溶液)，浓度范围在3‑5mg/mL。购买的碱性磷酸酶总活力值大于10KU，即大于
10mg，按照最低值10mg计算，配置成10mg/mL的原液。

[0042] 在该步骤中：

[0043] 所用的聚丙烯酸可用其它聚电解质化合物替代，如聚丙烯酰胺等；

[0044] 所用的氯化钙可用其它能够提供钙离子的水溶性钙盐替代，如硝酸钙等；

[0045] 所用的磷酸氢二铵可用其它能够提供正磷酸根离子的水溶性磷酸盐替代，如磷酸二氢铵等；

[0046] 所用的焦磷酸钠可用其它能够提供焦磷酸根离子的水溶性焦磷酸盐替代，如焦磷酸钾等；

[0047] 所用的鼠尾I型胶原溶液可用其它不与反应体系中的物质反应而对最终效果造成负面影响的I型胶原溶液代替。

[0048] 步骤2、在离心管内进行矿化反应。反应体系中溶液的总量为5mL。在反应体系内，按照图1所示的添加顺序，添加反应体系内的各组分。根据反应体系内各组分的最终浓度，计算各组分需要的原液的添加量。其中，胶原的最终浓度为1mg/mL，钙离子的最终浓度为10mM，聚丙烯酸的最终浓度为50μg/mL，焦磷酸根离子的最终浓度质量分数1％，正磷酸根离子的最终浓度为5mM，碱性磷酸酶的最终浓度为60μg/mL。

[0049] 步骤3、按照图1所示的顺序1‑5添加完各反应物质后，用氢氧化钠以及氨水调节反应体系的pH至8‑9，补充无菌去离子水使反应体系达到5mL，维持30min反应。

[0050] 在该步骤中：

[0051] 所用的氢氧化钠可用其它能够完全电离、且不会与反应体系中其它物质反应而对反应效果造成负面影响的碱代替，如KOH等；

[0052] 所用的氨水可用其它不完全电离、且不会与反应体系中其它物质反应而对反应效果造成负面影响的碱液代替。

[0053] 步骤4、30分钟后用质量分数2％的乙酸，调节反应体系的pH至7.4，反应24h，得到初产物。

[0054] 步骤5、流程A：反应结束后，向所述初产物中加无菌去离子水，清洗；流程B：离心加无菌去离子水后的初产物；流程C：离心后，滤除液体，重新加500μL无菌去离子水；流程D：重复流程B‑C3次，得到除杂后的初产物；流程E：重复3次后，将除杂后的初产物至其最初体积(即步骤4中得到的初产物的体积)的15％，得到高浓度的骨基质矿化液，放置到‑20℃的冰箱内冷冻成型，过夜约12h后，转移至真空冷冻干燥机内，冷冻干燥，得到矿化骨基质材料。

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例提供了一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，通过该方法可制备出具有花朵样和多层花朵样磷灰石空间矿化结构的矿化骨基质材料。本实施例操作流程与具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

[0057] 步骤1中，所用的聚电解质化合物溶液为0.5mg/L的聚丙烯酸溶液；所用的钙离子溶液为0.05M硝酸钙溶液；所用的焦磷酸根离子溶液为2.5wt％焦磷酸钾溶液；所用的正磷酸盐溶液为0.05M磷酸二氢铵溶液；所用的碱性磷酸酶溶液浓度为8mg/L；

[0058] 步骤2中，胶原的最终浓度为0.5mg/mL，钙离子的最终浓度为15mM，聚丙烯酸的最终浓度为30μg/mL，焦磷酸根离子的最终浓度0.5wt％，正磷酸根离子的最终浓度为7mM，碱性磷酸酶的最终浓度为30μg/mL；

[0059] 步骤3中，反应时间为25min；

[0060] 步骤4中，调节pH至7；反应时间为28h；

[0061] 步骤5中，放置到‑10℃的冰箱内冷冻成型，过夜约18h后，转移至真空冷冻干燥机内，冷冻干燥，得到矿化骨基质材料。

[0062] 实施例3

[0063] 本实施例提供了一种磷酸盐介导的磷灰石自组装方法，通过该方法可制备出具有花朵样和多层花朵样磷灰石空间矿化结构的矿化骨基质材料。本实施例操作流程与具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

[0064] 步骤1中，所用的聚电解质化合物溶液为1.5mg/L的聚丙烯酰胺溶液；所用的钙离子溶液为0.15M硝酸钙溶液；所用的焦磷酸根离子溶液为3.5wt％焦磷酸钾溶液；所用的正磷酸盐溶液为0.15M磷酸二氢铵溶液；所用的碱性磷酸酶溶液浓度为5mg/L；

[0065] 步骤2中，胶原的最终浓度为2mg/mL，钙离子的最终浓度为20mM，聚丙烯酰胺的最终浓度为100μg/mL，焦磷酸根离子的最终浓度2wt％，正磷酸根离子的最终浓度为10mM，碱性磷酸酶的最终浓度为100μg/mL；

[0066] 步骤3中，反应时间为35min；

[0067] 步骤4中，调节pH至8；反应时间为32h；

[0068] 步骤5中，放置到‑8℃的冰箱内冷冻成型，过夜约24h后，转移至真空冷冻干燥机内，冷冻干燥，得到矿化骨基质材料。

[0069] 对照例1

[0070] 本对照例操作步骤与实施例1基本相同，区别在于，不添加碱性磷酸酶和正磷酸盐，且各反应物添加顺序随机，未按照本申请实施例1的添加顺序进行。

[0071] 对照例2

[0072] 本对照例操作步骤与实施例1基本相同，区别在于，不添加正磷酸盐，且各反应物添加顺序随机，未按照本申请实施例1的添加顺序进行。

[0073] 接下来对实施例1‑3进行一系列实验，以辅助说明本发明的有益效果。

[0074] 实验1

[0075] 分别测定实施例1、实施例3和对照例2中在正磷酸盐调控下焦磷酸盐经碱性磷酸酶酶解形成正磷酸盐的反应曲线，其结果如图2所示。其中，图2‑A为不同正磷酸盐添加量下，碱性磷酸酶添加量对焦磷酸根离子浓度的作用曲线图；图2‑B为不同正磷酸盐添加量下，碱性磷酸酶添加量对正磷酸根离子浓度的作用曲线图。

[0076] 通过图2‑A可看出，随着碱性磷酸酶的酶解，焦磷酸根离子即焦磷酸盐的含量减少，同时，随着正磷酸盐添加量的增多，碱性磷酸酶酶解焦磷酸盐的速率减慢；

[0077] 通过图2‑B可看出，随着碱性磷酸酶的酶解，正磷酸根离子即正磷酸盐的含量增加，同时，随着正磷酸盐添加量的增多，正磷酸根离子即正磷酸盐的形成速率减慢；

[0078] 通过图2整体可以看出，焦磷酸盐可以在碱性磷酸酶的作用下酶解形成正磷酸盐，同时，当初始添加的正磷酸根离子即正磷酸盐的量较多时，酶解反应变慢，说明正磷酸盐和焦磷酸盐之间存在化学反应平衡。而本发明实施例正是更加充分地考虑了离子来源、化学反应平衡及化学因素添加顺序在矿化中的影响，通过特定的反应物添加顺序、添加量以及特定的反应条件等多因素协同作用，构建了多因素协同调控体系，更好的模拟了体内复杂的骨基质矿化组装过程，得到了性能优良的、具有花朵样和多层花朵样磷灰石空间矿化结构的矿化骨基质材料。

[0079] 本实验对实施例2也进行了同样的测定，其结果与实施例1、3均基本相同，整体上均能实现本发明所欲实现的技术效果。

[0080] 实验2

[0081] 使用SEM分别观测对照例1、对照例2和实施例1得到的矿化骨基质材料的微观形貌，观测得到的SEM图像如图3所示。其中，图3‑A1为对照例1的SEM图像，图3‑A2为图3‑A1中框选区域的形貌放大图像；图3‑B1为对照例2的SEM图像，图3‑B2为图3‑B1中框选区域的形貌放大图像；图3‑C1为实施例1的SEM图像，图3‑C2为图3‑C1中框选区域的形貌放大图像。

[0082] 通过图3可知，由本发明实施例1提供的方法制备得到的矿化骨基质材料具有花朵样和多层花朵样的磷灰石空间矿化结构，这是对照例1和对照例2均不具备的。

[0083] 本次实验对实施例2、3也进行了同样的测定，其结果均与实施例1基本相同，整体上就能实现本发明所欲实现的技术效果。

[0084] 以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述；这些未明确写出的实施例，也都应当认为是本说明书记载的范围。

[0085] 上文中通过一般性说明及具体实施例对本发明作了较为具体和详细的描述。应当指出的是，在不脱离本发明构思的前提下，显然还可以对这些具体实施例作出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。