一种分离纯化卵泡膜细胞的方法

摘要

本发明公开了一种分离纯化卵泡膜细胞的方法，属于细胞培养领域。所述方法包括：收集取卵日废弃的无菌卵泡液，分离获取卵巢组织；所得卵巢组织用含I型胶原蛋白酶的PBS溶液消化处理，收集悬浮细胞，用细胞筛除去所述悬浮细胞中未消化的卵泡膜组织，收集卵巢细胞；将所得卵巢细胞重悬后，低速短时离心，收集沉淀得到初步纯化后的卵泡膜细胞，再将其铺种于未包被的培养皿，进一步纯化卵泡膜细胞，获取分离纯化后的卵泡膜细胞。该方法能够克服常规卵巢组织中提取卵泡膜细胞的缺陷，并且简单易操作，能够快速纯化得到卵泡膜细胞，这为卵泡膜细胞的来源提供一个新的思路与技术路线，为卵泡膜细胞以及卵巢组织的研究瓶颈带来一个新的突破。

权利要求

1.一种分离纯化卵泡膜细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：收集取卵日废弃的无菌卵泡液，分离获取卵巢组织；

步骤2：所得卵巢组织用含I型胶原蛋白酶的PBS溶液消化处理，收集悬浮细胞，用细胞筛除去所述悬浮细胞中未消化的卵泡膜组织，收集卵巢细胞；

步骤3：将所得卵巢细胞重悬后，低速短时离心，收集沉淀得到初步纯化后的卵泡膜细胞；

步骤4：初步纯化后的卵泡膜细胞铺种于未包被的培养皿，采用含抗生素、胎牛血清的DMEM/F12培养基进行细胞培养，进一步纯化卵泡膜细胞，获取分离纯化后的卵泡膜细胞；

步骤1中，分离获取卵巢组织具体包括以下步骤：将收集的无菌卵泡液，用100μm细胞筛过滤，用PBS溶液冲洗卵巢组织，初步去除颗粒细胞、颗粒细胞团，收集停留在所述细胞筛表面的卵巢组织；

步骤2中，消化处理的条件为：所述卵巢组织用含有5mg/mLⅠ型胶原蛋白酶的PBS，于37℃下消化90min；其中，所述卵巢组织与所述含I型胶原蛋白酶的PBS溶液的体积比为1：10；

步骤3中，低速短时离心具体为：将所述卵巢细胞用10％Percoll液重悬后，100g离心

30s，收集靠近底部1/4层沉淀细胞重悬于PBS溶液，上层液体转移后，吹打，再于100g离心

30s，弃去上层液体，取靠近底部1/4层沉淀细胞重悬于PBS溶液，两次所收集的沉淀合并后用PBS清洗后，重悬待用。

2.如权利要求1所述的分离纯化卵泡膜细胞的方法，其特征在于，步骤2中所用的细胞筛为40μm。

3.如权利要求1所述的分离纯化卵泡膜细胞的方法，其特征在于，步骤4中，采用未包被的培养皿培养细胞，在培养的第24h换液，去除贴壁较慢的颗粒细胞。

4.如权利要求1所述的分离纯化卵泡膜细胞的方法，其特征在于，步骤4中，采用10％胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液进行细胞培养。

5.一种如权利要求1‑4任一项所述的方法分离纯化的卵泡膜细胞在制备卵巢标本中的应用。

说明书

一种分离纯化卵泡膜细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养领域，特别是涉及一种分离纯化卵泡膜细胞的方法。

背景技术

[0002] 多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是生育年龄女性最常见的内分泌疾病之一，发病率达5‑10％，主要临床表现为月经稀发或闭经、异常子宫出血、不孕、多毛、痤疮。PCOS患者妊娠期发生妊娠期糖尿病、妊娠期高血压疾病风险增高。PCOS远期合并症包括胰岛素抵抗、糖耐量异常、2型糖尿病、肥胖、血脂异常、心脏病、高血压、抑郁症、睡眠呼吸暂停综合征、子宫内膜癌等。PCOS长期危害患病女性健康，然而因其病因及发病机制不明确，尚无根治方法，患者需终身随访，终身治疗。雄激素增多在PCOS发病过程中起关键作用。女性体内雄激素主要在卵巢的卵泡膜细胞中合成。因此，人卵泡膜细胞的分离培养，对研究PCOS的发病机制有重要意义。

[0003] 既往人卵泡膜细胞的获取主要来源于妇科手术过程的人卵巢标本：先把卵泡从卵巢间质中切割出来；在培养基中把卵泡对半切开，刮除卵泡内的颗粒细胞后把卵泡膜层撕下；卵泡膜层用0.05％的胶原蛋白酶I，0.05％的胶原蛋白酶IA及0.01％脱氧核糖核酸酶进行消化；消化下来的卵泡膜细胞用含0在含5％O2，5％CO2，90％N2条件下培养，培养皿采用纤连蛋白包被的培养皿。随着医疗技术的进步，女性妇科手术过程中对卵巢功能的保护得到越来越多的重视，因此，卵巢标本的来源越来越紧缺。这种趋势使得人卵泡膜细胞的相关研究进展缓慢。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种分离纯化卵泡膜细胞的方法，以解决上述现有技术存在的问题，从取卵过程中被废弃的卵泡液里分离、纯化卵泡膜细胞，为卵泡膜细胞的来源提供一个新的思路与技术路线，这将为卵泡膜细胞研究的瓶颈带来一个新的突破。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供一种分离纯化卵泡膜细胞的方法，包括以下步骤：

[0007] 步骤1：收集取卵日废弃的无菌卵泡液，分离获取卵巢组织；

[0008] 步骤2：所得卵巢组织用含I型胶原蛋白酶的PBS溶液消化处理，收集悬浮细胞，用细胞筛除去所述悬浮细胞中未消化的卵泡膜组织，收集卵巢细胞；

[0009] 步骤3：将所得卵巢细胞重悬后，低速短时离心，收集沉淀得到初步纯化后的卵泡膜细胞。

[0010] 步骤4：初步纯化后的卵泡膜细胞铺种于未包被的培养皿，采用含抗生素、胎牛血清的DMEM/F12培养基进行细胞培养，进一步纯化卵泡膜细胞，获取分离纯化后的卵泡膜细胞。

[0011] 优选的是，步骤1中，分离获取卵巢组织具体包括以下步骤：将收集的无菌卵泡液，用100μm细胞筛过滤，用PBS溶液冲洗卵巢组织，初步去除颗粒细胞、颗粒细胞团，收集停留在所述细胞筛表面的卵巢组织。

[0012] 优选的是，步骤2中，消化处理的条件为：所述卵巢组织用含有5mg/mLⅠ型胶原蛋白酶的PBS，于37℃下消化90min；其中，所述卵巢组织与所述含I型胶原蛋白酶的PBS溶液的体积比为1：10。

[0013] 优选的是，步骤2中所用的细胞筛为40μm。

[0014] 优选的是，步骤3中，低速短时离心具体为：将所述卵巢细胞用10％Percoll液重悬后，100g离心30s，收集靠近底部1/4层沉淀细胞重悬于PBS溶液，上层液体转移后，吹打，再于100g离心30s，弃去上层液体，取靠近底部1/4层沉淀细胞重悬于PBS溶液，两次所收集的沉淀合并后用PBS清洗后，重悬待用。

[0015] 优选的是，步骤4中，采用未包被的培养皿培养细胞，在培养的第24h换液，去除贴壁较慢的颗粒细胞。

[0016] 优选的是，步骤4中，采用10％胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液进行细胞培养。

[0017] 本发明还提供一种所述的方法分离纯化的卵泡膜细胞在制备卵巢标本中的应用。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明从取卵过程获得的卵泡液里提取卵泡膜细胞，克服了传统方法从卵巢组织中提取卵泡膜细胞所存在的缺陷，而卵泡液中提取卵泡膜的主要难点在于卵泡膜细胞中混杂着不少的颗粒细胞，两种细胞的大小、质量比较接近。本发明优化了分离纯化条件，通过100μm细胞筛初步过滤去除颗粒细胞、颗粒细胞团；通过使用梯度密度离心液，低速短时离心，收集下沉较快的卵泡膜细胞，纯化卵泡膜细胞；通过采用未预包被的培养皿培养细胞，并且在培养第24h换液等方法去除贴壁较慢的颗粒细胞，达到进一步纯化卵泡膜细胞的目的。

[0020] 针对本发明的方法得到的卵泡膜细胞进行免疫组化分析发现，从取卵手术过程获得的卵泡液里分离出来的卵巢组织中的卵泡膜细胞特异性表达的CYP17A1呈现阳性；免疫荧光法检测发现，分离出来的细胞97.9±3.6％表达CYP17A1，未检测到颗粒细胞特异性标志物FSHR的表达；实时定量荧光PCR法分析发现，分离出来的细胞中可检测到CYP17A1 mRNA；通过化学发光法分析发现，分离出来的细胞的培养基中可检测到雄烯二酮(3.43±5 5
1.76pmol/10细胞)、睾酮(2.50±1.65ng/10细胞)。这说明本发明的方法能够得到纯化度高的卵泡膜细胞，并且能够用于卵巢组织相关研究中，为卵泡膜细胞的来源提供一个新的思路与技术路线，这将为卵泡膜细胞研究的瓶颈带来一个新的突破。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为本发明从卵泡液中分离、收集到的卵巢组织的免疫组化检测；A：免疫组化染色检测卵泡膜细胞标志物—雄激素合成关键酶CYP17A1呈阳性，B：免疫组化染色采用正常兔IgG作为阴性对照；

[0023] 图2为本发明显微镜白光下观察到的体外培养已贴壁生长的卵泡膜细胞；

[0024] 图3为本发明分离的卵泡膜细胞免疫荧光检测结果；免疫荧光法分别检测卵泡膜细胞标志物CYP17A1、颗粒细胞标志物FSHR(卵泡刺激素受体)，阴性对照采用PBS；标尺长度100μm；

[0025] 图4为本发明通过实施定量荧光PCR法分析发现，分离出来的细胞中可检测到CYP17A1 mRNA(3个复孔)，参考基因为GAPDH(2个复孔)。

具体实施方式

[0026] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0027] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0028] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0029] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0030] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0031] 实施例1

[0032] (1)分离卵巢组织，初步过滤去除颗粒细胞

[0033] 取卵日用无菌容器收集废弃卵泡液，静置30min以上。

[0034] 吸取卵泡液底层的沉淀物，置于50mL无菌离心管内，500g离心5min，弃上清，离心管内加入适量PBS，吸管吹打形成混悬液。

[0035] 将灭菌100μm细胞筛置于6cm培养皿中，吸管分次吸取混悬液到细胞筛中，最后吸取PBS液反复吹洗细胞筛中的卵巢组织，目的在于初步过滤去除颗粒细胞、颗粒细胞团块。

[0036] (2)分离卵巢细胞

[0037] 用眼科镊子将细胞筛上的卵巢组织转移至15mL的无菌离心管内，加入提前配好的含5mg/mLⅠ型胶原蛋白酶的PBS，卵巢组织与含Ⅰ型胶原蛋白酶的PBS的体积比为1：10，在37℃下消化90min。

[0038] 每15min吹打含卵巢组织、Ⅰ型胶原蛋白酶的PBS溶液促进消化。吹打后静置1min，吸管吸取上层细胞悬液并转移至新的15mL无菌离心管内。往含未消化的卵巢组织的离心管中加入含5mg/mLⅠ型胶原蛋白酶的PBS。

[0039] 细胞悬液500g离心5min，弃上清，加入PBS重悬细胞，并重复两次。

[0040] 将灭菌40μm细胞筛置于6cm培养皿中细胞悬液，用吸管吸取细胞悬液到细胞筛中，吸取过筛后的细胞悬液，并置于新的15mL无菌离心管里，500g离心5min，弃上清，收集卵巢细胞。

[0041] (3)进一步纯化卵泡膜细胞

[0042] 卵巢细胞用10％Percoll液(200μL 100％Percoll+1800μL PBS)重新悬浮，100g离心30秒，收集下1/4层沉淀细胞重悬于PBS液，上层液体转移到新的离心管，吹打后，100g离心30秒，丢弃上层液体，收集下1/4层沉淀细胞重悬于PBS液。两次的沉淀细胞用PBS清洗两次后，用PBS重新悬浮，进行进一步的鉴定及培养。

[0043] (4)卵泡膜细胞培养

[0044] 往沉淀中加入含有10％胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液，用细胞计数板计数，根据实验所需要调整细胞密度，将细胞播种在未预包被的培养皿上，在37℃，含5％CO2加湿培养箱中培养。培养的第一个24h后换液，去除未贴壁的细胞。此后每24h换液一次。

[0045] (5)卵泡膜细胞鉴定

[0046] ①将分离出来的卵巢组织进行脱水、石蜡包埋、切片处理后,用免疫组化法检测卵泡膜细胞特异性标志物—雄激素合成关键酶CYP17A1。参考文献Harpelunde Poulsen K et al.Dysregulation of FGFR signalling by a selective inhibitor reduces germ cell survival in human fetal gonads of both sexes and alters the somatic niche in fetal testes.Hum Reprod 34:2228‑2243(2019)。

[0047] 如图1所示，通过免疫组化分析发现，本发明中从取卵手术过程获得的卵泡液里分离出来的卵巢组织中卵泡膜细胞特异型表达的CYP17A1呈现阳性。

[0048] ②卵泡膜细胞以1×105/ml密度铺种在无菌盖玻片上并置于24孔培养皿中，加入含有10％胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1ml,在37℃，含5％CO2加湿培养箱中培养48小时，采用免疫荧光法检测卵泡膜细胞标志物CYP17A1、颗粒细胞标志物FSHR(卵泡刺激素受体)的表达,参考文献Xu D et al.SIRT2 plays a novel role on progesterone,estradiol and testosterone synthesis via PPARs/LXRa pathways in bovine ovarian granular cells.J Steroid Biochem Mol Biol 185:27‑
38(2019)。

[0049] 如图2所示，显微镜白光下观察到的体外培养的卵泡膜细胞；如图3所示，通过免疫荧光法检测发现，分离出来的细胞97.9±3.6％表达CYP17A1，未检测到颗粒细胞特异性标志物FSHR的表达。标尺长度100μm。

[0050] ③卵泡膜细胞体外培养48小时后，更换成无血清培养液(含有100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液)，继续培养24h后用，采用GeneJET RNA Purification Kit(Thermo Fisher Scientific,USA)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific,USA)、Taqman Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific,USA)试剂盒进行实时定量荧光PCR实验，检测细胞中CYP17A1的表达，分别采用免疫化学发光法试剂盒Testosterone Parameter Assay Kit(R&D Systems,USA)和Androstenedione assay kit(Siemens Healthcare Diagnostics Products Limited,UK)检测培养液中睾酮、雄烯二酮水平。

[0051] 如图4所示，通过实施定量荧光PCR法分析发现，分离出来的细胞中可检测到CYP17A1 mRNA。通过化学发光法分析发现，分离出来测细胞的培养基中可检测到雄烯二酮5 5
(3.43±1.76pmol/10细胞)、睾酮(2.50±1.65ng/10细胞)。

[0052] 本发明从取卵过程获得的卵泡液里提取卵泡膜细胞的主要难点在于卵泡膜细胞中混杂着不少的颗粒细胞，两种细胞的大小、质量比较接近。本发明(1)使用100μm细胞筛过滤去除大部分颗粒细胞、颗粒细胞团，(2)使用梯度密度离心液，低速短时离心，收集下沉较快的卵泡膜细胞，(3)采用没有预包被的培养皿进行细胞培养，(4)原代培养的第24小时换液，去除贴壁生长较慢的颗粒细胞，达到纯化卵泡膜细胞的目的。本发明从取卵手术中废弃的卵泡液里提取卵泡膜细胞，极大扩展了卵泡膜细胞的来源，使卵泡膜细胞的相关研究瓶颈得到突破。

[0053] 本发明在现有技术的基础上简化了组织消化、细胞培养的条件，减少了配液的步骤，提高了卵泡膜细胞分离、培养的效率，节约了实验成本，达到良好的细胞培养效果(如图2所示)：(1)简化了消化酶的成分，现有的技术使用胶原蛋白酶I，胶原蛋白酶IA及脱氧核糖核酸酶等3种消化酶消化卵泡膜组织，本发明仅使用Ⅰ型胶原蛋白酶消化卵巢组织，达到了良好的消化效果；(2)简化了培养基的成分，现有的技术卵泡膜细胞培养基有8种成分(胎牛血清、马血清、UlroSer G(血清替代物)、胰岛素、硒、维生素E、抗生素、DMEM/F12培养基)，本发明采用的培养基仅含胎牛血清、抗生素及DMEM/F12培养基，卵泡膜细胞贴壁生长良好，仍保持分泌雄激素的功能；(3)既往研究采用纤连蛋白预包被的培养皿进行卵泡膜细胞培养，本发明采用未预包被的培养皿，达到良好的细胞培养效果，并进一步有效去除贴壁较慢的颗粒细胞。

[0054] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。